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INTRODUÇÃO
As bactérias patogênicas de origem alimentar despertam o interesse na busca de agentes antibacterianos. Os dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) mostram que uma em cada dez pessoas adoecem quando ingerem alimentos contaminados e 420 000 vêm ao óbito a cada ano. Entre os principais fatores responsáveis por esses resultados estão as doenças transmitidas por bactérias e o processo de deterioração alimentar [1-3].
Para conter este processo, a indústria de alimento utiliza os agentes antibacterianos sintéticos. No entanto, apesar destes possuírem eficácia no controle de surtos destas doenças, suas aplicações provocaram acúmulo de resíduos no meio ambiente, resistência bacteriana aos produtos químicos aplicados e efeitos colaterais na saúde humana [4, 5]. Além disso, outra desvantagem está na preocupação dos consumidores com os efeitos colaterais a médio e longo prazo e com a segurança destes produtos. Dentro desta perspectiva, os pesquisadores precisam buscar novos agentes antibacteriano [6]. Logo, uma alternativa viável está nos estudos de produtos de origem natural, especialmente os óleos essenciais, devido a sua alta biodegrabilidade e baixa toxicidade para os mamíferos [7].
Os produtos extraídos de plantas, sejam extratos ou óleos essenciais, sobretudo da Pimenta dioica, possuem aplicações em alimentos, na medicina tradicional e em algumas atividades biológicas. Originária da América Central, principalmente da Jamaica e Cuba, esta planta é utilizada como condimento justamente pelo seu aroma e sabor picante. Por conta disto, a indústria de alimentos o utiliza não só para realçar sabor, mas também como conservante de carnes, devido a sua capacidade antioxidante [8].
Na medicina tradicional os extratos obtidos da folha são utilizados no tratamento da flatulência e diarreia, já os frutos pulverizados são empregados no trato de calos, neuralgia e reumatismo [8]. No que diz respeito às atividades biológicas, observamos relatos da utilização do óleo como antioxidante e citotóxico contra algumas linhagens de câncer [9], moluscicida contra Biomphalariaglabrata [10], acaricida [11], antibacteriano em alimentos [12,13], larvicida e adulticida contraAedesaegypti [14], antirradical [15] e antifúngico contra Fusarium oxysporum e F. verticillioides [16]. Apesar das inúmeras aplicações, no que diz respeito à atividade biológica, observamos que a maioria dos estudos se concentram mais em extrair o óleo a partir das folhas do que frutos. Devido a esta condição, neste estudo descreveremos a extração, composição química e atividade antibacteriana do óleo essencial dos frutos da P. dioica (L). Merr e do padrão do constituinte majoritário desse óleo.
MATERIAL E MÉTODOS
Obtenção e extração do óleo essencial
A coleta dos frutos foi realizada na Cooperativa Agrícola Mista do Projeto Onça LTDA, município de Taperoá-BA, Brasil, em agosto de 2005, recebendo o certificado orgânico pelo Instituto Biodinâmico (IBD) de número CA0212/05. Após a coleta, a secagem foi feita através de ventilação natural, posteriormente os frutos foram triturados no moinho elétrico (Tecnal, modelo TE-340) e armazenados em recipientes de polietileno. Extraímos o óleo por hidrodestilação e calculamos o rendimento médio a partir das medidas de densidade e do peso do material bruto. Para isso, pesamos 30 gramas das amostras e misturamos em 300 mL de água destilada. Em seguida colocamos esta mistura em um frasco de fundo redondo de 1000 mL e o acoplamos ao extrator de Clevenger sob aquecimento de 100 °C em uma manta elétrica por 3,5 h. Após esse tempo, o óleo destilado foi coletado e seco por percolação em sulfato de sódio anidro. Realizamos essas operações em triplicatas e armazenamos as amostras em ampolas de vidro âmbar sob refrigeração para evitar possíveis perdas de constituintes voláteis. Medimos a densidade a partir de um picnómetro a 25 °C.
Análise cromatográfica CG/EM
Identificamos os componentes do óleo essencial por cromatografía gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) em um cromatógrafo a gás da marca Varian 2100, acoplado a um espectrómetro de massa por impacto de elétrons e analisador de ions trap, utilizando hélio como gás de arraste com fluxo na coluna de 1 mL.min-1; temperatura do injetor: 270 °C, split 1:50; coluna capilar (15 m x 0,25 mm) com fase estacionária VF-1ms (100% metilsiloxano 0,25 µm) e programação de temperatura do forno de 60 a 200 °C com taxa de aquecimento de 8 °C.min-1, e de 200 e 290 °C, com taxa de aquecimento de 15 °C.min-1. Noespectrómetro de massas, as temperaturas do main fold íon trap e da linha de transferência foram de 50, 190 e 200 °C. Injetamos alíquotas de 1 µL (injetor automático CP-8410) das amostras diluídas na proporção de 20 µL em 1,5 mL de hexano. Identificamos os componentes do óleo a partir da comparação destes com os dados obtidos de substâncias autênticas existentes em bibliotecas de referência a partir do tempo de retenção.
Solução tampão e padrão
Utilizamos o tampão Britton-Robson (BR) em todos os experimentos eletroquímicos, onde foi ajustado ao pH desejado uma solução NaOH 1,0 mol L-1. Preparamos o tampão a partir de ácido bórico 0,04 mol L-1, ácido fosfórico 0,04 mol L-1 e perclorato de sódio 0,10 mol L-1, o que resultou numa solução de pH 1,8. O perclorato de sódio tinha a função de manter a força iónica na casa de 10-1.
As soluções padrões de eugenol (98% de pureza e procedência Chem Service) foram preparadas em diferentes concentrações para cada técnica analítica aplicada. Para a voltametria, utilizamos uma solução estoque de concentração 5,79 x 10-3 mol L-1, a qual foi preparada misturando-se 10 µL do padrão em balão de 10 mL e aferindo-se com uma solução etanol/tampão BR pH 3.3 a 55% (v/v). Já para a espectroscopia no UV, a solução estoque apresentava concentração de 5,79 x 10-2 mol L-1 e foi preparada acrescentando-se 100 µL do padrão de eugenol em um balão de 10 mL, aferido com solução etanol/água destilada a 60% (v/v). As soluções estoque do óleo essencial foram preparadas semelhantemente às do padrão de eugenol para cada método analítico, ou seja, 10 µL e 100 µL, respectivamente.
Determinações voltamétricas e espectroscópicas UV vis para quantificação de eugenol
As medidas eletroquímicas foram realizadas em um potenciostato, modelo CV50W, da Bioanalytical Systems, acoplado aos eletrodos e a um computador para captura dos dados, além de uma célula eletroquímica de vidro de 10 mL contendo tampa com entradas para os eletrodos e um agitador magnético. O eletrodo de trabalho utilizado (área = 0,06 cm2), o de referência e o eletrodo auxiliar foram, respectivamente, de carbono vítreo, prata em solução de cloreto de prata (Ag/AgCl) e platina. O eletrólito suporte usado foi uma solução etanol/tampão BR pH 3,3 a 55%.
A quantificação do eugenol, no óleo, foi determinada por voltametria de pulso diferencial com o método da adição padrão, para o qual 10 mL de uma solução contendo o óleo -preparada com 100 µL da respectiva solução estoque e com eletrólito suporte em um balão volumétrico- foi adicionado à célula eletrolítica e o valor da corrente da referida solução foi lido. Em seguida, adicionaram-se volumes crescentes da solução estoque do padrão de eugenol, devidamente calculados, para resultar em concentrações de 2 x 10-5 a 1,4 x 10-4 mol L-1, e as respectivas correntes eram lidas.
Para a quantificação por espectroscopia UV-vis, realizamos os testes em comprimento de onda de 280 nm e com as amostras diluídas em solução de etanol/água destilada a 60% (v/v). A quantificação do eugenol foi determinada pelo método da adição padrão. Para tanto, foram utilizados cinco balões volumétricos de 10 mL (contendo cada um 20 µL da solução estoque do óleo essencial), nos quais foram adicionados individualmente volumes crescentes da solução estoque do padrão de eugenol (0, 20, 40, 60 e 80 µL); sendo, em seguida, aferidos com a solução etanol/água destilada a 60%. A absorbância das novas soluções assim obtidas foi lida, tendo como branco a solução de etanol/água. Os espectros de absorção observados, assim com a curva de adição padrão, foram obtidos por várias concentrações de eugenol no intervalo de 1,28 x 10-4 a 5,12 x 10-4 mol L-1 em solução de etanol/água a 60%.
Testes da atividade antibacteriana
As cepas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa e Serratia odorifera utilizadas neste trabalho foram provenientes de alimentos e isoladas no Laboratório de Microbiologia da Universidade Federal do Maranhão.
Avaliamos a atividade antibacteriana do óleo essencial e do padrão de eugenol a partir do método de difusão em disco recomendado pela Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) [17]. Inoculamos as culturas bacterianas em caldo BHI (Brain and Heart Infusion) e após 24 h de incubação a 37 °C, procedemos a diluição até a obtenção de uma suspensão padronizada pelo grau 0,5 da escala de McFarland (108 microrganismos mL-1). Posteriormente, semeamos o inóculo de cada cultura bacteriana (0,10 mL) com swab estéril na superfície das placas contendo ágar Mueller Hinton solidificado, e sobre a mesma foram aderidos, com auxílio de uma pinça previamente flambada, pequenos discos de papel de filtro com 6 mm de diâmetro impregnados, individualmente, com 75 µL do óleo essencial e com o padrão (eugenol), sendo pressionados levemente sobre a superfície do meio. Por fim, as placas foram incubadas a 37 °C por 24 h e os halos de inibição foram medidos em uma régua milimetrada, certificada pelo Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (INMETRO).
Testamos o comportamento das cepas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa e Serratia odorifera frente à ação de antimicrobianos comerciais seguindo o método de difusão de disco [17]. Os discos impregnados com os antimicrobianos foram distribuídos nas placas com o auxílio de uma pinça previamente flambada, sendo em seguida levemente pressionados contra a superfície do meio. Na sequência, as placas foram incubadas a 37 °C por 24 h. Os antimicrobianos utilizados foram escolhidos pela sua eficácia ao respectivo microrganismo conforme recomendação da CLSI [18], sendo estes: tetraciclina (TET 30 µg), vancomicina (VAN 30 µg), cefoxitina (CFO 30 µg), ampicilina (AMP 10 µg g), cloranfenicol (CLO 30 µg), eritromicina (ERI 15 µg), gentamicina (GEN 10 µg), sulfazotrim (SUT 25 µg) e penicilina (PEN 10 µg).
RESULTADOS
Extração do óleo, análise cromatográfica GC/EM, UV-vis e voltametria de pulso diferencial
Extraindo o óleo pela técnica de hidrodestilação, obtivemos um rendimento médio e densidade média, respectivamente, 2.16 % (m/m) e 0.968 gmL-1. Da análise cromatográfica, identificamos a presença de 17 compostos, o que observamos no cromatograma (figura 1), onde o majoritário foi o eugenol e o minoritário o α-cariofileno, enquanto a classe predominante foi a dos monoterpenos, com 90,77% (tabela 1).
No entanto, ao quantificarmos o eugenol pela técnica de adição por padrão por espectroscopia de ultravioleta (UV-vis) e por voltametria de pulso diferencial, observamos pouca diferença nos valores. Da análise espectroscópica, constatamos que o eugenol estava presente em uma quantidade de 78,15% (figura 2) enquanto este valor foi de 74,63% na voltametria (figura 3). Por fim, na figura 4, mostramos o comportamento eletroquímico do padrão eugenol e do óleo essencial enquanto na figura 5 observamos os voltamogramas de pulso diferencial da amostra e do padrão de eugenol.
Figura 2 Determinação quantitativa do eugenol por espectroscopia de UV foi acompanhada pelo aumento da absorção da banda do anel aromático (λmáx=280nm), em função do aumento da concentração do eugenol no óleo. A curva analítica de adição padrão foi caracterizada pelo coeficiente de correlação linear igual a 0,9986 e desvio padrão de 0,039. Nessa figura, mostramos a curva de adição padrão da solução estoque do padrão sobre 20 µL de solução estoque da amostra do óleo essencial em solução etanol/água a 60% (A); Em (B) Espectros de absorção da mistura etanol/água a 60%, respectivamente, (1), da amostra (2) e das concentrações do padrão de eugenol: (3) 1,28 x 10-4 mol L-1, (4) 2,56 x 10-4 mol L-1, (5) 3,85 x 10-4 mol L-1 e (6) 5,12 x 10-4 mol L-1.
Figura 3 Curva da adição padrão obtida a partir do voltamograma de pulso diferencial da amostra e do padrão de eugenol em solução 55% etanol/tampão BR pH 3,3. Calculamos a concentração de eugenol no óleo essencial dos frutos da Pimenta dioica Lindl a partir da curva de adição padrão para o pico anódico. O valor da corrente lida para o óleo foi de 1,978 x 10-6 mol L-1, o que resultou numa concentração inicial de eugenol na célula de 4,273 x 10-5 mol L-1 que ao ser levado em consideração a pureza do padrão utilizado (98%) e as devidas correlações de diluição, chegamos a um teor de 74,63% de eugenol presente no óleo essencial.
Figura 4 O comportamento eletroquímico do eugenol e o seu intervalo de potencial, nos quais foram obtidos por voltametria cíclica, utilizando eletrodo de carbono vítreo versus eletrodo de Ag/ AgCl em solução de etanol/tampão BR pH 3,3 a 55%. Quando o eletrodo era apenas polido e uma varredura de potencial era executada (A), nenhuma resposta eletroquímica era obtida na faixa trabalhada, enquanto que na presença do óleo da Pimenta dioica Lindl (B) apareceram dois picos referentes à oxidação (524 mV) e redução (285 mV), indicando que o eugenol sofre processo redox quase reversível.
Figura 5 Inicialmente, leu-se a corrente de 100 µL da solução estoque da amostra (1) no eletrólito e no potencial de oxidação de 524 mV. Em seguida, adicionamos volumes pré-determinados de solução padrão de eugenol que resultou nas concentrações: 2 x 10-5 mol L-1 (2), 4 x 10-5 mol L-1 (3), 6 x 10-5 mol L-1 (4), 8 x 10-5 mol L-1 (5), 10 x 10-5 mol L-1 (6) e 12 x 10-5 mol L-1 (7), obtidos em solução 55% etanol/tampão BR pH 3,3. O tempo de deposição foi de 100 s, amplitude de pulso de 100 mV e velocidade de varredura de 50 mV s-1.
Atividade antibacteriana
Na tabela 2 apresentamos o resultado da suscetibilidade microbiana do óleo essencial dos frutos da Pimenta dioica (L). Merr e padrão eugenol pelo método da difusão em disco em relação às bactérias Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa e Serratia odorifera. Na figura 6, mostramos as imagens dos halos de inibição para óleo essencial. Deste resultado, observamos uma variação nos halos de 11 a 21 mm para o óleo essencial e 13 a 19 mm para o padrão eugenol.
Tabela 2 Sensibilidade das bactérias Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Pseu-domonas aeruginosa e Serratia odorifera ao óleo essencial dos frutos da Pimenta dioica (L.) Merr e ao padrão eugenol, utilizando-se o método de difusão em disco.
| Bactérias (média das medidas dos halos em milímetro) | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| Compostos | Escherichia coli | Staphylococcus aureus | Proteus mirabilis | Pseudomonas aeruginosa | Serratia odorifera |
| Óleo essencial | 21 | 21 | 20 | 16 | 13 |
| Padrão eugenol | 19 | 15 | 15 | 16 | 11 |
Figura 6 Atividade antibacteriana do óleo essencial da Pimenta dioica contra as bactérias (A) Pseudomonas aeruginosa, (B) Staphylococcus aureus, (C) Escherichia coli, (D) Proteus mirabilis e (E) Serratia odorífera.
Na tabela 3, observamos que os halos de inibição variaram de 8 a 40 mm para algumas bactérias frente aos antibióticos, sendo a penicilina mais efetiva contra a S. aureus. Na tabela 4, mostramos os parâmetros utilizados para considerar quando há sensibilidade alta, moderada ou resistência da bactéria ao antibiótico. A partir disso, observamos que a bactéria P. mirabilis resistiu ao antibiótico ampicilina e cefoxitina. Enquanto a bactéria Pseudomonas aeruginosa apresentou sensibilidade alta à gentamicina, moderada ao clorafenicol e sulfazotrim e resistente à tetraciclina. Por fim, a Serratia odorifera resistiu à tetraciclina, pouco sensível ao cloranfenicol e moderadamente sensível à ampicilina e cefoxitina.
Tabela 3 Sensibilidade das bactérias Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa e Serratia odorífera frente a alguns antibióticos.
* halo medido em milímetro; nt: não foi testado.
Tabela 4 Adaptação dos parâmetros da Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) para os antibióticos testados.
S = sensível; MS = moderadamente sensível; R = resistente (CLSI, 2008 [17]).
Embora a ação inibitória do óleo seja semelhante aos antibióticos, observamos que houve diferenças para algumas bactérias. Para Pseudomonas aeruginosa (halo igual a 16 mm) estes valores para o tratamento com óleo essencial estão acima dos obtidos pelos antibióticos correspondentes. No caso da Serratia odorifera, este valor foi menor para o óleo e maior do que o teste com a tetraciclina, porém próximo ao resultado do teste com a ampicilina e cefoxitina.
DISCUSSÃO
Em decorrência dos problemas provocados pelo uso dos antibacterianos químicos, a busca por produtos de origem natural incitou o interesse no desenvolvimento de novos agentes antibacterianos. Portanto, neste estudo mostramos que o óleo essencial extraído dos frutos da Pimenta dioica, que possui em sua maior quantidade o eugenol, e o padrão eugenol possuem atividade contra as bactérias Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa e Serratia odorifera.
Diversos fatores explicam as diferenças no rendimento e na composição química dos óleos essenciais. Em nosso estudo, o principal componente da P. dioica foi o eugenol. Geralmente as quantidades deste composto nos frutos estão em torno de 85% para um rendimento de 2 a 5% de óleo [19, 20]. Para explicar estas diferenças na composição, recorremos ao estudo realizado por Jiang et al. [21] que obtiveram diferentes rendimentos ao extrair o óleo essencial dos frutos da P. dioica por hidrodestilação e hidrodestilação assistida por micro-ondas. De acordo com os autores, esta diferença ocorre devido às facilidades de infiltração, difusão e troca entre as células do tecido vegetal durante a radiação com micro-ondas. Como este processo é mais lento na hidrodestilação convencional, as perdas de alguns constituintes também são afetadas quando a extração acontece de forma rápida ou lenta [22, 23]. Além do método de extração, outros fatores influenciam na diminuição do rendimento e, consequentemente, na alteração da composição dos constituintes do óleo são elas: as diferenças de temperatura, a geologia e a altitude [21].
Apesar do eugenol está em grande quantidade no óleo essencial da P. dioica, sabemos que a atividade antibacteriana está mais relacionada com o sinergismo do que com a classe funcional, a potência de grupos funcionais ou ao componente em si. Os achados do nosso estudo estão concordantes com o estudo realizado por Wang et al. [24] quando estes avaliaram que os óleos essenciais N. chinensis e V. officinalis da China, cujos componentes pertenciam em sua maior parte à classe dos monoterpenos e sesquiterpenos, apresentaram atividade antimicrobiana em três tipos de bactérias Gram-positivas (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus e Staphylococcus haemolyticus), e cinco Gram-negativas (Agrobacterium tumefaciens, Escherichia coli, Pseudomonas lachrymans, Salmonella typhimurium e Xanthomonas vesicatória).
Bactérias Gram-negativas diferenciam-se das Gram-positivas a partir da camada dual que estas possuem e as protege da ação de agentes antimicrobianos. Para penetrar na célula, a parte hidrofóbica do óleo essencial deverá atingir a membrana celular de modo a partir a camada lipídica. Quando isto é provocado, a permeabilidade aumenta e, consequentemente, a célula bacteriana é desestabilizada. Embora isso aconteça com a maioria dos compostos, esta ação é menor nos sesquiterpenos devido à baixa solubilidade deste em água [25-27].
No que diz respeito à potência do grupo funcional, sabemos que constituintes fenólicos tais como eugenol e timol são efetivos contra bactérias de origem alimentar [28]. A razão para isto está relacionada com a parte hidrofóbica do composto; as interações da ligação de hidrogênio dos fenóis com a água e, por conseguinte, sua constante de acidez; e a inativação de enzimas e materiais genéticos [29]. Como os componentes do óleo neste estudo pertencem a diferentes funções, a atividade antibacteriana não é exclusiva de um ou outro composto, mas sim da ação conjunta de todos, em um processo chamado de sinergismo [30].
É fato que a atividade antibacteriana de um óleo essencial é comprovada pelo tamanho dos halos de inibição. Em nosso estudo mostramos que o tamanho dos halos de inibição das bactérias tratadas com óleo essencial foi um pouco menor (variação de 11 a 21 mm) em relação aos antibióticos (variação de 8 a 40 mm). Apesar de baixos valores nos halos, é consenso entre os autores considerarem um composto com atividade antibacteriana aquele que possui um valor mínimo no diâmetro dos halos de inibição entre 8 e 10 mm em testes feitos pelo método de difusão em disco [31-33].
Geralmente, os valores baixos obtidos neste método estão relacionados com a velocidade de difusão. Como o óleo essencial é viscoso e possui baixa polaridade, este encontra dificuldade em se difundir no ágar, cuja natureza é hidrófila. Assim, por menor que sejam os valores dos halos, um óleo essencial sempre será considerado um bom agente antibacteriano [34].
Enquanto o agente antibacteriano a base de óleo essencial pode ter qualquer valor no tamanho dos halos, os antibióticos possuem um padrão. Como mostramos na tabela 3, a resistência das bactérias dependerá do tipo de antibiótico.
Em nosso estudo, observamos que algumas bactérias apresentaram resistência, concordando assim com os dados da literatura. O estudo realizado por Fernández-Delgado et al. [35] mostrou que a bactéria Proteus mirabilis isolada de ostras da costa Venezuelana resistiu à maioria dos antibióticos testados, entre eles a ampicilina, cefoxitina e tetraciclina. Já o estudo realizado por Stock et al. [36] mostrou a baixa sensibilidade da Serratia odorífera à tetraciclina, estreptomicina e espectinomicina. Enquanto os estudos de Gonçalves et al. [37] mostraram que a Escherichia coli foi sensível à vancomicina e resistente à tetraciclina, e o Staphylococcus aureus à vancomicina, cefoxitina e cloranfenicol.
Esta resistência acontece devido às sucessivas mutações que alteram a permeabilidade celular, à degradação celular dos antimicrobianos e às alterações de alvos celulares [38]. Apesar da resistência de algumas bactérias aos antibióticos, neste estudo mostramos que o uso do óleo essencial apresentou resultados de inibição semelhantes aos antibióticos. Portanto, devido a estas pequenas diferenças, concluímos que o óleo essencial da P. dioica tem potencial atividade antibacteriana e que pode ser utilizado tanto na indústria de alimentos quanto na farmacêutica.
CONCLUSÕES
Destilamos o óleo essencial das folhas da Pimenta dioica por hidrodestilação e concluímos que este é constituído em sua maior parte por monoterpenos e pelo composto eugenol, no qual apresentou atividade antibacterianas contra a Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa e Serratia odorífera.
