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INTRODUCCIÓN
El empleo de antibióticos a partir de la década de 1940, con el propósito de aumentar la producción ganadera y avícola, ha influido en el desarrollo de resistencias. En 1951 la FDA (United States Food and Drug Administration) aprobó el uso de antibióticos en alimentos para animales sin necesidad de prescripción veterinaria 1.
En el ámbito de la producción, se utilizan antimicrobianos para el tratamiento de las infecciones en animales de forma individual o colectiva. Los tratamientos pueden ser profilácticos, metafiláctico y/o terapéuticos según las necesidades. Adicionalmente, en las producciones intensivas de bovinos, cerdos, aves y en acuicultura, se emplean bajas dosis de antimicrobianos como agentes promotores del crecimiento con el fin de acelerar su crecimiento y con ello el rendimiento de la producción 2. Algunos de los antibióticos utilizados en la producción ganadera son de importancia para la salud humana, entre ellos se destacan los macrólidos, tetraciclinas, fluoroquinolonas y cefalosporinas. El uso sin control y/o prescripción veterinaria ha generado graves consecuencias; la administración de dosis sub-terapéuticas durante largo tiempo crea las condiciones necesarias para desarrollar resistencia a antimicrobianos en bacterias comensales y zoonóticas 1.
Desde hace varias décadas, se ha demostrado que las adiciones de zinc y cobre inorgánico en el alimento mejoran el crecimiento de lechones post-destete2. La industria global porcina utiliza, en combinación o individualmente, altas concentraciones de óxido de Zn (2.000 a 3.000 ppm Zn) y/o sulfato de Cu (125 a 250 ppm Cu) 3,4. Gran parte de estos oligoelementos ingeridos por las diversas especies domésticas (hasta el 99 %) no es retenida y aparece en heces y orina 5. La emisión de elementos traza al medio ambiente aumenta la polución, especialmente en el caso del Cu y del Zn, un problema que puede reducirse mediante la inclusión juiciosa de los minerales en la dieta.
La resistencia a los antimicrobianos y metales pesados (MP), es la clave para la supervivencia bacteriana en ambientes contaminados. Muchos genes de resistencia a antibióticos y MP están ubicados en los mismos elementos genéticos móviles 2. Dentro de las bacterias prevalentes en estos ambientes perturbados, el género Enterococcus es uno de los más estudiados y representativos. Su extrema ubicuidad le permite habitar distintos nichos ecológicos, incluido el contenido intestinal del hombre y animales; también pueden ser aislados del suelo, agua, plantas e insectos 6.
Este género constituye en la actualidad un grave problema de salud pública debido al desarrollo de resistencia a antimicrobianos y factores de virulencia, donde se destacan la actividad gelatinasa, hemolítica y formación de sustancias de agregación. Estos microorganismos exhiben una alta prevalencia dentro de los ambientes hospitalarios y presentan, cada vez con mayor frecuencia, problemas terapéuticos 7. Exceptuando el ambiente relacionado con la salud, existe escasa información en la región patagónica sobre las características y distribución geográfica de las cepas de enterococos 8,9. Tampoco existen estudios sobre la vía de transmisión de estos microorganismos, resultando necesario una continua vigilancia para conocer si la transmisión ocurre vía cadena alimentaria o se genera en el medio ambiente por actividades antrópicas. En consecuencia, resulta perentorio conocer el estado actual de este problema para contar en el futuro con la posibilidad de realizar estudios retrospectivos que permitan afirmar o rechazar la hipótesis de una eventual transferencia.
El objetivo de este trabajo fue determinar la resistencia a MP (cobre y zinc) en cepas del género Enterococcus aisladas de cerdos de criadero del Valle Inferior del Río Chubut (VIRCh) y su relación con la resistencia a antimicrobianos de uso habitual en la producción animal.
MATERIALES Y MÉTODOS
Área geográfica y toma de muestras. La toma de muestras del estudio se llevó a cabo en dos establecimientos porcinos de cría intensiva y ciclo completo localizados en las ciudades de Dolavon y Rawson, ubicadas en el Valle inferior del Río Chubut (VIRCh) provincia de Chubut - Argentina, durante los meses de febrero a abril de 2015. El muestreo se realizó de forma aleatoria a partir de animales sanos, incluyendo adultos y crías de destete en el establecimiento de la ciudad de Rawson, mientras que en el establecimiento de Dolavon todas las muestras provinieron de cerdas en gestación. Las muestras de hisopados fecales se conservaron en medio de transporte Stuart (Merck, Alemania) a 4°C hasta el momento de su procesamiento. El tiempo transcurrido entre la colecta y su procesamiento no fue mayor de 6 h.
Aislamiento, selección e identificación preliminar de cepas de enterococos. Las muestras se sembraron en caldo púrpura de bromocresol-azida (Merck, Alemania) y/o en caldo etil violeta azida (Difco, Estados Unidos). Luego de 24 h de incubación a 37°C los cultivos se repicaron en agar bilis esculina (Merck, Alemania), suplementado con ácido nalidíxico (20 µg/ml) y nistatina (10 µg/ml). Todas las muestras se incubaron a 37°C durante 24-48 h y se realizaron repiques sucesivos en agar bilis esculina con el objetivo de obtener aislamientos puros.
Posteriormente, la identificación de las colonias sospechosas se realizó mediante la coloración de Gram, ensayo de la actividad catalasa y oxidasa, crecimiento a 45°C y 10°C y actividad de pirrolidonil aminopeptidasa (Pyr-A-Enterococos, Britania, Argentina).
Los aislamientos identificados como Enterococcus spp. se conservaron a -30°C en una suspensión de caldo tripticasa soja (TS) (Britania, Argentina) suplementado con glicerol al 10% (v/v) y forman parte de la colección del Cepario del Laboratorio de Biotecnología Bacteriana FCNyCS (Sede Trelew-UNPSJB).
Determinación de factores de virulencia
Actividad de la gelatinasa. Se realizó en agar TS suplementado con 0.8% (m/v) de gelatina. Las placas se incubaron durante 48 h a 37°C y se revelaron con una solución de ácido tricloroacético al 20% (v/v). Las zonas claras alrededor de las cepas se consideraron como positivas.
Actividad hemolítica. La producción de hemolisinas se evaluó en agar cerebro-corazón (Biokar, Francia) suplementado con sangre desfibrinada humana 5%, luego de una incubación a 37°C durante 48 h. Los resultados se interpretaron como positivos cuando se observó un halo de hemólisis completa alrededor de las colonias (β-hemólisis).
Producción de exopolisacáridos. La producción de exopolisacáridos (EPS) de las cepas de enterococos se evaluó de manera cualitativa en agar cerebro-corazón adicionado con sacarosa 50 g/l y 0.8 g/l de rojo Congo. Las placas se incubaron a 37°C durante 24 h y el resultado se interpretó como positivo cuando se observaron colonias de color negro 10.
Resistencia a cobre y zinc. Los ensayos de susceptibilidad al cobre y zinc se llevaron a cabo por el método de dilución en agar propuesto por Aarestrup y Hasman 11. Para tal fin se utilizó el agar Mueller-Hinton (Britania, Argentina) al cual se le adicionaron concentraciones crecientes entre 2-28 mM de sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4-5H2O) (Cicarelli Laboratorios, Argentina) y entre 0.25-32 mM de sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4-7H2O) (Cicarelli Laboratorios, Argentina). Las soluciones de cobre y zinc se prepararon en agua destilada, se esterilizaron mediante filtración por membrana (0.22 µm) y se almacenaron a 4°C hasta su uso.
Todas las placas se inocularon con 5 µl de cultivos bacterianos ajustados a 0.5 en la escala de McFarland y se incubaron durante 48 h a 37°C. Los resultados se interpretaron como positivos cuando se observó desarrollo de las colonias.
Identificación fenotípica. La identificación fenotípica a nivel de especie de las cepas resistentes a MP se realizó mediante pruebas bioquímicas y fermentación de azúcares, según las recomendaciones de Manero y Blanch 12.
Sensibilidad a antimicrobianos. En todas las cepas que exhibieron resistencia a MP se determinó su concentración inhibitoria mínima (CIM) para ampicilina, tetraciclina y vancomicina mediante el método de las diluciones seriadas, según las recomendaciones del National Committee for Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI)-VET 13, mientras que para teicoplanina se utilizaron las recomendaciones del CLSI para antimicrobianos de uso humano 14. La sensibilidad a los antimicrobianos se evaluó por el método de dilución en agar Mueller-Hinton, las placas se incubaron durante 20-24 h a 37°C y se utilizó la cepa de Enterococcus faecalis ATCC 29212 como microorganismo de control. La CIM se definió como la menor concentración de antibiótico que produce la inhibición completa del microorganismo.
Detección de genes de resistencia a tetraciclina. Las cepas seleccionadas sobre la base de su resistencia a tetraciclina se incubaron a 37°C en caldo TS, durante 16 h. Luego, los cultivos se centrifugaron a 12,000 g durante 5 min y el ADN se extrajo utilizando un equipo comercial de purificación Wizard Genomics Promega (Madison, Wisconsin, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante.
La amplificación del gen tetM se realizó de acuerdo al protocolo sugerido por Aarestrup et al 15. La reacción se llevó a cabo en un termociclador Mastercycler® (Eppendorf, Hamburgo, Alemania). La electroforesis de los productos de la amplificación genética se realizó en gel de agarosa al 1.5%, a 70 V durante 1 h en buffer TAE (tris, ácido acético, EDTA, pH 8). Luego de finalizada la corrida, el gel se colocó durante 20 min en una solución de buffer TAE y bromuro de etidio de 0.5 µg/ml; posteriormente se visualizó con luz UV en un transiluminador Labsystem® (Geno Technology Inc., EE. UU.), se fotografió y se archivó.
RESULTADOS
Se procesaron 50 muestras de materia fecal proveniente de ganado porcino de un establecimiento de la ciudad de Rawson y 44 muestras de otro localizado en la ciudad de Dolavon, ambos ubicados en la zona del VIRCh (Chubut-Argentina). Del primer establecimiento se aislaron 37 cepas del género Enterococcus (27 de ejemplares adultos y 10 de cría de destete), mientras que del segundo se aislaron 28 cepas de hembras en gestación. Todas las cepas aisladas y conservadas presentaron los rasgos fenotípicos que distinguen al género Enterococccus de otros cocos Gram-positivos: catalasa y oxidasa negativo, crecimiento a 10 y 45°C y Pirrolidonil-beta-naftilamina positivo.
La mayor prevalencia de los factores de virulencia estudiados correspondió a la producción de EPS, detectada en 45 cepas, mientras que una cepa exhibió actividad de gelatinasa y sólo otra resultó β-hemolítica. La actividad hemolítica como gelatinasa se presentó en cepas de E. faecalis y E. faecium respectivamente, mientras que la producción de EPS se encontró extendida en las diferentes especies aisladas (datos no mostrados).
Mediante la técnica de dilución en agar, 25 cepas resultaron resistentes a zinc (≥12 mM), que fueron seleccionadas para su posterior identificación fenotípica y resistencia a antimicrobianos (Tabla 1); mientras que 64 presentaron un patrón de resistencia intermedio al cobre (4-12 mM) (datos no mostrados). Para la determinación de cepas resistentes y/o tolerantes a estos metales se tomó como referencia los puntos de corte propuestos por Aarestrup y Hasman 11 y Hasman et al 4, respectivamente.
Tabla 1 Resistencia a cobre y zinc en cepas de Enterococcus spp. aisladas de cerdos
a Puntos de corte según Hasman et al 4; a ≤2: sensible, 4-24: intermedio, ≥28: resistente
b Punto de corte según Aarestrup y Hasman 11; b ≤4: sensible; ≥12: resistente
Todas las cepas que resultaron resistentes a zinc se identificaron mediante la clave dicotómica propuesta por Manero y Blanch 12, un esquema de reacciones bioquímicas que permite la clasificación de los miembros del género Enterococcus a nivel de especie. Del total de cepas, 18 se clasificaron como E. faecium, 4 como E. columbae, 2 como E. faecalis y 1 como E. durans/hirae (Tabla 1).
Las 25 cepas seleccionadas según su resistencia a Zinc resultaron además resistentes a la tetraciclina mediante la evaluación en agar. Sólo dos cepas de E. faecium resultaron resistentes a vancomicina, exhibiendo una CIM de 8 y 32 µg/ mL, mientras que solo una de estas cepas presentó resistencia a teicoplanina. Todas las cepas de enterococos resultaron sensibles a ampicilina (Tabla 2). Del total de microorganismos resistentes a zinc, 23 resultaron productores de EPS, una cepa de E. faecalis presentó actividad de gelatinasa, mientras que solo un aislado de E. faecium resultó hemolítica.
Tabla 2 Resistencia a antimicrobianos en cepas de Enterococcus spp. aisladas de cerdos
a Puntos de corte según CLSI-VET 13; b Punto de corte según CLSI 14; 1 ≤8: sensible, ≥16: resistente; 2 ≤8: sensible, 16: intermedio, ≥32: resistente;
b≤4: sensible, 8: intermedio, ≥16: resistente; 4 ≤4: sensible, 8-16: intermedio, ≥32: resistente.
Del total de cepas seleccionadas, 21 presentaron un amplicón de 657 pb compatible con el gen de resistencia a tetraciclina tetM, mientras que en 4 cepas de E. faecium no se obtuvo amplificación (datos no mostrados).
DISCUSIÓN
Históricamente la producción porcina en la provincia del Chubut fue de baja escala, de tipo familiar, en zonas bajo riego y destinada básicamente a la producción de lechones estacionales, elegida como secundaria a otras actividades agropecuarias. Sin embargo, desde hace un tiempo se observa un crecimiento de la actividad porcina en toda la provincia, especialmente en la zona del VIRCh. La mayor parte de los establecimientos del valle se caracterizan por ser una explotación de tipo familiar, destinada al consumo propio y local. En las ciudades de Rawson y Dolavon, pertenecientes a la mencionada zona, existen dos establecimientos productores de gran escala empresarial, de ciclo completo quienes han integrado a su producción intensiva un sistema eficiente, incorporando genética, faenando de manera formal y realizando su propia comercialización.
Los 65 aislamientos obtenidos de Enterococcus spp., a partir de 94 muestras de materia fecal provenientes de los establecimientos porcinos, demuestran la alta frecuencia de este género en este nicho. Los enterococos y las enterobacterias son microorganismos comensales que se utilizan con frecuencia como indicadores biológicos en programas de vigilancia y seguimiento, porque proporcionan información sobre el posible reservorio de genes de resistencia a los agentes antimicrobianos, que podrían transferirse a bacterias patógenas 16.
Los resultados obtenidos sobre frecuencia de actividad gelatinasa y hemolítica fueron inferiores si los comparamos con el estudio realizado por Ledesma et al 9 en cepas de Enterococcus spp. aisladas de aves salvajes y de cría de la región patagónica. Sin embargo, los enterococos son reconocidos por su plasticidad genómica, son capaces de integrar elementos móviles como plásmidos, transposones y secuencias de inserción que les permite adquirir fácilmente determinantes genéticos entre cepas de la misma especie o especies del mismo género. Además, ciertos factores de virulencia y la resistencia a antimicrobianos (RAM) son conocidos por estar asociados con plásmidos altamente transmisibles 17.
La producción de EPS está relacionada con la capacidad de formar biofilm y la posibilidad de colonizar superficies inertes utilizadas habitualmente en clínica 18. Según los resultados obtenidos en este estudio y en trabajos previos 10,19, este rasgo está ampliamente distribuido y es independiente de la especie. Sin embargo, sería prematuro clasificar a una cepa de enterococo como patógena sólo evaluando este rasgo. En el futuro se debería estudiar otros factores de patogenicidad relacionados con la producción de EPS, como la sustancia de agregación, cuya presencia incrementa considerablemente la adherencia a los túbulos renales, a células intestinales e internalización enterocóccica en los macrófagos 18.
Del total de microorganismos aislados, 25 cepas presentaron resistencia a zinc (≥12 mM) y patrones intermedios a cobre (4-12 mM). Estos resultados son similares a los obtenidos por Nezhad Fard et al 2 y Aarestrup y Hasman 11, quienes relacionan ambas resistencias con elementos genéticos móviles. Tanto el cobre como el zinc son ampliamente utilizados como promotores del crecimiento en la cría intensiva de cerdos en diferentes concentraciones 4. En consecuencia, como una respuesta natural, muchas especies bacterianas han desarrollado mecanismos de resistencia para sobrevivir en presencia de estos MP. Estudios previos han reportado que la resistencia a zinc y a antibióticos están vinculados en los mismos elementos genéticos móviles 20, contribuyendo de esta manera a la diseminación de resistencia a MP en especies bacterianas de origen animal debido a la presión selectiva impuesta por el uso de antibióticos y viceversa.
El uso de agentes antimicrobianos como promotores del crecimiento fue prohibido en todos los países de la Unión Europea (UE) en el año 2006, sin embargo todavía se los utiliza para el tratamiento en animales 6. En particular, la tetraciclina se utiliza para el tratamiento de enfermedades en cerdos, práctica que induce la proliferación de resistencia 21. En la actualidad las tetraciclinas no se utilizan con frecuencia para el tratamiento de infecciones humanas, sin embargo su uso inadecuado puede ejercer una presión selectiva sobre los enterococos generando resistencia a otros antimicrobianos (vancomicina y gentamicina) 6.
En nuestro país, en el año 2010 se realizó el primer estudio sobre los patrones de resistencia a antimicrobianos en bacterias indicadoras y zoonóticas provenientes de muestras fecales de animales sanos. En el caso particular de los porcinos se encontró que, de 43 aislamientos de Enterococcus spp. el 92.8 % resultó resistente a tetraciclina, mientras que no se detectó resistencia a ampicilina 22. No obstante a la iniciativa del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria implementada mediante la resolución 591/2015 23 y dirigida a la concientización y control de RAM en animales destinados al consumo humano, la Argentina no cuenta con un programa de vigilancia permanente en establecimientos agropecuarios.
Además de la resistencia a Zn, las 25 cepas seleccionadas de Enterococcus spp. presentaron resistencia a tetracilina, mientras que dos cepas de E. faecium exhibieron resistencia a vancomicina (≥8 |ig/mL). Estos dos aislamientos, clasificados como E. faecium, deberían en el futuro someterse a estudios genéticos con el propósito de evaluar si la resistencia que presentan es de tipo adquirida y transferible (vanA/vanB) o intrínsica (vanC). Ninguna de las cepas seleccionadas resultó resistente a ampicilina, resultado que tiene un valor predictivo de sensibilidad para amoxicilina, amoxicilina-clavulánico, ampicilina sulbactam y piperacilina-tazobactam en enterococos no productores de betalactamasas 13.
Los resultados obtenidos en el presente trabajo sobre la presencia de genes tetM de resistencia a tetraciclina en cepas de enterococos coincide con otros estudios previos realizados en explotaciones animales 2,24, presentándose como la resistencia más extendida entre las bacterias.
La relación entre animales de consumo y emergencia de RAM en salud humana ha sido documentada claramente en bacterias zoonóticas como Salmonella spp. y Campylobacter spp. 22. Las resistencias han aparecido también en bacterias comensales presentes en el tracto intestinal de los animales, tales como Enterococcus spp. y Escherichia coli, las que pueden ser transmitidas por los alimentos y actuar como reservorios de genes de resistencia, transfiriéndolos a bacterias patógenas o zoonóticas de importancia para la salud pública.
Los resultados obtenidos en este estudio demuestran la incidencia de resistencia a zinc y a tetraciclina en cepas de enterococos de origen porcino. Si bien estas bacterias no son causa frecuente de infecciones en animales, pueden ser reservorios de genes de resistencia y diseminarse a otras bacterias, las que sí pueden causar infecciones en animales y en el hombre.
Teniendo en cuenta la escasa o nula información en nuestro país y especialmente en la zona del VIRCh sobre RAM en bacterias indicadoras y zoonóticas en animales domésticos y de cría, los resultados obtenidos en este estudio podrían considerarse como punto de partida en futuros programas de monitoreo.
