Material vegetal

Los frutos de E. oleracea (Eo), O. bataua (Ob) y O. mapora (Om) fueron recolectados en la localidad de El Paraíso, carretera Simón Bolívar, municipio de Buenaventura, Valle del Cauca, Colombia. Los frutos maduros fueron seleccionados, lavados y desinfectados en una solución de hipoclorito de sodio a 200 ppm. Posteriormente se separó la semilla de la parte comestible del fruto (endocarpio y exocarpio). Las partes comestibles de los frutos se secaron por liofilización en un equipo Labconco FreeZone durante 24 h. Después de la liofilización, el material fue desengrasado en un equipo Soxhlet utilizando hexano como solvente. El material desengrasado se usó como materia prima para los procesos de extracción.

Reactivos

Los siguientes reactivos se emplearon en el proceso de extracción: etanol al 96 % (concentración aproximada, v/v) obtenido a partir de la Industria de Licores del Valle, ácido acético glacial y ácido cítrico (Fisher Chemical, USA). Para la caracterización de los extractos se usaron: carbonato de sodio anhidro (Fisher Chemical, USA); 2,2 - difenil - 1 - picrilhidrazilo, DPPH; ácido gálico; reactivo de Folin - Ciocalteu; Trolox (6 - hidroxi - 2,5,7,8 - tetrametilcroman - 2 - ácido carboxílico) (Sigma - Aldrich, Alemania).

Extracción preliminar

Se realizó un proceso inicial utilizando los frutos de Eo para establecer las mejores condiciones de extracción en cuanto a la concentración de etanol y ácido acético. Los extractos fueron obtenidos de la siguiente forma: 100 mg de muestra seca y molida fueron introducidos en microtubos (2 mL) junto con 1 mL de disolvente hidroalcohólico. Las muestras fueron primero homogenizadas por agitación en vórtex y luego sometidas a extracción asistida por ultrasonido (EAU) durante 10 min a temperatura ambiente en un baño ultrasonido (Branson Ultrasonic Cleaner 2510, USA), con una frecuencia fija de 42 kHz. Después de la extracción, los extractos fueron centrifugados a 7500 rpm durante 15 min. Los sobrenadantes fueron separados y filtrados a través de membranas de PVDF de 0.45 µm. Finalmente, los extractos fueron concentrados por rotaevaporación y luego liofilizados. Los extractos secos fueron almacenados bajo refrigeración hasta su análisis.

Optimización del proceso de extracción

Se empleó un diseño central compuesto (DCC) acoplado a la metodología de superficie de respuesta (MSR) para optimizar las condiciones de extracción. Las variables independientes optimizadas fueron la concentración de etanol (%EtOH) y la concentración de ácido acético (%AcOH). Un total de 13 tratamientos (2k + 2k + C₀) con 5 réplicas en el punto central (PC) fueron consideradas para llevar a cabo el proceso de optimización (Tabla 1). Para ello, un modelo de segundo orden fue utilizado en la construcción de las superficies de respuesta, el cual es descrito por la siguiente ecuación:

donde es la variable de respuesta, y son las variables independientes y y son los coeficientes de regresión: intercepto, lineal, cuadrático e interacción, respectivamente.

Tabla 1 Datos experimentales y valores de respuesta con diferentes concentraciones de EtOH (X1, %) y AcOH (X2, %) usados en el DCC 

¹ Resultados expresados en mg EAG/g ES; ² Resultados expresados en mg C3G/g ES.

Los datos obtenidos fueron analizados a través de un análisis de varianza (ANOVA) con un nivel de significancia menor o igual al 5 % (valor - p ≤ 0.05). La idoneidad del modelo de segundo orden utilizado se determinó al evaluar el coeficiente de regresión (R2), el valor - p y la falta de ajuste. El análisis de los datos se hizo a través del software MATLAB R2021a y Microsoft Excel.

Purificación de extractos

Utilizando las concentraciones de etanol y ácido acético seleccionadas en el proceso de optimización, se realizó un nuevo proceso de extracción utilizando como materia prima los frutos de Eo, Ob y Om. Para esto, 100 mg de materia prima de se extrajeron exhaustivamente (1 mL x 4) para obtener los extractos Eo1, Ob1 y Om1, respectivamente. Los extractos se fraccionaron mediante cromatografía de columna empleando Diaion HP-20 (Supelco) como fase estacionaria. La columna (8 cm de altura x 1.5 cm de diámetro) se activó con metanol. La elución se realizó primero con agua acidulada y luego con metanol para obtener dos fracciones por extracto (fracciones 1.1 y 1.2 respectivamente). Las fracciones metanólicas (1.2) fueron secadas por rotaevaporación y almacenadas bajo refrigeración hasta su utilización en los análisis.

Análisis espectrofotométrico

La estimación del contenido total de fenoles (CTF) se realizó de acuerdo con la metodología reportada por ^{Grisales-Mejía et al. (2022)}. Los resultados se expresaron como miligramos equivalentes de ácido gálico por gramo de extracto seco (mg EAG/g ES).

La estimación del contenido de antocianinas monoméricas (CAM) se realizó mediante el método de pH diferencial (^{Pereira et al., 2019}), con algunas modificaciones para la adaptación a formato de microplacas. Brevemente, las disoluciones de trabajo (20 µL) fueron mezcladas con ambas disoluciones buffer (200 µL). La microplaca se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos en la oscuridad y después se leyó la absorbancia en lector de microplacas (Biotek Lx800, USA), primero a 515 nm y luego 700 nm. La concentración de antocianinas (CA) en la disoluciones de trabajo se calculó considerando la absortividad molar (ε) y la masa molecular (M) de cianidina-3-O-glucósido (C3G), la principal antocianina encontrada en especies de Arecaceae (^{da Silveira et al., 2019a}) de acuerdo con la siguiente ecuación:

donde A = [(A₅₁₅ - A₇₀₀)pH 1 - (A₅₁₅ - A₇₀₀)_{pH 1} - (A₅₁₅ - A₇₀₀)pH 4,5], es la absorbancia de la disolución de trabajo; M = masa molar de C3G (449.2 g/mol); 1000 = factor de conversión de gramos a miligramos, ε = coeficiente de extinción molar de C3G (26 900 L x mol^-1 x cm^-1) y l = factor de corrección óptica (1.25 cm).

Los resultados del CAM se expresaron como miligramos de cianidina-3-O-glucólido por gramo de extracto seco (mg C3G/g ES), de acuerdo con la siguiente ecuación:

CAM (mg C3G/g ES) = (CA x FD x V)/w donde CAM = concentración de antocianinas monoméricas en la disolución de trabajo; FD = factor de dilución; V = volumen de la disolución patrón (L), y w = masa del extracto seco (g).

La capacidad antioxidante de los extractos se midió en términos de la capacidad de captura de radicales DPPH (CCR-DPPH) de acuerdo con el procedimiento descrito por ^{Grisales-Mejía et al., (2022)}. Los resultados se expresaron como micromoles equivalentes de Trolox por gramo de extracto seco (µmol ET/g ES).

Análisis estadístico

Los resultados fueron analizados estadísticamente mediante la comparación de medias utilizando la prueba de Tukey. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) con nivel de significancia de 0.05 utilizando el software Minitab 18. Todas las extracciones se realizaron por triplicado y se expresaron por su media ± desviación estándar.

Optimización del proceso de extracción

Se realizó un proceso de optimización de las condiciones de extracción (concentración de EtOH y AcOH) utilizando DCC. Los resultados de los experimentos del DCC se muestran en la Tabla 1. Por otro lado, los resultados del ANOVA para el CTF se muestran en la Tabla 2. Y a su vez, los resultados del análisis mediante metodología de superficie de respuesta para el CTF y el CAM, se muestran en las Figuras 1 y 2, respectivamente.

Figura 1 Gráfico de superficie de respuesta para la extracción de compuestos fenólicos a partir de frutos de E. oleracea, variando la concentración de AcOH y EtOH. 

Figura 2 Gráfico de superficie de respuesta para la extracción de antocianinas a partir de frutos de E. oleracea, variando la concentración de AcOH y EtOH. 

Tabla 2 Análisis de varianza del contenido total de fenoles (CTF) en extractos a partir de frutos de E. oleracea 

Estimación de la capacidad antioxidante de los extractos purificados

Bajo las condiciones establecidas en el proceso de optimización se prepararon extractos a partir de los frutos de Eo, Ob y Om. Los extractos obtenidos se sometieron a purificación mediante cromatografía de columna empleando la resina Diaion HP-20 como fase estacionaria, con el propósito de obtener fracciones más ricas en compuestos fenólicos. En la Figura 3 se presentan los valores de CTF, CAM y CA obtenidos para los extractos Eo1, Ob1 y Om1, así como para las fracciones purificadas Eo1.2, Ob1.2 y Om1.2 de E. oleracea, O. bataua y O. mapora, respectivamente. Las fracciones correspondientes a Eo1.1, Ob1.1 y Om1.1 no mostraron valores significativos de CTF, CAM y CA, por tal razón no se reportan esos datos.

Optimización del proceso de extracción

Como se aprecia en la Tabla 1, el CTF osciló entre 1.58 a 146.11 mg GAE/g ES. El menor valor (1.58 mg GAE/g ES) se encontró al utilizar 100 % de EtOH y 0.5 % de AcOH, mientras que la cantidad máxima de fenoles totales obtenida en el DCC se logró con 65 % de EtOH y 0.5 % de AcOH. Ahora bien, en la superficie de respuesta (Figura 2) se puede observar cómo el aumento del EtOH por encima del 60 % reduce la cantidad de fenoles extraídos. ^{Pompeu et al. (2009)} as measured by the Oxygen Radical Absorbance Capacity. They are particularly rich in total phenolics (TP realizaron extracciones a diferentes concentraciones de EtOH en E. oleraceae, y encontraron un incremento en el CTF hasta aproximadamente 70 % de EtOH. Por su parte, la investigación de ^{da Silveira et al. (2017)}, que extrajeron compuestos fenólicos de E. oleraceae, también registró este mismo comportamiento. La razón de lo anterior se debe a que el incremento en el porcentaje de etanol puede afectar la polaridad de la solución al disminuir su constante dieléctrica, y como consecuencia, incidir en los fenómenos de transferencia de masa, lo cual puede ser negativo a altos porcentajes (^{Pompeu et al., 2009})as measured by the Oxygen Radical Absorbance Capacity. They are particularly rich in total phenolics (TP. En la actualidad ya existe un antecedente en la extracción de compuestos fenólicos de E. oleracea con origen en el Pacífico colombiano. Sin embargo, si bien en dicha investigación se extrajeron los compuestos de interés a través de baño ultrasónico, los autores ^{Garzón et al. (2017)} anthocyanin (ACN utilizaron metanol y una mezcla de metanol agua (80:20 v/v) como solventes de extracción; como resultado final obtuvieron 47.86 mg GAE/g MS (MS: Muestra Seca), los cuales fueron asociados con algunas familias de compuestos fenólicos, como lo son los ácidos hidroxicinámicos, hidroxibenzóicos y flavonoides, según los perfiles cromatográficos obtenidos.

Los datos de la Tabla 2 permiten establecer que el efecto lineal y cuadrático de la concentración de EtOH presenta una influencia significativa (valor - p < 0.05) sobre el CTF. Por su parte, para el %AcOH, en estos mismos términos (lineal y cuadrático) y para la interacción entre el %EtOH y el %AcOH, no se generan diferencias significativas (valor - p > 0.05). Sin embargo, a diferencia de lo ocurrido en el rendimiento de extracción, el valor - p obtenido para la falta de ajuste (0.106) fue mayor al nivel de significancia (0.05), lo que indica que el modelo usado () describe correctamente la relación entre los factores de operación y el contenido total de fenoles.

Respecto al CAM, los resultados de la Tabla 1 indican que la cantidad de antocianinas extraídas se asocia directamente con el contenido total de fenoles; el mayor rendimiento en antocianinas se obtiene con una concentración del 65 % de EtOH y 0.5 % de AcOH. La concentración de EtOH influyó significativamente en los resultados obtenidos, mientras que la concentración de AcOH no, lo cual está en concordancia con lo encontrado por ^{Aliaño-González et al. (2020)}. Sin embargo, no se pudo obtener un modelo ajustado a pesar de eliminar los términos de interacción (A*B) y el término cuadrático para la concentración de AcOH (B*B); el R² fue de 0.8475 y el valor - p de la falta de ajuste fue de 0.001. No obstante, se utilizó el gráfico de superficie de respuesta para describir cualitativamente los efectos que generan las variables independientes (Figura 3).

Figura 3 Contenido total de fenoles (CTF), contenido de antocianinas monoméricas (CAM) y capacidad antioxidante (CA) de extractos y fracciones obtenidas a partir de E. oleracea (Eo), O. bataua (Ob) y O. mapora (Om). 

A partir de los análisis estadísticos realizados, las condiciones óptimas de extracción se establecieron como: 0.5 % de AcOH y 65 % de EtOH; estas condiciones fueron utilizadas para replicar el proceso de extracción utilizando los frutos de O. bataua y O. mapora.

Análisis de los extractos purificados.

De acuerdo con los resultados, la resina utilizada para el proceso de fraccionamiento y purificación, Diaion HP-20, mostró ser muy efectiva en la purificación de los extractos, logrando en algunos casos hasta triplicar el valor obtenido por el extracto crudo (Figura 3). El extracto metanólico de O. mapora (Om1.2) es el que presenta los mejores valores de CTF (448 mg EAG/g ES), CAM (6898 µg C3G/g ES) y CA (3757 µmoles ET/g ES). La proporcionalidad entre los valores del contenido de fenoles y la capacidad antioxidante, sugiere que esta última se debe principalmente a la presencia de los compuestos fenólicos, y en especial, a las antocianinas. En este estudio, los extractos de E. oleracea tienen mejor comportamiento en cuanto al CTF, CAM y CA que los de O. bataua; resultados similares fueron reportados por ^{Rezaire et al. (2014)}. Las fracciones acuosas correspondientes (fracciones 1.1) no presentaron valores significativos de CTF, CAM y CA; estas fracciones fueron obtenidas empleando agua como eluente y, por tal razón, son fracciones con altos contenidos de compuestos hidrosolubles tales como aminoácidos y azúcares, los cuales generalmente están presentes en los frutos.