I. NOMENCLATURA
D. bulbifera = Dioscórea bulbifera Salv.
RxSh= Reacción Shinoda
RxL-B= Test de Liebermann y Burchard
II. INTRODUCCIÓN
La papa de aire como se le conoce comúnmente a la D. bulbifera es un bulbo aéreo de la familia Dioscórea similar al ñame común (Dioscórea esculenta). Estos vegetales, característicos de clima caliente húmedo y tropical se encuentra distribuido extensamente en Asia y África. La morfología de las variedades encontradas en América en estado silvestre podría dar indicio de su origen. De acuerdo con los estudios en Estados Unidos, sugieren ser una variedad proveniente de África por su forma angular o subangular1, (2 página 538).
Existen variedades silvestres de algunos ñames en especial del género Dioscorea que tienen a menudo sustancias venenosas, refiriéndose a los glicoalcaloides (2 página 1). Los alimentos poseen sustancias nocivas que pueden generar infecciones e intoxicaciones, pero estas consecuencias están en función de la dosis (3pagina 197). El compuesto esteroidal se torna tóxico cuando las concentraciones son superiores a 5 mg/kg de masa corporal, dosis más pequeñas actúan como inhibidores contra células malignas4 y como bloqueadores para controlar algunos microorganismos por sus propiedades venenosas (2página 538).
Los glicoalcaloides son considerados como metabolitos indicadores de estrés vegetal biótico (5 página 195, 196) de suma importancia en el control de efectos patológicos causados por plagas. La solanina es un glicoalcaloide común de la familia de las Solanácea como la papa común (Solanun Tuberosum), de igual manera, especies de la familia Dioscoreaceae también contienen compuestos de esta naturaleza como la saponina3; naturalmente se encuentra en diversas partes de la planta: hojas, tallos, tubérculos y bulbos, especialmente son mecanismo de defensa instintivo frente a hongos y pesticidas (4 página 196).
Los flavonoides en bulbos del género Dioscórea son importantes para la supervivencia de la planta, puesto que están encargados del transporte de auxinas, inhibición, protección ultravioleta (UV) y la alelopatía frente a factores externos como la radiación5. Los bulbos de D. bulbifera al tener un desarrollo aéreo, son proclives a sintetizar y acumular gran cantidad de metabolitos secundarios, como los flavonoides que se forman en respuesta al estímulo y estrés fisiológico 6. Una ingesta de alimentos rica en flavonoides aumenta la capacidad antioxidante humana y favorece la atenuación de enfermedades inflamatorias y problemas como daño tisular producida por infección de patógenos 7.
Las variedades silvestres como D. bulbifera estudiadas, son más propensas a desarrollar una mayor producción de compuestos polifenólicos como medio defensivo ante agentes externos8. La quercitina es uno de los flavonoles con mayor presencia en frutas y vegetales 9. Sin embargo, en variedades como la D. bulbifera los flavonoides representan el 39,6% y se han encontrado más de 20 tipos de flavonoides, algunos son, 3,5-dimethoxykaempferol, 3,5,30-trimethoxyquercetin, myricetin-3-O-b-D-galactopyranoside, entre otro 10. La creciente evidencia científica ha demostrado que los compuestos polifenólicos, como los flavonoides, que se encuentran en el reino vegetal, tienen propiedades antiinflamatorias y antioxidantes 7. Debido a esto, el interés por detectar la presencia de compuestos de esta naturaleza en los bulbos de D. bulbifera impulsaría el consumo potencial aplicado en áreas alimentarias y de la salud 11.
Los solventes seleccionados comparten unas serie de características, dentro de las cuales es deseable que sean de fácil adquisición, abundancia en un ambiente rural y citadino, de bajo costo y por efecto de la polaridad se designó el alcohol etílico disuelto al 40% adaptado de estudios adelantados en la referencia 12, que modelan un experimental para la extracción de compuestos glicoalcaloides y flavonoides, usando como solvente soluciones ácidas de etanol. El aceite mineral al ser inodoro e incoloro es factible para evidenciar la extracción, existen muchos usos comerciales de estos aceites minerales como aditivos alimentarios. El agua es el solvente universal además que, estudios etnobotánicos en Panamá afirman que culturas rurales preparan alimentos con bulbos del género Dioscórea remojados en agua por 12 horas13. En los últimos años ha aumentado el número de estudios que afirman tener interés por el desarrollo de bioprocesos para la producción o extracción de compuestos bioactivos de fuentes naturales10),(14, dadas las posibles aplicaciones de estos compuestos en la industria alimentaria.
Para la extracción, es necesario hacer lisis de los tejidos vegetales como la pared celular, firme y compleja de penetrar por el solvente, una manera fácil de lograrlo es mediante la maceración. Esta técnica permite que el solvente (fase líquida) penetre en los tejidos de la muestra vegetal (fase sólida) provocando que se ablande y se liberen porciones solubles11),(12.
La finalidad de la investigación es evaluar cuál solvente permite por medio de maceración, separar compuestos de núcleo esteroide y flavonoide de los bulbos para la posterior identificación cualitativa de D. bulbifera cosechados en el piedemonte llanero de Colombia.
III. METODOLOGÍA
A. Características Generales
El estudio se realizo en la zona rural de la ciudad de Villavicencio, Meta a una altitud entre los 410 y 450 msnm en los predios de la Universidad de los Llanos. Se recolectaron muestras de bulbos de D. bulbifera entre los 22 a 25 días después de finalizada la inflorescencia en cuatro puntos geograficos con crecimiento silvestre de acuerdo con la Fig. 1. Para la recoleccion de bulbos se tuvieron en cuenta aspectos como: las condiciones ambientales, el tamaño, la formación y color de bulbos.
B. Tratamiento Previo
Los bulbos recolectados, fueron sometidos a un proceso de limpieza y desinfección por inmersión en agua y aspersión con etanol 70%. Posteriormente se dejaron en exposición al sol por alrededor de 2 horas (solarización). Finalmente se hizo una reducción de tamaño para lograr trozos de 5mm de lado tanto para la pulpa como para la cáscara de los bulbos. Lo anterior permitió realizar la maceración de los bulbos empleando tres solventes: agua, aceite mineral y etanol 40%.
C. Materiales y Métodos
1) Maceración
La TABLA I muestra los reactivos y temperaturas empleados para la maceración de las muestras cortadas de D. bulbifera:
Alcoholato | |
---|---|
1 Kg de bulbos de D. bulbifera | 1 Litro solución de etanol al 40%. |
Hidrolato | |
1 Kg de bulbos de D. bulbifera | 1 Litro de agua destilada a 50°C |
Oleato | |
1 Kg de bulbos de D. bulbifera | 1 Litro de aceite mineral a 51°C. |
Cada uno de los macerados se agitaron mecánicamente por 6 horas, posterior a ello, se trasvasaron a botellas de vidrio de color ámbar aforando a 750 ml de extracto por cada solvente. Luego, bajo penumbra se dejaron almacenadas por un tiempo de 25 días 15. Las condiciones de trabajo fueron constantes a 25°C y humedad relativa del 78%.
2) Detección de núcleos químicos
El extracto obtenido de cada macerado se filtró y se sometió a pruebas de detección visual señaladas en la TABLA II, que identificaron el núcleo esteroidal o flavonoide mediante viraje de color.
Prueba | Positividad | Descripción |
---|---|---|
RxSh (Zn/HCl cc) | Produce una coloración rojiza tenue hasta escarlata | El zinc en polvo reacciona con HCl cc. El hidrogeno generado produce por reducción el ion flavilo de color rojo escarlata. |
RxL-B | Color verde, azul petróleo positiva para esteroides; amarillo naranja; marrón pardo es positiva para triterpenos | El lavado con cloroformo remueve la fracción apolar, luego es alcalinizado con el anhidrido acético, la digestión es con el ácido sulfúrico donde se solubilizan nuevamente formando un complejo coloreado al enfriarse lentamente. |
Según lo expuesto en la práctica de glicósidos, la metodología utilizada de pruebas cualitativas (RxSh y RxL-B) fue ajustada y adaptada del protocolo 15),(16 para cada extracto de D. bulbifera. La solución patrón de Flavonoides para la RxSh fue una dilución al 60% de vino de uva La Bodeguita®, vino tinto dulce. El patrón de alcaloides para la RxL-B fue solución de hidrocortisona 1% con agua destilada. Las muestras para cada prueba se realizaron diluyendo el extracto del macerado 1:1 con el solvente respectivo, ejemplo: 20 ml del alcoholato obtenido con 20 ml de alcohol 40%. Del cual se obtuvieron 6 muestras para cada extracto. El blanco es el mismo solvente, en la proporción antes descrita. Adicionalmente se estableció el testigo para las reacciones de detección, empleando directamente trozos triturados de D. bulbifera (pulpa y cáscara).
El diseño experimental factorial elegido para obtener los resultados de investigación fue, 2 factores y 3 niveles (2x3) con 6 repeticiones, con un total de 36 ensayos, para identificar la presencia de núcleos esteroidales y flavonoides en extractos macerados del bulbo de D. bulbifera.
3) Evaluación de las reacciones de detección
La interpretación de los resultados obtenidos en las detecciones cualitativas se realizó mediante la triangulación de las observaciones 17. Se asignó una valoración numérica de 1 a 4 como lo propone la Tabla III, donde 1 es una reacción igual a la del blanco, y 4 es una reacción igual a la del patrón químico definido para cada metabolito de interés: esteroides- hidrocortisona, flavonoides- vino tinto.
Puntaje | Norma |
---|---|
1 | Se parece la reacción al blanco |
2 | Hay una reacción que no es descrita como la positiva |
3 | Reacción parecida al patrón, pero con distorsión |
4 | Reacción igual al patrón |
Se estableció una matriz de relaciones por color (TABLA IV) en donde la pareja ordenada se organizó dejando en el eje vertical los puntajes asignados para flavonoides y en el eje horizontal los puntajes asignados a esteroides.
De esta manera el cruce de puntajes entre flavonoides y esteroides completó la matriz indicando la frecuencia acumulada de las 6 repeticiones en las detecciones realizadas. Esto permitió crear una escala de colores, cuyos criterios de valoración se relacionaron con la afinidad: solvente - núcleo, mostrada en la TABLA V.
Cualificación | Descripción |
Polaridad de solvente muy afín al compuesto de interés | |
Polaridad semejante al compuesto de interés | |
Poca afinidad del solvente con el compuesto de interés | |
Compuesto de interés insoluble en el solvente |
Bajo el mismo criterio de la matriz de relaciones se elaboró una matriz ponderada, con el fin de facilitar la identificación de la efectividad de la acción del solvente en la separación de los núcleos de interés.
D. Resultados
1) Maceración
Una extracción vegetal efectiva debe ser aquella en la que el solvente genera lisis de la pared celular, garantizando la conservación e integridad de los compuestos a extraer (18 Pagina 12 - 17). De acuerdo con la información reportada en la TABLA VI en la que se muestran las observaciones obtenidas para los procesos de separación de núcleos flavonoides y esteroides, luego de 25 días de maceración con tres solventes distintos, se evidenció que, para la maceración acuosa, la premisa anterior, no se llevó a cabo, en su lugar se generó fermentación de las muestras de D. bulbifera hacia el día cinco de iniciada la maceración.
Tipo | Color | Textura | Apariencia | Aroma | |
---|---|---|---|---|---|
Hidrolato | Bulbo | Beige | Blanda cremosa | Tersa, suave | Alcohólico |
Solvente | Beige | Aumento viscosidad | Turbidez y opalescencia | Frutos secos y pasa de uva | |
Oleato | Bulbo | Amarillo | Firme, intacto | Manchas | No se identifica |
Solvente | Transparente. | Fluido, translucido | Terso | No se percibe | |
Alcoholato | Bulbo | Café pardo | Hinchado, blando | Firmeza reducida | Alcohólico |
Solvente | Naranja oscuro | Turbio | Tersa y fluida | Nueces y tierra |
La maceración oleaginosa tampoco presentó indicios de lisis celular por solvente. Por el contrario, la maceración alcohólica, indicó que la lisis fue efectiva, por lo que se obtuvieron resultados positivos en la identificación en los núcleos de interés.
La fermentación alcohólica generada en el macerado acuoso, sucedió a partir de las condiciones favorables de temperatura, humedad y concentracion de sustrato (almidón de la pulpa)19 para microorganismos, que posiblemente se depositaron en el tiempo de solarización directa. El pardeamiento leve observado en los trozos de bulbo en el oleato, indicaron un efecto conservante aparente, resaltando el carácter hidrofóbico del solvente sobre los núcleos de interés.
2) Detección de núcleos químicos
En la Tabla VII. se aprecian los puntajes obtenidos de la triangulación de observación, para la detección de los núcleos flavonoides y esteroides en cada uno de los extractos producto de las maceraciones sobre los bulbos de D. bulbifera, siguiendo los criterios de la Tabla III.
Con un promedio superior a 3 puntos en las pruebas realizadas en el bulbo crudo, se pudo inferir que los compuestos de interés se encuentran disponibles en la cáscara y en la pulpa de D. bulbifera, de manera que las detecciones realizadas a los diferentes extractos sean parecidos en un 83% al patrón de esteroides y 50% al patrón de flavonoides (Fig. 2). Esto evidenciaría por un lado la acción de lisis de la pared celular, realizada por los solventes y por otro justifica la distorsión de los resultados en las pruebas de detección realizadas, ya que la extracción con un ácido fuerte como el ácido sulfúrico 3,5M en la prueba RxL-B favorece tanto la extracción como la hidrólisis simultáneas20, manifestándose mediante la aparición de coloraciones de oscuras en la superficie marcada al parecer por el contenido de almidón de la pulpa que contiene gomas y almidones, que al combinarse con anhidridos y luego bajar su pH rápidamente tienden a generar coloraciones ocres y oscuras 21.
3) Evaluación de las reacciones de detección
El promedio de 4 puntos obtenido en ambas pruebas para el alcoholato demostró que la polaridad del etanol al 40% es el solvente de mayor afinidad a los compuestos flavonoides y glicoalcaloides de D. bulbifera esto corresponde a 67% y 83% respectivamente de acuerdo con lo expuesto en la Fig 2.
Los puntajes consolidados para cada uno de los extractos se distribuyen así: A) Hidrolato, B) Alcoholato, C) Oleato, D) Testigo: Bulbo crudo. La “X” representa el resultado de un cruce de puntajes para cada repetición evaluada. Ejemplo: en la tabla C una repetición obtuvo un puntaje de 1 para esteroides y 2 para flavonoides
La detección de los metabolitos alcaloides y flavonoides en el oleato presentó una reacción similar al blanco de hidrocortisona 1% y solución de vino tinto en todas las repeticiones cuyo puntaje de norma es 1 (Tabla VII), indicando reacciones negativas de detección en el 83 % para alcaloides y 67% para flavonoides (Fig. 2).
En la tabla VIII, se observan las matrices que consolidan la combinación de los resultados de las pruebas cualitativas de detección, donde según la afinidad del solvente con el compuesto químico de interés son clasificados por colores.
Hidrolato | Alcoholato | ||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
A | Esteroides | B | Esteroides | ||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | ||||
Flavonoides | 1 | xx | xx | Flavonoides | 1 | ||||||
2 | xx | 2 | |||||||||
3 | 3 | xx | |||||||||
4 | 4 | xx | xx | ||||||||
Oleato | Bulbo crudo | ||||||||||
C | Esteroides | D | Esteroides | ||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | ||||
Flavonoides | 1 | xxx | xx | Flavonoides | 1 | ||||||
2 | x | 2 | xxx | ||||||||
3 | 3 | x | xx | ||||||||
4 | 4 |
La matriz A de la tabla VIII, arrojó que el agua empleada en la separación, es insoluble y poco afín con los metabolitos de interés, lo que corresponde al 67% según lo expuesto en la matriz ponderada (Tabla IX), puesto que la fermentación ocasionada por la dispersión del almidón en agua, enmascaró la posible concentración de los compuestos con núcleos de interés liberados por la lisis que este solvente causó en la pared celular de los trozos de D. bulbifera. Esto abrió la posibilidad, para considerar que se llevó a cabo una competencia por el agua libre entre los microorganismos contaminantes en las muestras y la solubilidad de los compuestos, contrario al efecto biocida atribuido a los glicoalcaloides propios de la familia Dioscórea22.
Solvente | Determinación | |||
---|---|---|---|---|
Agua Destilada | Aceite mineral | Alcohol etílico 40% | Bulbo Crudo | |
Hidrolato | Oleato | Alcoholato | ||
100% | 33% | Polaridad de solvente muy afín al compuesto de interés | ||
67% | Polaridad semejante al compuesto de interés | |||
67% | 50% | Poca afinidad del solvente con el compuesto de interés | ||
33% | 50% | Compuesto de interés insoluble en el solvente |
A partir de los resultados de la matriz C de la tabla VIII, se pudo afirmar que el aceite mineral tuvo una valoración similar al solvente anteriormente descrito, pero representando el 50% de insolubilidad del solvente (Tabla IX). Una vez finalizado el tiempo de maceración, los trozos de la muestra presentaron los atributos sensoriales mostradas en la tabla VI, en los que se demuestra la integridad de los mismos, confiriéndole al aceite mineral propiedades conservantes.
Por lo observado en la matriz B de la tabla VIII, se pudo deducir que la polaridad del alcohol al 40% es afín a los compuestos esteroides y flavonoides presentes en trozos de bulbo en el 100% de los casos (Tabla IX), siendo confirmado por otros estudios realizados con extractos de D. bulbifera con solventes como el metanol y cloroformo 11. Sin embargo la precisión en la confirmación de la RxSh para flavonoides de D. bulbifera, presentó interferentes relacionados con la aparición de compuestos lechosos o blancuzcos que se asocian con la presencia de flavonoides como chalconas, auronas o isoflavonas 23),(15.
IV. CONCLUSIONES
El alcohol es el solvente que extrae de forma efectiva metabolitos secundarios de núcleos esteroides y flavonoides durante la maceración de bulbos de D. bulbifera, ya que en las pruebas de detección (RxL-B y RxSh) para estos núcleos presentó un 100% de afinidad, dado su carácter hidrofílico y comparando el contenido de su extracto con lo hallado en el bulbo crudo.
El efecto biocida de los compuestos esteroidales como los glicoalcaloides de D. bulbifera impiden obtener un macerado acuoso con agua destilada por 25 días, debido a que se genera fermentación después del quinto día por microorganismos, principal interferente para no detectar flavonoides en este extracto.
El aceite mineral se comportó como un agente conservante debido a su carácter hidrofóbico opuesto a la naturaleza de los núcleos de interés en los trozos de D. bulbifera, por lo tanto, la cantidad de compuestos con núcleo esteroidal o flavonoide no pudo ser detectada por las pruebas aplicadas al extracto.
La capacidad antioxidante de los flavonoides y la posibilidad de extraer esteroides de la pulpa y la cáscara detectados en D. bulbifera, permite considerar la idea de usar estos bulbos como una nueva materia prima en el sector agroindustrial.
RECOMENDACIONES
Se propone plantear el aislamiento de compuestos con núcleos esteroides, empleando algunas metodologías propuestas en la referencia 24, con el fin de cuantificar el contenido en bulbos de D. bulbifera extraído en solventes alcohólicos.
Teniendo presente que los núcleos de interés son de carácter hidrofílico, se sugiere realizar extracciones con otros solventes de esta naturaleza como el ácido acético al 5% v/v, mezclas de este con etanol y cloroformo. 25
Se podría establecer en próximas investigaciones, un objetivo que permita identificar la fracción de bulbo donde se acumulan los grupos esteroide y flavonoide 26, para evidenciar en qué segmento transversal del bulbo existe más o menos concentración, proponiendo la creación de un protocolo de cuantificación adaptado a D. bulbifera, llevado a cabo mediante HPLC 27.