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INTRODUÇÃO
A radiação ultravioleta (UV) representa uma estreita faixa do espectro eletromagnético, entre 200 e 400 nm, sendo dividida em UV-C (100-280 nm), UV-B (280-315 nm) e UV-A (315-400 nm) [1].A exposição contínua a essa radiação é um dos fatores externos que mais contribui para a geração de radicais livres (RL), os quais, em excesso, provocam a desestabilização de biomoléculas e o desencadeamento de doenças como o câncer [2].
A exposição solar induz ao estresse oxidativo pela alta produção de RL e, posto que os mecanismos antioxidantes endógenos não conseguem suprimir de forma efetiva as ações deletérias dessas espécies reativas, uma estratégia que fornece à pele mecanismos de defesa contra a radiação solar é a utilização de antioxidantes naturais [3]. Os antioxidantes naturais são substâncias exógenos que podem atuar de forma sinérgica com os mecanismos endógenos, de maneira a suprimir efetivamente as ações deletérias dos RL, neutralizando essas espécies reativas e protegendo a pele [4].
Sabe-se que o emprego de metabólitos secundários vegetais tem a capacidade de estabilizar os RL. Dentre eles, chama-se a atenção para os compostos fenólicos, por possuírem grupamentos cromóforos em sua estrutura. Estes compostos promovem a absorção da radiação em comprimentos de onda compatíveis aos raios UV, mostrando-se adequados para a composição dos filtros solares [5, 6]. Os compostos fenólicos, para além da potencialização da proteção da pele contra a radiação UV, possuem também ação antioxidante, anti-inflamatória e imunossupressora [7].
Uma estratégia atualmente muito utilizada para ampliar o espectro de ação e aumentar a fotoestabilidade de filtros solares é a utilização de extratos naturais, ricos em compostos fenólicos, devido a sua capacidade de agir contra os radicais livres e absorver os fótons UV [8]. A estrutura química desses compostos permite doação de elétrons ou átomos de hidrogênio à outras moléculas, devido à presença das ligações duplas, que promove a deslocalização mais ampla do elétron não pareado. O efeito de ressonância que ocorre quando a molécula é excitada é tido como um dos motivos que justificam a capacidade antioxidante desses compostos [9, 10].
Nessa perspectiva, o uso de filtros solares naturais representa a diminuição da concentração de filtros solares sintéticos em formulações fotoprotetoras [11], promovendo redução do risco de reações cutâneas adversas, as quais muitas vezes estão relacionadas às altas concentrações de filtros artificiais [5]; redução da formação de subprodutos de fotodegradação, gerados a partir da associação de filtros sintéticos com o intuito de aumentar o fator de proteção solar (FPS) [8] e, consequentemente, a diminuição do impacto ambiental pela menor quantidade de resíduos dos filtros e estabilizadores UV, que podem alcançar o mar e águas subterrâneas [12-14].
Ao avaliar o desenvolvimento de protetores solares, a Food and Drug Administration (FDA), agência que regula o registro, produção e consumo de cosmético nos EUA, exige a determinação in vivo para a avaliação da eficácia de um filtro solar. Nesse estudo é verificada a dose mínima de energia UV necessária para produzir eritema na pele desprotegida que representa o valor do FPS [15, 16]. Entretanto, uma vez que os testes in vivo envolvem o uso de animais e humanos e, consequentemente, aspectos relativos à ética e à custo operacional elevado, tais experimentos devem ser analisados e discutidos [17].
Em alternativa, os testes in vitro, os quais empregam a análise instrumental físico-química, são amplamente utilizados para triagem [18]. Os testes in vitro têm boa aceitação durante a fase de desenvolvimento do produto, pois apresentam boa correlação com os ensaios in vivo, são economicamente viáveis, rápidos, não invasivos, mais seguros e atendem o aspecto ético [8, 19, 20]. Além disso, muitos estudos vêm utilizando metodologias in vitro com modelos biológicos, nos quais culturas celulares e bactérias geneticamente modificadas são empregadas com o intuito de predizer mecanismos de fotoproteção de inúmeros compostos, os quais frequentemente não podem ser preditos apenas pela análise instrumental [14, 21, 22].
Este trabalho buscou, por meio de uma revisão sistemática da literatura, analisar os métodos in vitro, instrumentais ou modelos biológicos, empregados para determinar a atividade fotoprotetora e antioxidante de compostos fenólicos e dessa forma, contribuir com o processo de escolha de cada método.
METODOLOGIA
Foi realizada uma pesquisa na base de dados Pubmed, em abril de 2020, de artigos publicados a partir de 2010. A figura 1 resume a metodologia empregada na seleção dos artigos, com base nos critérios previamente definidos, procurando atender aos objetivos do trabalho. Desse modo, a partir das palavras-chave photoprotection e phenolics compounds, foram inclusos trabalhos nos quais abordavam métodos in vitro empregados na avaliação de compostos fenólicos presentes, ou isolados, em extratos de plantas, frutos e líquens. Os dados de patentes, estudos de caso, revisões bibliográficas, estudo clínico e trabalhos que utilizassem apenas métodos in vivo foram excluídos.
Avaliação da ação fotoprotetora: métodos in vitro instrumentais e biológicos
A proteção da pele contra os raios UV é sem dúvida necessária para minimizar o aparecimento de doenças. Em geral, os filtros solares são classificados em filtros orgânicos e inorgânicos. Os orgânicos, devido à sua estrutura química, agem através de um mecanismo químico, absorvendo os raios UV de alta energia, convertendo-os em uma radiação de baixa energia. Já os inorgânicos, agem pela formação de uma barreira física que protegem a pele através da reflexão e dispersão dos raios que incidem sobre as partículas, fazendo com que estes voltem ou se dispersem [23].
Assim, predominantemente, a eficácia dos filtros solares é avaliada a partir da determinação do FPS e, também, pelo escurecimento persistente do pigmento (PPD) in vivo [20]. Entretanto, a utilização de métodos instrumentais como metodologia in vitro, a exemplo da espectrofotometria, é bastante comum na triagem de filtros solares para o desenvolvimento de novos produtos [17].
A espectrofotometria de absorção molecular, na região do UV ou visível, baseia-se na capacidade que algumas substâncias têm de absorver luz e, portanto, consegue determinar a absortividade de moléculas orgânicas, quando uma luz é incidida. Segundo a Lei de Lambert-Beer, a capacidade de absorção da luz é proporcional a concentração das moléculas e da espessura do meio atravessado, sendo a transmitância inversamente proporcional a absorvância [24]. A partir desses princípios são calculados os valores de absorvância e transmitância de filtros solares e, posteriormente, o FPS teórico.
Dentre os métodos espectrofotométricos empregados para a determinação do FPS, o estudo de Mansur et al. [24] mostra-se um dos mais utilizados, devido a simplificação e rapidez no cálculo do fator de proteção. A partir desse trabalho foi proposta a fórmula apresentado na equação 1, que se baseia na construção de uma curva de absorção de filtros solares dentro do espectro da radiação ultravioleta. Nessa proposta, multiplica-se os valores de absorvância dentro do espectro de 290 a 320 nm, com aumento de 5 em 5 nm, e o somatório do efeito eritematógeno final é multiplicado pelo fator de correção (FC) padrão 10, obtido a partir da determinação do FPS de um creme contendo 8 % de homosalato (HMS), que é padronizado internacionalmente como valor de FPS 4.
Validando esse método, no trabalho de Mota et al. [25] foi observado que a alteração do veículo utilizado promove alteração no valor do fator de correção. Assim, utilizando uma amostra padronizada de HMS a 8 %, foi obtido o FC de 10,24.
Em que: FC = fator de correção (= 10), estimado a partir da amostra que contém 8 % de salicilato de homomentila (homosalate); EE(λ) = efeito eritematógeno da radiação solar a cada comprimento de onda (λ); I(λ) = intensidade da radiação solar a cada comprimento de onda (λ); Abs(λ) = leitura espectrofotométrica da absorbância da solução da amostra a cada comprimento de onda (λ).
Ainda, no que se refere a metodologias instrumentais, Diffey e Robson [26] propuseram um método baseado em medições espectrofotométricas, o qual considera o espectro de transmitância. Para isso é aplicado o protetor solar em camada fina e homogênea em uma fita de Transpore", na faixa de 290 a 400 nm. Desse modo, aspectos como espalhamento, espessura e homogeneidade do protetor solar na placa e experiência do analista são fatores críticos que alteram os resultados do FPS [17]. Corroborando essa metodologia, em 2017, Cvetkovska et al. [17] realizaram um estudo que utilizou, além das fitas de Transpore" (método 1), placas de polimetilmetacrilato (PMMA) (método 2), como suporte para aplicação de uma quantidade de protetores solares comerciais, em diferentes viscosidade, valores de FPS e pressões de aplicação do produto. Ambos os métodos forneceram resultados reprodutíveis e ótima correlação in vivo.
A fórmula demonstrada na equação 2 foi utilizada por Cvetkovska et al. [17], baseado no trabalho de Diffey e Robson [26], para calcular o valor de FPS e poder comparar os resultados in vitro com o método in vivo e estabelecer a correção entres ambos.
Em que: E (λ) = espectro de ação do eritema no comprimento de onda λ; I (λ) = irradiância espectral recebida da fonte de UV no comprimento de onda λ; A (λ) = absorvância monocromática da camada de produto de teste no comprimento de onda 2; d (λ) = passo do comprimento de onda (1 nm).
Além do FPS, outro parâmetro in vitro que pode ser analisado é o comprimento de onda crítico (cl), o qual determina o espectro de ação do produto fotoprotetor na faixa de comprimento de onda de 290 a 400 nm [8]. Esse é o comprimento de onda em que a integral da área sob o espectro de absorção da amostra atinge 90% da absorção total [20]. O FDA considera esse parâmetro como instrumento para a avaliação da proteção UV-A e determina que para ser considerado protetor solar de amplo espectro o cl mínimo seja de 370 nm [8].
Segundo o estudo realizado por Polanini etal. [20], o fator de proteção UV-A (FPU-V-A) foi obtido a partir da utilização dos resultados do seu FPS, pela técnica de transmitância difusa in vitro, por meio do cálculo da dose de irradiação (D), obtendo o PPD e a FPUV-A teóricos, calculado pela equação 3. Além disso, os pesquisadores ainda determinaram o cλ e a relação UV-A/UV-B.
Em que: P(l) é o espectro de ação PPD; A(l) é a absorvância monocromática média do produto de teste.
Como mostrado, a espectrofotometria apresenta-se como uma técnica bastante empregada para a determinação da fotoproteção e seus parâmetros. Dentre os artigos analisados, cerca de 82% utilizaram ensaios instrumentais, sendo que 69% seguiram a metodologia proposta por Mansur et al. [24] e 31% basearam-se no método de Diffey e Robson [26]. Essa ferramenta representou excelente ganho na obtenção dos valores de FPS de filtros solares, em razão da sua rapidez e simplicidade de execução, além da boa correlação dos resultados com testes in vivo [17, 27, 28] e, ainda, pela possibilidade de utilização de solventes não tóxicos, seguros para os operadores, reforçando a importância da química analítica verde [29].
Entretanto, não podemos deixar de pontuar as limitações dos métodos espectrofoto-métricos, principalmente, aquelas relacionadas à fatores extrínsecos. Esses fatores estão associados aos diferentes solventes nos quais os filtros solares são dissolvidos, à combinação e concentração dos filtros solares ativos, à interação do veículo com os componentes da formulação, ao pH e propriedades reológicas, ao tipo de espectrofotômetro utilizado e a rugosidade do substrato [19, 30].
O emprego de métodos biológicos, principalmente, de culturas de células dérmicas humanas ou de modelo murino, surge como uma proposta que vem sendo cada vez mais explorada. Esses métodos ampliam o olhar sobre os danos causados à pele e como as substâncias naturais podem contribuir nesse processo [31]. Dentre os trabalhos analisados, 32 % utilizaram os métodos biológicos in vitro para avaliar a atividade fotoprotetora [5, 13, 20-23, 32-45], 7 desses trabalhos utilizaram tanto os métodos instrumentais quanto os métodos biológicos para essa finalidade [14, 32, 34, 36-39].
Os ensaios biológicos empregados, categorizados na tabela 1, possibilitam determinar a viabilidade celular, fototoxicidade, genotoxicidade e quantificação de espécies reativas de oxigênio (ROS) intracelular, a partir da exposição de células a diferentes doses de radiação UV, por um determinado período [7, 35].
Tabela 1 Ensaios biológicos empregados na avaliação da atividade fotoprotetora de extratos vegetais.
O estudo desenvolvido por Almeida et al. [21] demonstrou a potencial atividade fotoprotetora do extrato hidroetanólico das folhas de Castanea sativa, devido a sua capacidade antioxidante direta e indireta, que ativa o sistema antioxidante endógeno. Para isso, foi realizado o ensaio com o sal brometo de 3-4,5-dimetil-tiazol-2-il-2,5-dife-niltetrazólio (MTT) e o corante azul de tripano para avaliar a viabilidade celular. Aação protetora do extrato foi calculada a partir da contagem de células viáveis após exposição aos raios UV-A. A avaliação do dano ao DNA foi observada a partir do número de micronúcleos formados quando as células eram expostas à radiação e também pela quantificação da proteína NRF2 e de genes que codificam a expressão de enzimas que protegem o corpo de ROS intracelulares.
Bacarin et al. [44] usaram outra metodologia para avaliar a extensão de danos ao DNA celular. O teste Cometa consiste em eletroforese em gel de célula única, na qual as células, após serem expostas à radiação UV, são lisadas para exposição do material genético e incubadas em solução tampão alcalina para que haja o desenrolamento do DNA e a observação de suas zonas de quebra, a partir da utilização de soluções fluorescentes. É determinada, posteriormente, a porcentagem de DNA em cauda, demonstrando a capacidade de fotoreparo do extrato teste.
Ainda sobre a avaliação dos danos ao DNA, Hu et al. [35] observaram a capacidade de fotoreparo dos oxyresveratrol e kuwanon O, isolados das raízes de Morus australis. Nesse estudo foi constatado que o tratamento prévio com ambos compostos fenólicos, em queratinócitos epidérmicos humanos, conseguiram diminuir os níveis de CPD e 8-OHdG, reduzindo a oxidação que o DNA sofre quando exposto a radiação UV, resultando na proteção do material genético dessas células. A quantificação desses compostos danosos ao DNA foi realizada por imunoensaio enzimático.
Inúmeras metodologias podem ser utilizadas para a determinação da atividade antioxidante de extratos, utilizando cultura de células que sofreram irradiação UV. Hu et al. [35] utilizaram o peróxido de hidrogênio como indutor de ROS e a quantificação de nitrosamina, formada quando queratinócitos são expostos a radiação UV-A, para a avaliação a atividade fotoprotetora. Nos trabalhos de Svobodová et al. [7] e Baldívia et al. [43], foi empregado o 2',7'-diclorodihidrofluoresceína diacetato (H2DCFDA), indicador da formação de ROS. Também foi quantificado, por espectrofotometria, o nível de glutationa intracelular a partir da reação com ácido 2,2'-dinitro-5,5'-ditiobenzoico (DTNB) [7].
Os métodos biológicos descritos conseguiram avaliar a capacidade dos ativos em proteger as células e o DNA contra a radiação UV [22, 45]. Além disso, possibilitaram a elucidação do mecanismo de proteção e a influência que ROS possuem nos efeitos deletérios para as estruturas celulares [21].
Entretanto, o desenvolvimento e validação de bioensaios envolve diversos desafios, uma vez que ele visa demonstrar respostas de organismos vivos, a partir de técnicas in vitro. Dessa forma, para garantir a reprodutibilidade, precisão e acurácia é necessário conhecer, detalhadamente, o mecanismo que envolve e seu alvo de estudo, para estabelecer os pontos críticos que devem ser avaliados e controlados no decorrer do processo. Por esse motivo, características como: manutenção da viabilidade da cultura celular, reagentes utilizados, sensibilidade das técnicas, que envolvem comumente sinais colorimétricos, luminescentes ou fluoriométricos, devem ser constantemente analisadas [46].
Métodos in vitro para avaliação da atividade antioxidante
A exposição à radiação solar é responsável pela formação de RL. A interação entre os raios UV e espécies endógenas cromóforas como ácidos nucleicos, aminoácidos aromáticos, porfirinas, heme entre outras, geram moléculas instáveis e extremamente deletérias como os ROS e espécies reativas de nitrogênio (RON) [7]. A figura 2 demonstra como ocorre a formação, por exemplo, dos ROS.
O acúmulo dos RL provoca degradação de biomoléculas, oxidação dos lipídios presentes nas membranas celulares, indução do processo inflamatório, imunossupressão, além de danos extensos ao DNA [21], podendo ocasionar queimaduras, envelhecimento precoce e, no pior dos casos, câncer de pele, que, embora tenha causa multifatorial, tem na exposição excessiva à radiação UV um dos fatores agravantes a predisposição dessa patologia [43].
A exposição solar é um dos fatores externos que ocasiona a ativação do sistema de defesa da pele formado, principalmente, por enzimas e antioxidantes endógenos, responsáveis pela proteção. Um dos primeiros eventos que ocorre após a exposição ao sol é a pigmentação da pele. A pigmentação acontece porque há a ativação melanogênica e de enzimas, como tirosinase e tirosina quinase, as quais promovem a síntese de melanina. Essa proteína é responsável pela coloração e proteção da pele, posto queabsorve parte da energia transmitida pelos raios solares e ativa citocinas pró-inflamatórias que desencadeiam uma cascata de reações no organismo. O processo de pigmentação da pele é especialmente estimulada após a exposição à radiação UV-B, por atingir as camadas mais superficiais [4]. Paralelamente à exposição da pele aos raios UV e à formação de RL, há o estabelecimento do estresse oxidativo que propicia a produção e ativação de antioxidantes enzimáticos, como superóxido dismutase, glutationa peroxidase e catalase, assim como, antioxidantes endógenos não-enzimáticos, capazes de neutralizar ROS e RON, protegendo as células e outras biomoléculas da oxidação [4]. Especialmente a gluta-tiona, antioxidante não-enzimático, consegue inativar os RL pela doação de elétrons e também é um cofator de vários antioxidantes endógenos, tornando-se peça-chave para a eficiência no processo de proteção do organismo [42].
A atividade antioxidante pode ser avaliada utilizando metodologias in vitro e in vivo. Em geral, os testes in vitro avaliam a capacidade de inibição de enzimas e a redução de radicais livres [43].
A figura 3 apresenta os ensaios in vitro realizados para a determinação da ação antioxidante em produtos de origem natural, a partir dos 32 estudos selecionados. Dentre os métodos empregados observa-se que: 93,8 % (n=30) dos estudos utilizaram o método radical l,l-diphenyl-2-picrylhydrazyl-a,a-diphenyl-bpicrylhydrazyl(DPPH) [6, 10-13, 20, 25, 26, 35-37, 45-62]; 28,1 % (n=9) o radical 2,20-azinobis-3-ethylbenzothiazo-line-6-sulphonic acid (ABTS) [38, 40, 41, 54, 55, 59, 60]; 15,62 % (n= 5) o ensaio de peroxidação lipídica [4, 10, 54, 61, 62]; 12,5 % (n=4) o ensaio do poder redutor-an-tioxidante férrico (FRAP) [38, 40, 57, 60]; 9,375 (n= 3) o ensaio de branqueamento de β-caroteno [9, 56, 63]; 6,25 % (n= 2) o ensaio da capacidade total antioxidante (TAC) [38, 40]; 6,25 % (n= 2) ensaio da capacidade de absorção de radical de oxigênio (oRAC) [57, 61]; 6,25 % (n= 2) o ensaio de fosfomolibidênio [40, 60]; e 3,13 % (n= 1) o ensaio de fotoquimiluminescência [57].
Figura 3 Frequência e métodos in vitro utilizados para a determinação da ação antioxidante em produtos de origem natural. DPPH: radical 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl-a, a-diphenyl-bpicrylhy-drazyl; ABTS: radical 2,20-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonicacid; TAC: ensaio da capacidade total antioxidante; ORAC: ensaio da capacidade de absorção de radical de oxigênio; FRAP: ensaio do poder redutor-antioxidante férrico.
Além disso, observou-se que 50 % dos estudos utilizaram dois ou mais métodos associados para a avaliação antioxidante. Em geral, o ensaio do radical DPPH era associado a outro método. de acordo com alguns autores [18, 64], para a garantia de resultados mais fiéis quanto a atividade antioxidante é necessário a utilização de dois ou mais modelos. A comparação entre os resultados obtidos melhora a capacidade de predizer a atividade antioxidante in vitro dos compostos.
Quando se discutem os métodos in vitro que avaliam a capacidade antioxidante de um composto, podemos encontrar ensaios que se baseiam na transferência de um único elétron (SET) ou ainda, ensaios que conseguem medir a transferência de átomos de hidro gênio (HAT). Dentro de cada grupo, temos diversos ensaios que possuem o mesmo mecanismo de ação, diferindo entre si, quanto a sua cinética de reação, assim como em relação as vantagens e desvantagens que cada um apresenta. O ensaio SET engloba, a determinação do conteúdo fenólico total (TPC), radical livre DPPH, poder antioxidante redutor férrico (FRAP), o ensaio de redução de cobre (CUPRAC) e o radical livre ABTS. Já o ensaio HAT, abrange os testes que aferem a capacidade de absorção do radical de oxigênio (ORAC), a oxidação de lipídeos e o parâmetro antioxidante de captura total de radicais (TRAP )[65].
O ensaio que utiliza o radical DPPH é um método bastante difundido, devido, principalmente, ao seu baixo custo e rapidez, automatização, reprodutibilidade e estabilidade. Nesse método, tem-se a presença de um agente antioxidante, ocasionando uma conversão de cor, do violeta para o amarelo claro, e sua concentração é medida por meio da espectrofotometria [64]. Deste modo, quanto maior for a intensidade da descoloração, maior a atividade antioxidante do agente testado.
No entanto, algumas problemáticas são encontradas na utilização dessa metodologia. O uso de concentrações variadas de DPPH, incubação, volume de amostra, sistemas de solventes e interferência do pH na determinação da concentração inibitória para atingir 50 % do efeito máximo (IC50), além da tendência não linear entre a concentração de antioxidante e DPPH com a eliminação de ROS, são problemas que podem ocorrer. Para isso, é necessário que haja padronização dessas condições para garantir a precisão do teste. de acordo com Tan e Lim [65], condições que podem contornar algumas dessas problemáticas seriam a utilização de 50 jxM de DPPH; ambiente com pouca luz ou ao abrigo da luz; metanol como solvente para amostras menos polares ou metanol tamponado para aquelas mais polares; o padrão recomentado é o ácido ascórbico por ter um cinética de reação similar ao DPPH.
Em estudo feito por Mansur et al. [18], foi apontado uma outra limitação para o ensaio do DPPH. Esse ensaio, em geral, não é realizado para avaliar a atividade antioxidante de uma formulação, uma vez que, nem todos os componentes da formulação serão completamente solubilizados e, dessa forma, interfeririam nas medições espectrofotométricas. Portanto, seu uso fica mais restrito a análise de compostos isolados.
O método que utiliza o radical ABTS é similar ao teste feito com o DPPH. O ABTS é oxidado por radicais peroxil ou outros oxidantes, na presença de peróxido de hidrogênio, gerando um radical intensamente colorido, o qual é determinado por espectro-fotometria [66]. Esse radical apresenta algumas vantagens, a exemplo da solubilidade em solventes aquosos e orgânicos, ampliando a possibilidade de avaliar compostos lipo-fílicos e hidrofílicos; tem estabilidade em ampla faixa de pH, e não é afetado por forças iónicas. Porém, este método apresenta algumas limitações, entre elas a demora em alcançar o ponto final da reação que ocorre entre o radical e o produto teste, gerando muitas vezes valores da capacidade antioxidante inferiores e falseados; esse método deve ser, quase sempre, associado a outros métodos, pois não consegue quantificar com precisão a capacidade antioxidante sozinho, visto que não considera as taxas de reação [65, 66].
A capacidade dos compostos fenólicos em reduzir completamente os íons de ferro é utilizada no ensaio Ferric Reducing-Antioxidant Power (FRAP), para estimar a atividade antioxidante. Neste ensaio, é usado o complexo amarelo férrico de tripiridiltriazina (Fe (III) -TPTZ), o qual sofre redução, formando o complexo azul ferroso de tripiridiltriazina (Fe (II) -TPTZ). A partir da coloração azul que é observada, emprega-se a espectrofotometria para quantificar o poder de redução. O FRAP tem como vantagens, a simplicidade, rapidez, baixo custo, robustez e a possibilidade de automação. Entretanto, problemas como, a quelação desses complexos quando é utilizado extratos de alimentos e a taxa reacional lenta, a qual resulta em reações incompletas, podem ocorrer e limitar o poder antioxidante de determinada substância [66].
O ensaio de fotoquimiluminescência fundamenta-se na geração do radical livre superóxido, a partir da excitação óptica de um fotossensibilizador, como por exemplo o luminol. Esse teste tem como vantagens a não utilização de um agente oxidante e de altas temperaturas para gerar radicais livres, é rápido e bastante sensível. No entanto, existe uma baixa correlação dos seus resultados com outros ensaios como, por exemplo, ORAC e FRAP, além de dificuldade de interpretação dos resultados, por não se ter conhecimento do mecanismo reacional completo [66]. Esses fatores, podem justificar sua baixa utilização na prática laboratorial, conforme demonstra esta revisão.
O teste de branqueamento do β-caroteno tem como mecanismo a inibição da descoloração de carotenoides, quando exposto a luz ou devido à presença radicais peroxil. Nesse teste o ácido linoleico é oxidado pelos radicais livres presentes no meio, estimulado pelo 2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) ou peróxido de hidrogênio. Os subprodutos formados iniciam a autoxidaçãodo β -caroteno [64]. Este é um método rápido e com uma abordagem cinética que elava a precisão na triagem de agentes antioxidantes, porém, a descoloração do β-caroteno pode acontecer por várias vias e dificultar a interpretação dos resultados. Desse modo, tem-se buscado utilizar o carotenoide crocina, que tem absorvância extremamente forte na faixa do visível e sofre branqueamento apenas sob o ataque deperoxil [66].
Outra forma de avaliar quantitativamente a capacidade antioxidante de um composto natural é o teste do complexo de fosfomolibdênio. Esse método baseia-se na redução do molibdênio, em pH ácido, formando um complexo verde, fosfato de molibdênio, mensurado por espectroscopia UV [64]. Devido à sua simplicidade e aos reagentes baratos, esse método torna-se uma alternativa para avaliação da capacidade antioxidante total [67].
RESULTADOS E DISCUSSÕES
A radiação UV consegue penetrar na pele humana em diferentes proporções, dependendo do seu comprimento de onda e energia. Sabe-se que 95-99 % dos raios que atingem a pele são do tipo UV-A, o qual tem maior capacidade de penetração nas células [7]. A radiação UV-A é capaz de gerar mais estresse oxidativo e causar dez vezes mais a peroxidação lipídica [6], induzir à formação de dímeros de pirimidina de ciclobutano (CPD) na camada basal e o acúmulo de 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina (8-OHdG), sendo potencialmente capaz de gerar danos genéticos e mutações nas camadas mais profundas da epiderme [35]. É também nessa região energética que os filtros solares demonstram maior instabilidade [6].
Os raios UV-B atingem principalmente as camadas mais superficiais da pele, sua penetração é menor, se comparado aos fótons UV-A, no entanto, são mais deletérios, passíveis de causar, além de queimaduras solares e inflamação, alterações no ciclo celular, provocando o surgimento de câncer [22]. Quanto aos raios UV-C, em sua grande maioria, são absorvidos pela camada de ozónio e, portanto, não atingem a terra [35].
Desse modo, de acordo com os estudos in vitro selecionados, apresentados nas Tabelas 1 e 2, foi possível observar que as atividades fotoprotetora e antioxidante dos compostos fenólicos estão relacionadas com a concentração de fenólicos totais e os tipos de compostos fenólicos presentes nos extratos vegetais. Estruturalmente, essas atividades biológicas dos compostos fenólicos, cuja estrutura básica é demonstrada na Figura 4, relacionam-se com o alto peso molecular e alto grau de hidroxilação no anel aromático, influenciam nos resultados obtidos, pois relacionam-se com a capacidade de doar elétrons e poder antioxidante [43].
Tabela 2 Relação de plantas e frutos contendo compostos fenólicos que apresentaram ação fotopro-tetora e antioxidante a partir de métodos instrumentais utilizados na literatura.
Legenda: não relatado (n.r.), filtro UV natural (FN), antioxidante (A), fotoproteção sinérgica (FS).
*Apenas o extrato Dalbergia monetária apresentou FP S igual ou superior a 6,0.
**O critério utilizado na classificação da atividade fotoprotetora foi baseado no que e preconizado pelo FDA, na qual determina que o FPS 2 como valor mínimo para um filtro solar em produtos acabados[16]. Desse modo, os trabalhos que tiveram extratos com FPS igual ou maior que 2, foram considerados Filtros UV naturais (FN), aqueles que tiveram a capacidade de incrementar o FPS na presença de um filtro solar sintético foram considerados como apresentando fotoproteção sinérgica (FS).
Nesse cenário, os extratos naturais elencados na tabela 2 com função de proteção solar e antioxidante apresentaram elevadas concentrações desses compostos [6-8, 11, 13, 19, 26, 35, 36, 38, 44, 50, 57-59, 61, 67] e, consequentemente, maiores valores de FPS. Entre esses estudos citados, constatou-se que 82 % dos extratos, também apresentaram ação antioxidante, associada a fotoproteção.
Dentre os principais grupos de compostos fenólicos, ácidos fenólicos, flavonoides, estilbenos, lignanos e taninos, observa-se em sua estrutura básica, um anel aromático contendo uma ou mais hidroxilas [10] (figura 5). Tem sido constantemente levantada a hipótese que a capacidade antioxidante dos fenólicos está diretamente relacionada com o número de hidroxilas livres [69]. Nessa perspectiva, espera-se que compostos com maior capacidade de doar elétrons, apresentem maior atividade antioxidante.
Figura 5 (a) Estrutura química básica dos ácidos fenólicos, (b) flavonoides, (c) estilbenos, (d) lignanose e (e) taninos.
Para Stevanato et al. [10], ao avaliar a ação fotoprotetora dos estilbenos, flavonoides e derivados do ácido hidroxicinâmico, além da alta capacidade de absorção UV desses compostos, as diferenças na estrutura molecular e na massa, corroboram com diferentes valores de absorvância molar e comprimento de onda máximo, confirmando que essas características devem ser levadas em consideração ao determinar a eficácia da molécula em proteger ou não a pele da luz solar [10].
Diferentemente, alguns extratos contendo compostos fenólicos em sua composição ou ainda, que apresentaram capacidade de absorção UV, não tiveram atividade fotoprotetora significativa. Foram encontrados 3 trabalhos (8,3 %) [53, 57, 71], nos quais os extratos botânicos não conseguiram alcançar FPS maior que 6,0, tendo baixo potencial como filtros solares naturais. Segundo Ramos et al. [53], a intensidade de proteção solar que um extrato pode oferecer, depende da quantidade de grupos cromóforos, do intervalo de absorção, da concentração e comprimento de onda. Isso justifica o fato de que nem todos os extratos que possuem compostos fenólicos em sua composição apresentam boa atividade fotoprotetora.
Foi observado que 28 % dos trabalhos selecionados apresentaram extratos vegetais com capacidade de incrementar a ação fotoprotetora [1, 10, 12, 13, 17, 35, 41, 72, 73]. Esse incremento foi evidenciado a partir do aumento do FPS, quando os extratos foram associados aos filtros solares sintéticos. Isso está relacionado efeito sinérgico de muitos compostos naturais, é uma proposta interessante a ser explorada.
Diante da perspectiva de desenvolvimento de produtos voltados à fotoproteção tópica, é possível identificar problemáticas no que diz respeito a garantia da eficácia de um fotoprotetor [57]. Segundo Baldisseretto et al. [57], embora os filtros solares sejam úteis, eles não conseguem proteger a pele de modo integral e, sugere ainda, que as causas para isso são a incorreta aplicação, a proteção incompleta e a toxicidade de filtros sintéticos. Assim, durante o desenvolvimento do produto fotoprotetor, deve-se atentar a questões relacionadas ao surgimento de sensibilização dérmica, fotoirritação, fotoestabilidade e compatibilidade de filtros solares, que são problemas que afetam diretamente na aceitabilidade do produto por parte do consumidor e, consequentemente, sua utilização adequada, além da sua eficiência [13, 14, 22].
Outra questão relevante, refere-se a fotoestabilidade que é de grande importância, pois além de delinear a eficácia da ação requerida, ela mensura, também, a segurança dos filtros solares, posto que a instabilidade reduz a capacidade de fotoproteção e pode gerar compostos de degradação com potencial de toxicidade. Um exemplo é o Butyl-methoxydibenzoylmethane, filtro orgânico sintético UV-A, considerado instável, pois é degradado em aproximadamente 50 a 90% após 60 min de exposição aos raios UV [13], sofrendo tautomerização e, em consequência, perdendo sua eficácia, para além de gerar produtos da fotodegradação [8].
Sendo assim, ao avaliar os métodos empregados na avaliação das atividades de fotoproteção e antioxidante, observa-se métodos tradicionalmente aplicados, os quais apresentam limitações que já foram estabelecidas ao longo do tempo. No entanto, ainda existe a necessidade de estudos que aumentem a performance dessas técnicas, que esta beleçam sua correlação com métodos in vivo, pois isso garante maior precisão, exatidão e reprodutibilidade, que validem os resultados encontrado, podendo representar um avanço nos requisitos de registros de produtos fotoprotetores.
Ao passo que, os modelos biológicos podem ser considerados alternativas para presumir in vitro, de forma mais detalhada e consistente, o que ocorre a nível biológico, visto que é possível identificar e traçar mecanismos de ação das substâncias. Portanto, a associação de métodos instrumentais e biológicos deve ser estimulada, a fim de aumentar a qualidade das análises realizadas.
CONCLUSÃO
A partir dos estudos analisados, conclui-se que os compostos fenólicos, em especial os flavonoides, possuem potencial ação fotoproteção e antioxidante, uma vez que, plantas e frutos com elevadas concentrações destes compostos podem promovera defesa do organismo contra os danos causados pelos raios ultravioleta. Assim, a utilização de produtos naturais, ricos dessas substâncias, revela-se uma estratégia interessante para melhoria na proteção solar.
A utilização de métodos instrumentais, baseados nos princípios da absorvância e trans-mitância molecular, deve ser bastante encorajada, pois apresenta correlação in vivo e permite realizar a triagem de filtros solares, economizando tempo e recursos.
Já a utilização de métodos biológicos é uma alternativa pertinente para avaliar os efeitos mais profundos que a radiação UV pode desencadear na pele humana, uma vez que permite avaliar os danos ao DNA, a viabilidade celular e a inativação ou ativação de enzimas relacionadas ao mecanismo da apoptose entre outros aspectos, que somados aos dados obtidos com a utilização dos métodos instrumentais de avaliação da fotoproteção e da atividade antioxidante, conseguem predizer as atividades biológicas e identificar possíveis compostos naturais que podem ser empregados na indústria cosmética e farmacêutica como filtros solares, antioxidantes e até antitumorais.
