INTRODUCCIÓN
Leishmania (Viannia) panamensis es un parásito protozoo que causa la enfermedad conocida como Leishmaniosis. Estos parásitos son transmitidos en América por la picadura de un flebótomo hembra del género Lutzomya (Lewis 1971, Rogers et al. 2004). Existen tres formas clínicas de la enfermedad, la Leishmaniosis cutánea (LC) que causa lesiones en la piel; la Leishmaniosis mucocutánea (LMC) que afecta las mucosas y por último la Leishmaniosis visceral (LV), que se presenta en órganos internos como el bazo y el hígado (WHO 2016). La Organización Mundial de la Salud (OMS) considera la Leishmaniosis como una de las enfermedades olvidadas y hasta el momento no se cuenta con una vacuna que posibilite la prevención de la enfermedad (de Vries et al. 2015, WHO 2016).
Los principales fármacos utilizados en el tratamiento de la enfermedad son los antimoniales pentavalentes, el Isetionato de pentamidina, la Mitelfosina y la Anfotericina B (Blum et al. 2004, Sundar y Chakravarty 2010, Wortmann et al. 2010); aunque estos han mostrado ser efectivos contra las tres formas de la enfermedad, presentan una alta toxicidad (Olliaro y Bryceson 1993, Sundar y Chakravarty 2010). Los tratamientos para la Leishmaniosis están acompañados de daño hepático y afecciones cardiacas debido a los periodos prolongados de tratamiento (Frézard et al. 2009), lo que conduce a la suspensión del tratamiento por los pacientes. Para ofrecer una futura posibilidad de tratamiento son necesarios nuevos candidatos en drogas leishmanicidas.
Las moléculas responsables de la defensa en muchos organismos podrían representar un buen recurso para identificar nuevas drogas contra la Leishmaniosis. Una de las alternativas más promisorias son los péptidos antimicrobianos (PAMs), moléculas utilizadas en la defensa inmune en muchos organismos, caracterizados por tener un amplio espectro de actividad, baja generación de resistencia y baja toxicidad en células humanas (Brogden et al. 2003, Zhao et al. 2013). Algunos PAMs como la Daptomicina y Vancomicina han demostrado ser efectivos contra cepas resistentes a antibióticos convencionales (Hancock y Sahl 2006). En insectos, los PAMs hacen parte de la respuesta inmune humoral, y son sintetizados principalmente en células del cuerpo graso y hemocitos (Bulet et al. 2003), para luego ser secretados a la hemolinfa, que es equivalente a la sangre en los humanos (Wyatt 1961). Los péptidos liberados en la hemolinfa generan una respuesta sistémica que lleva al ataque directo de los PAMs hacia la membrana del microorganismo invasor, permeabilizándola y produciendo por último la muerte del agente agresor (Yeaman y Yount 2003). Para buscar posibles moléculas candidatas contra la Leishmaniosis, se utilizó como modelo biológico la polilla Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae). Este organismo ha sido utilizado en diferentes estudios para evaluar la producción de PAMs, luego del reto con diferentes microorganismos (Andrejko et al. 2009, Mak et al. 2010). Uno de los péptidos identificados en G. mellonella, la Cecropina D, demostró tener un amplio espectro de actividad contra el hongo Aspergillus niger, bacterias Gram-negativas como Escherichia coli D31 y bacterias Gram-positivas como Micrococcus luteus (Cytrynska et al. 2007). Otros péptidos identificados en G. mellonella pertenecen a la familia de las Moricinas las cuales presentan actividad anti-fúngica (Brown et al. 2008). Estas investigaciones revelan el potencial del uso de G. mellonella como modelo biológico para la obtención de péptidos con posible actividad leishmanicida. El objetivo de este trabajo fue evaluar la expresión diferencial de proteínas de bajo peso molecular, entre las cuales se encuentran los péptidos antimicrobianos presentes en la hemolinfa de larvas de G. mellonella, inducidos como respuesta al reto inmunológico con promastigotes de Leishmania (Viannia) panamensis. Para cumplir este objetivo se realizó un proceso de extracción de proteínas de bajo peso molecular; posteriormente, las proteínas fueron separadas por electroforesis bidimensional (electroforesis 2D), comparando las hemolinfas de larvas retadas y no retadas con parásitos. El análisis de los resultados permitió identificar diferencias entre los perfiles de proteínas de hemolinfa sin reto y con reto, sugiriendo que la inoculación de las larvas de G. mellonella con promastigotes de L. (V) panamensis indujo la expresión de péptidos capaces de disminuir la proliferación del parásito.
MATERIALES Y METODOS
Obtención de larvas de G. mellonella.
Las larvas de G. mellonella fueron criadas en recipientes acrílicos bajo una dieta artificial compuesta por 13% de harina de maíz amarillo, 13% de leche en polvo, 6% de germen de trigo, 6% de levadura de cerveza, 25% de salvado de trigo, 20% de glicerol, 13% de miel de abejas y 4% de cera de abejas. Las larvas fueron mantenidas en la oscuridad a 28 °C. Para los ensayos se seleccionaron larvas en el último estadio de desarrollo (18 días y 300 mg de peso).
Parásitos de L. (V) panamensis.
Se utilizaron cultivos de L. (V) panamensis en el estadio de promastigotes (cepa UA946, Grupo de Inmunomodulación, Universidad de Antioquia). Los promastigotes fueron cultivados en medio Schneider a un pH 6,9 (SIM, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). El medio fue suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 10% (GIBCO, Grand Island, NY, USA), penicilina a 100 U/mL y estreptomicina 100 µg/mL (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). Los parásitos fueron incubados 26 °C por 5 días (en fase estacionaria de crecimiento). Los cultivos se centrifugaron a 2.500 rpm a temperatura ambiente por 10 min. El botón de parásitos fue lavado dos veces con tampón PBS 1X (GIBCO, Grand Island, NY, USA), luego la concentración de parásitos fue ajustada haciendo conteo por cámara de Neubauer de acuerdo con lo requerido para cada uno de los experimentos.
Reto inmunológico y recolección de la hemolinfa.
Para la inmunización de las larvas y posterior recolección de la hemolinfa, se emplearon tres grupos: larvas sin reto, larvas inoculadas con PBS y larvas retadas con parásitos de L. (V) panamensis, utilizando 100 larvas para cada grupo. La suspensión de promastigotes de L. (V) panamensis fue ajustada a tres diferentes concentraciones (1x106, 1x107 y 1x108 parásitos/mL) en tampón PBS 1X (GIBCO, Grand Island, NY, USA). Cada larva de G. mellonella fue inyectada directamente en el hemocele con 20 µl de la suspensión de parásitos ajustada a las concentraciones anteriormente mencionadas. Como controles se utilizaron larvas que fueron inoculadas con 20 µl de tampón PBS al 1X (GIBCO, Grand Island, NY, USA) y larvas que no fueron inoculadas. Seguido a la inoculación, las larvas fueron incubadas a 28 °C dentro de cajas de Petri estériles en condiciones de oscuridad. La recolección de hemolinfa se realizó a las 24, 48 y 72 horas post-inyección. En la recolección de la hemolinfa las larvas fueron puestas sobre hielo por 15 min y la superficie del abdomen larval fue desinfectada con etanol al 70%. La hemolinfa fue obtenida por punción con una aguja estéril en el abdomen en el último segmento de la larva. La hemolinfa que fluía fue recolectada en un tubo Eppendorf que contenía cristales de feniltiourea (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) para prevenir la melanización. La hemolinfa colectada se centrifugó a 13000 rpm por 15 min a 4 °C. El sobrenadante fue colectado y la hemolinfa libre de hemocitos fue guardada a -20°C hasta su uso.
Obtención de péptidos de bajo peso molecular.
Los péptidos de bajo peso molecular fueron obtenidos a través de la extracción ácido-metanólica de las proteínas presentes en las muestras de hemolinfa colectada de acuerdo con el método de Schoofs et al. (1990). Se tomaron 100 µl de hemolinfa que fueron diluidos en 10 volúmenes de solución metanol: ácido acético: agua (90: 1: 9, v/v/v). Luego la mezcla se centrifugó a 13.000 rpm por 30 min a 4 °C. El precipitado fue descartado y el sobrenadante fue colectado y liofilizado. El liofilizado se disolvió en solución acuosa de ácido trifluoroacético al 0,1%. Posteriormente, para remover los lípidos presentes en la muestra se adicionó un volumen igual de hexano; las muestras se agitaron con vórtex y se centrifugaron nuevamente a 13.000 rpm por 10 min a 4 °C. La fracción superior que contiene los lípidos fue removida y se adicionó un volumen igual de acetato de etilo a la fracción acuosa que contenía las proteínas. Se centrifugó nuevamente a 13.000 rpm por 5 min y la fracción acuosa fue recuperada, liofilizada y almacenada a -20 °C hasta su uso. Para la cuantificación de proteínas se utilizó el método del ácido bicinconínico (Bicinchoninic Acid Kit, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). Se realizó la cuantificación de proteínas totales presentes en la hemolinfa libre de hemocitos y proteínas totales presentes en los extractos ácido-metanólicos. La hemolinfa y las fracciones se visualizaron por SDS-PAGE en una cámara MiniProtean III (Bio-Rad, California, USA). Los geles fueron revelados con azul de Coomassie o con tinción de plata.
Electroforesis en dos dimensiones.
Los extractos de hemolinfa (200 µg de proteína total) fueron mezclados con tampón desnaturalizante (Urea/Tiourea 7 M/2 M, CHAPS al 4% (V/V), DTT al 100 mM y anfolitos en un rango de pH 4−7, Invitrogen, California, USA) para un volumen final de 200 µl. Las muestras fueron agitadas y colocadas en un baño de ultrasonido 5 veces cada 120 min (Elmasonic, Singen, Baden-Wurtemberg, Alemania). Luego, de cada muestra se cargaron 190 µl en las tirillas (Isoelectric Point Gel, IPG de 7 mm y pH 4−7, Invitrogen, Carlsbad, California, USA). Para el análisis por isoelectroenfoque (IEF), se utilizó un gradiente de voltaje de 220 V hasta 2000 V, siguiendo las recomendaciones del fabricante (ZOOM, IPG Runner, Invitrogen, Carlsbad, California, USA). Para la segunda dimensión la tirilla de IPG se equilibró en tampón LDS (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) por 15 min, luego la tirilla se equilibró 15 min con yodo acetamida a 100 mM en tampón LDS. Después, la tirilla se colocó en un gel preformado (gel NuPAGE del 4−12%, Invitrogen, Carlsbad, California, USA) y el corrido se realizó 200 V con tampón de 50 mM MES y SDS 1X por 45 min en cámara de Xcell (XCell Sure lokc, Invitrogen, Carlsbad, California, USA). Para visualización de las proteínas (manchas) los geles fueron teñidos con plata utilizando el estuche de Invitrogen (SilverQuest Staining kit, Invitrogen, Carlsbad, California, USA) siguiendo las indicaciones del fabricante. Todos los geles fueron digitalizados por medio de un escáner (Image Scanner A3 10000 XL, Epson, Japón) y analizados con el programa Image Master Platinum 7 (GE Healthcare, Little Chalfont, United Kingdom).
Fraccionamiento de los extractos ácido-metanólicos por RPHPLC.
Los extractos ácido-metanólicos fueron separados por cromatografía líquida en fase reversa (RP-HPLC) utilizando la columna Discovery C-18 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) y el equipo de cromatografía NGC (Bio-Rad, California, USA). La columna fue equilibrada con solución tampón A (Solución acuosa de TFA al 0,07%). Por cada corrido cromatográfico, la columna fue cargada con 600 µg de muestra. Para la elución se utilizó un gradiente de 0−100% de tampón B (TFA al 0,07% Acetonitrilo al 80%) con una velocidad de flujo de 1 mL/min por 45 min. Las fracciones fueron monitoreadas a 215 y 280 nm y almacenadas usando el colector de fracciones BioFract (Bio-Rad, California, USA).
Actividad antiparasitaria de las fracciones peptídicas.
La actividad antiparasitaria de las fracciones obtenidas por cromatografía se evaluó en cultivos de promastigotes de L. (V) panamensis utilizando el método colorimétrico MTT (Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) (Invitrogen, Carlsbad, California, USA)). Los parásitos (2 x 107 parásitos /mL) (Chicharro et al. 2001, Díaz-Achirica et al. 1998) fueron incubados por 24 horas a 26 °C con una concentración final de 20 µg/mL de cada fracción; como control negativo se incubaron los parásitos con PBS y como control positivo se utilizó Anfotericina B (3 µg/mL) (Amresco, Solon, Ohio, USA). Los experimentos se hicieron por triplicado. La actividad antiparasitaria se determinó por la reducción de formazán. Los datos fueron analizados con el programa GraphPad Prism 5.01, realizando un análisis de varianza (ANOVA de una vía) y una prueba T-Student con un p<0,05.
RESULTADOS
Efecto del reto inmunológico en larvas de G. mellonella con promastigotes de L. (V) panamensis.
Las larvas empleadas para el reto inmunológico se seleccionaron de acuerdo con los criterios de peso (300 mg) y adicionalmente, la presencia de una coloración totalmente amarilla en la cutícula. En la Figura 1A se muestran las larvas inoculadas con PBS, utilizadas como control de la lesión generada por la inyección. Asimismo, se muestran las larvas inoculadas con la suspensión de parásitos de L. (V) panamensis a las tres diferentes concentraciones empleadas (Figura 1B, C y D). Después del reto con Leishmania, se realizó el seguimiento de las larvas control y retadas, con el fin de determinar cambios en la coloración de la cutícula o mortalidad generada por la inyección. Asimismo, se muestran las larvas inoculadas con la suspensión de parásitos de L. (V) panamensis a las tres diferentes concentraciones empleadas (Figura 1B, C y D). Después del reto con Leishmania, se realizó el seguimiento de las larvas control y retadas, con el fin de determinar cambios en la coloración de la cutícula o mortalidad generada por la inoculación de los parásitos. De acuerdo con lo observado se determinó que la inoculación de promastigotes de Leishmania no indujo cambios de coloración (melanización) en las larvas, al comparar con las larvas control (Figura 1A). Adicionalmente, se observó que el reto con Leishmania no generó muerte de las larvas retadas con ninguna de las concentraciones de promastigotes inoculada. La hemolinfa se colectó en tres tiempos diferentes 24, 48 y 72 horas luego del reto. De cada larva se obtuvo, aproximadamente, entre 10-15 µl de hemolinfa. En conclusión, no se observó retraso en el desarrollo del tiempo del ciclo de pupa hasta llegar adulto con ninguna de las concentraciones usadas y las dosis no alteraron la cantidad de hemolinfa por larva.
Extracción de los péptidos de bajo peso molecular. Las proteínas presentes en la hemolinfa total y extractos ácido-metanólicos fueron analizadas por SDS-PAGE (Figura 2). Los resultados muestran perfiles electroforéticos iguales en la hemolinfa sin reto, con PBS o retadas con promastigotes de L. (V) panamensis (Figura 2A). La eliminación de los lípidos por medio de la extracción ácido-metanólica también eliminó las proteínas de peso molecular por encima de 27 kDa (Figura 2B). Aunque los perfiles obtenidos de la hemolinfa después de extraer los lípidos son muy similares, se puede observar una señal tenue entre las bandas de 3,5 y 6,5 kDa presente solo en las larvas que recibieron la punción, como son las larvas inoculadas con PBS y las que fueron inoculadas con el parásito (Figura 2A). Para determinar si la dosis de parásitos inoculados modula positivamente la producción de péptidos de bajo peso molecular, los extractos libres de lípidos de las hemolinfas de las larvas que fueron tratadas con 1 x 106, 1 x 107 y 1 x 108 parásitos/mL de inóculo, fueron analizados por SDS-PAGE teñido con plata (Figura 3). La eliminación de las proteínas de alto peso molecular, así como de los lípidos resulta en perfiles proteicos similares para las tres dosis utilizadas. Sin embargo, cuando las larvas se inocularon con 1 x 106 parásitos/mL se favorece la inducción de péptidos por debajo de la banda de 6,5 kDa a las 48 y 72 horas (Figura 3, carril 6 y 10). De acuerdo con estos resultados se determinó que la concentración óptima con la cual se produjo un aumento en la expresión de proteínas fue 1 x 106 parásitos/mL a un tiempo de 48 horas para generar la inducción en la expresión de proteínas de bajo peso molecular.
Análisis 2D de los extractos de proteínas de bajo peso molecular.
Los extractos ácido-metanólicos que contienen los péptidos de bajo peso molecular fueron sometidos a una electroforesis bidimensional (2D electroforesis). Al final, los geles se tiñeron con plata y se visualizaron varias señales (manchas) que demuestran la presencia de péptidos de bajo peso molecular en estos extractos (Figura 4). Después de la digitalización de las imágenes, los geles (no retadas, PBS y retadas) fueron alineados y se establecieron los parámetros para la detección de las señales reales, la no superposición de las señales y los límites reales de cada señal de acuerdo con el programa Ima ge Master (General Electric, Little Chalfont, United Kingdom). El número total de señales (manchas) identificados en los geles de la hemolinfa sin reto fue 61, en la hemolinfa control con PBS fue 65 y en la hemolinfa retada fue 66. Los resultados muestran que la punción en el abdomen de la larva tuvo un incremento en el número de señales detectadas por el programa Image Master Platinum. Además, se presentaron señales comunes en ambas hemolinfas como las manchas 39, 55 y 59 (Figura 4B y C). El análisis también reveló la presencia de señales que estuvieron solo en la hemolinfa retada (manchas 46, 49, 50 y 92) (Figura 4C).
Actividad antiparasitaria de las fracciones de hemolinfa.
Los extractos de hemolinfa control de larvas inoculadas con PBS y larvas retadas se fraccionaron por cromatografía en fase reversa utilizando una columna C-18; las fracciones obtenidas se liofilizaron y se evaluó la actividad antiparasitaria usando el método colorimétrico de MTT, donde la no reducción del formazán determina el porcentaje de parásitos muertos. De las fracciones obtenidas, cuatro correspondientes a hemolinfa retada presentaron más del 40% en la mortalidad de los parásitos (Figura 5, barras rojas). La fracción 1 presentó la mayor actividad leishmanicida generando 62,2 ± 3,7% de parásitos muertos seguida por la fracción 4 con 56,25 ± 4,6%, la fracción 3 con 47,17 ± 3,04% y la fracción 2 con 41,9% ± 2,7%. El análisis estadístico (ANOVA, con un nivel de significancia de p<0,05) indicó diferencias significativas de las cuatro fracciones evaluadas respecto al control (parásitos con PBS), obteniendo un p<0,001. Adicionalmente, al compa rar entre fracciones de hemolinfa sin reto (Figura 5, barras azules) y las fracciones de hemolinfa retada (Figura 5, barras rojas) con la prueba T-Student (p<0,05), se encontraron diferencias significativas entre la fracción 1, 3 y 4 (p=0,034, p=0,0081 y p=0,0177, respectivamente). Entre las fracciones 2 no se obtuvieron diferencias (p=0,644) (Figura 5). Estos datos sugieren un aumento de la actividad leishmanicida en tres de las fracciones de hemolinfa obtenidas después del reto con los promastigotes.
DISCUSIÓN
La respuesta inmune innata de insectos como G. mellonella hacia los microorganismos invasores está mediada por una batería de proteínas y péptidos antimicrobianos (Bergin et al. 2006, Cook y McArthur 2013). Estas moléculas son constituyentes de la hemolinfa del insecto, que es el equivalente a la sangre de los mamíferos (Wyatt 1961). Muchos estudios han registrado la inducción de PAMs luego de infectar las larvas de G. mellonella con diferentes microorganismos como E. coli y M. luteus (Brown et al. 2009, Cytrynska et al. 2007, Mak et al. 2010). Adicionalmente, en larvas que fueron inmunizadas con el hongo Beauveria bassiana, la hemolinfa presentó una respuesta anti-fúngica, pero no una respuesta antibacteriana (Wojda et al. 2009). Estos estudios han concluido que en G. mellonella se da una expresión diferencial e inducible de PAMs, que depende del tipo de patógeno usado para la inmunización.
En esta investigación, el primer paso fue determinar el inóculo y el tiempo al cual se daba una inducción de péptidos de bajo peso molecular en la hemolinfa de las larvas inoculadas con promastigotes de L. (V) panamensis. Luego de la inoculación, no se presentó mortalidad como causa del reto inmunológico con ninguna de las tres concentraciones evaluadas; con estos resultados se observó que hasta con la concentración más alta evaluada (1 x 108 promastigotes/ml) las larvas de G. mellonella son capaces de sobrevivir al reto con este parásito por 72 horas, que fue el tiempo máximo evaluado. Posteriormente, se determinó que a las 48 horas pos-infección y con un inóculo 1 x 106 promastigotes/ml, se presentó un aumento en las proteínas de bajo peso molecular (Figura 3). Con los resultados de SDS-PAGE se observó un cambio en la abundancia de las proteínas por debajo de los 6 kDa (Figura 2B y Figura 3, carril 6 y 10). Estos resultados muestran que hay una inducción de péptidos a diferentes intervalos de tiempo durante el curso de la infección con los promastigotes. Esto datos están en concordancia con lo publicado en el año 2010 por Mak y colaboradores, quienes reportaron un aumento en algunos péptidos como Cecropina y Defensina en G. mellonella a las 24 horas luego del reto con E. coli. Además, demostraron que al inyectar las larvas con otro microorganismo como Fusarium oxysporum se daba la mayor expresión de estos mismos péptidos, pero 72 horas pos-inoculación (Mak et al. 2010).El análisis 2D se centró en encontrar las posibles diferencias de las hemolinfas. El análisis de los perfiles proteicos mostró cuatro nuevas señales (manchas) (Figura 4) presentes únicamente en la hemolinfa de larvas inoculadas con parásitos, indicando una posible inducción de péptidos como consecuencia del reto. Por otro lado, tres señales (Figura4) se identificaron en las hemolinfas de las larvas que recibieron la punción para inocular los promastigotes o por la inyección del PBS. La punción en el abdomen de las larvas genera un trauma a nivel celular en donde la barrera tegumentaria es parcialmente interrumpida. Se ha registrado que los eventos de trauma generados en las larvas de insecto inducen la producción de PAMs como las Cecropinas y Defensina (Brey et al. 1993, Hoffmann y Hetru 1992). Adicionalmente, cuando la hemolinfa fue fraccionada por RP-HPLC, se obtuvieron fracciones que presentaron actividad antiparasitaria, generando más de un 40% de mortalidad de los parásitos con las fracciones de hemolinfa retada. Las fracciones 1, 3 y 4 (Figura 5) presentaron diferencias significativas al ser comparadas con las mismas fracciones obtenidas de hemolinfa control sin reto, pero inyectadas con PBS; este aumento en la actividad leishmanicida puede deberse a la inducción de proteínas o péptidos que fueron inducidos por el reto inmunológico y no por el trauma causado en la larva. La inducción de PAMs en insectos en presencia de parásitos de Leishmania ha sido registrada en Phlebotomus duboscqi (Boulanger et al. 2004). Estos resultados demuestran que el reto con promastigotes de L. (V) panamensis indujo la expresión de cuatro señales solo en las larvas que fueron retadas (geles 2D) con el parásito y que la hemolinfa posee actividad leishmanicida. Sin embargo, se necesita una posterior caracterización para identificar las proteínas encontradas y los genes expresados y responsables de esta actividad antiparasitaria. Con los resultados obtenidos en esta investigación se estableció, por primera vez, que se presenta una respuesta a la inducción de proteínas o péptidos en larvas de G. mellonella luego de inocular las larvas con promastigotes de L. (V) panamensis. Estos estudios preliminares abren una ventana para hacer identificación de nuevas moléculas que tengan un uso potencial como agentes leishmanicidas.