Implementacion de tecnicas de control de calidad para la produccion de un bioplaguicida a base del granulovirus de Phthorimaea operculella PhopGV

Implementation of quality control techniques for the production of a biopesticide based on the granulovirus Phthorimaea operculella PhopGV

LAURA VILLAMIZAR¹, JEAN-LOUIS ZEDDAM²; CARLOS ESPINEL¹ ALBA MARINA COTES¹

¹Autores para correspondencia: Investigadores. Programa MIP. Corporacion Colombiana de Investigacion Agropecuaria, Corpoica, Km 14 via Mosquera, acotes@corpoica.org.co

² institut de Recherche pour le Developpement - IRD, 213, rue La Fayette, 75480 Paris cedex 10, zeddam@ecnet.ec

Resumen. La polilla guatemalteca de la papa Tecia solanivora (Lep.; Gelechiidae) es una de las plagas mas limitantes del cultivo en Venezuela, Colombia y Ecuador y se revela como de dificil control mediante el uso de insecticidas quimicos. Su control biologico con el granulovirus de Phthorimaea operculella (PhopGV) ha sido, tanto en Colombia como en otros paises andinos, uno de los principales componentes para su manejo. Corpoica posee con una planta, registrada ante el lnstituto Colombiano Agropecuario, para manufacturar un bioplaguicida a base de este virus. Dada la importancia que tiene la confirmaciòn de la calidad del producto, el objetivo del trabajo fue estandarizar e implementar pruebas de control de calidad en el proceso productivo. Se fijaron como parametros criticos la identidad y concentracion del virus, las caracteristicas fisicoquimicas del producto y su actividad biocontroladora: posteriormente se estandarizaron metodologias para evaluar dichos parametros y se implementaron estos controles en el proceso productivo. Se confirmo la identidad del virus como P. operculella por metodos microscopicos, inmunologicos y moleculares. Para controlar la concentracion del virus, se determinaron las concentraciones letales del virus y se fijo el rango de aceptaciòn de dicha variable. El bioplaguicida se elaboro con base en los resultados. La concentracion letal noventa fue de 8 x 10⁵cuerpos de inclusion (CI).mL^-1 en consecuencia, el producto terminado se adapto para presentar una concentracion de 10⁵ Cl.g^-1. El control de calidad de tres lotes elaborados presento baja variabilidad indicando la repetibilidad del proceso. Las caracteristicas promedio de los lotes fueron una concentracion de 10⁵ Cl.g^-1, humedad del 0.57%, voluminosidad 0.93mL.g^-1, pH 9.52 y eficacia del 97.25%.

Palabras clave: Baculovirus. Control biologico. Polilla guatemalteca de la papa.

Summary. The Guatemalan potato moth Tecia solanivora (Lep.; Gelechiidae) is one of the most limiting pests of this crop in Venezuela, Colombia and Ecuador and its control through the use of chemical insecticides has not been very effective. Its biological control with the granulovirus Phthorimaea operculella (PhopGV) has been one of the principal components of its management in Colombia and other Andean countries. Corpoica has a plant, registered through the Colombian Agricultural Institute, for manufacturing a biopesticide based on this virus. Given the importance of confirming product quality, the objective of this work was to standardize and implement quality control tests during the manufacturing process. Virus identity and concentracion, physical-chemical characteristics of the product and biopesticide efficacy were established as critical parameters; methodologies for evaluating these parameters were then standardized and implemented in the production process. Virus identity was confirmed as P. operculella by microscopic, immunological, and molecular techniques. To control viral concentracion, lethal viral concentracions were determined and acceptable limits for this variable were established. The biopesticide was elaborated based on these results. The lethal concentracion (LC₉₀) was 8 x 10⁵ occlusion bodies (OB).mL^-1 and based on this result, the final product was adapted to give a concentracion of 10⁵OB.g'. Three batches of the product were manufactured and quality control showed low variability, indicating the repeatability of the process. Mean product characteristics were concentracion 10⁵OB.g^-1, moisture content 0.57%, voluminosity 0.93 mL.g^-1, pH 9.52 and efficacy 97.25%.

Key words: Baculovirus. Biological control. Guatemalan potato tuber moth.

La"Polilla guatemalteca dc la papa" Tecia solanivora (Povolny) 1973, originaria de Centro america, pertenece al complejo de polillas o palomillas quo ataca al cultivo de la papa y es considerada como una de las principales plagas de dicho cultivo en la region Andina si se tiene en cuenta el daño que ocasiona al tuberculo tanto bajo condiciones de campo como de almacenamiento (Niño y Notz 2000).

Frente a esta problematica, se han genesado varios componentcs para su control, dentro de un Programa de manejo Integrado de Plagas de la Papa (MIPP), tales como el control cultural, el etologico y el quimico. Sin embargo, la medida mas utilizada por los agricultores sigue siendo el uso indiscriminado de productos quimicos, de los cuales muchos son de categoria toxicologica I, es decir extremadamente toxicos y la mayoria son ineficientcs para el control del insecto (Niño y Notz 2000).

Una alternativa promisoria para su control es el uso del granulovirus de Phthorimaea operculella, un virus perteneciente a la familia Baculoviridae, el cual es altamente especifico y ha sido considerado con otros virus por la Organizacion para la Agricultura y la Alimentacion (FAO) y la Organizacion Mundial de la Salud (OMS) como la herramienta mas promisoria para el control de plagas (CIP 2000).

Este virus interactua inicialmente con su hospedero a nivel intestinal lo que implica que para que se infecten las larvas es necesario que las particulas virales sean ingeridas. Posteriormente, las larvas se vuelven lentas en sus movimientos, se retrasa su crecimiento, toman una coloracion blanca, se produce la desintegracion de los tejidos internos y la muerte ocurre entre los 12 y 21 dias, no llegando ninguna larva al estado de pupa (CIP 2000).

Para la multiplicacion del virus se emplean larvas del hospedero, las cuales cuando estan infectadas, se muelen en fresco, congeladas, secas o liofilizadas. El Centro Internacional de la Papa (CIP), desarrollo una formulacion en forma de polvo seco para proteccion de semilla en almacenamiento, la cual consiste en macerar 20 larvas infectadas y diluirlas en un litro de agua. Esta preparacion se mezcla manualmente con un kilo dc material inerte tal como talco, caolin, etc., hasta obtener una pasta que se extiende sobre un plastico en una superficie horizontal protegida de la luz para secarla al ambiente y despues de dos semanas, se muele con un rodillo manualmente hasta obtener un polvo que es empacado y distribuido para su uso (CIP 2000). Sin embargo, este proceso artesanal puede dar origen a productos de calidad variable ya que no se conoce la concentracion viral del producto, no se conocen sus concentraciones efectivas y las operaciones de manufactura no incluyen ningun tipo de control durante el proceso (Zeddam et al 2003).

En Corpoica, desdc su existencia, se establecidas el Laboratorio de Control Biologico como apoyo al Programa Nacional de Manejo Integrado de Plagas (MIP). La funcion de este laboratorio es la de hacer investigacion y desarrollar bioplaguicidas. En el año 2000, este laboratorio se enfrento al reto dc producir el producto a base de baculovirus, para responder a la emergencia sanitaria causada por la polilla guatemalteca. Inicialmente se obtuvo la cepa del virus proveniente de la Secretaria de Agricultura de Boyaca y se adopto la tecnologia de formulacion desarrollada por el CIP. Sin embargo, dicho proceso artesanal no permitia asegurar la calidad de los diferentes lotes de produccion, presentandose inconsistencias en los resultados de eficacia del producto. Por tales razones y con miras a producir cantidades comerciales del bioinsecticida que permitieran suplir las necesidades del sector, se planteo como meta la tecnificaciòn del proceso productivo, dentro de una filosofia de "calidad total", para lo cual fue necesario construir una planta de produccion que cumpliera con las especificaciones tecnicas para este tipo de industrias, se adquirieron los equipos para realizar cada parte del proceso como una operacion unitaria independiente y estandarizable; todas las operaciones unitarias se estandarizaron y se determinaron los puntos criticos de cada una de ellas. Asi mismo, se corroboro la identidad del agente biocontrolador, se ajusto su concentracion efectiva en el producto y se validaron y documentaron las tecnicas de control de calidad en los Procedimienlos Operacionales Estandar (POEs).

Materiales y Metodos

Identificacion viral

La identificacion del virus se realizo en el Instituto de Investigaciones para el Desarrollo de Francia (IRD). Para tal fin, larvas infectadas provenientes de la unidad de propagacion viral de la Planta Semicomercial de Baculovirus fueron liofilizadas y analizadas en dicho instituto.

Microscopia electronica: Larvas frescas se fijaron con glutaraldehido al 2% y fijadas nuevamente con tetraoxido de osmio al 2%; estas dos soluciones se prepararon en tampon cacodilato (pH6.8, 0.1M). Las muestras fueron deshidratadas en concentraciones crecientes de etanol (20 a 100%) y luego fijadas en para fina y cortadas con microtomo en tajadas de 10 micras de espesor. Secciones del insecto fueron cubiertas con oro con un microtomo Rcichert Jung, modelo 2030 y observadas en un microscopio electronico Phillips 515.

Purificacion viral y analisis molecular del ADN. Larvas infectadas con el virus fueron homogeneizadas en solucion de sodio dodecil sulfoxido (SDS) al 0,1% en agua destilada. El homogeneizado se filtro a traves dc una tela y la suspension rcsultante se ubico sobre un gradiente de sacarosa de 45% a 80% y se centrifugo por una hora a 32.500g. La banda blanca formada por los cuerpos de inclusion se recupero, se diluyo en tres volumenes de agua destilada y se centrifugo por 1 hora a 20.000g. El sedimento que contenia los cuerpos de inclusion fue suspendido en 1 mL de agua destilada. Se tomo 1 mL de la suspension de virus purificado y se mezclo con el mismo volumen de una solucion de carbonato de sodio (1M, pH 11) por 30 minutos, seguido de la adicion de 2mL de tampon Tris (IM, pH 8.0). La solucion resultante se centrifugo por 1 hora a 75.000g. El sedimento (viriones) se resuspendio en 1 mL de tampon Tris y se extrajo sucesivamente tres veces con fenol, dos veces con cloroformo: alcohol isoamflico (1:24) y dos veces con eter. La fase acuosa fue recuperada y precipitada loda la noche (-20 C) con 2.5 volumenes de etanol absoluto en presencia de acctato de sodio (pH 5.5) a una concentracion final de 0.3M. El ADN sedimentado seJavd con etanol al 95%, se seco y disolvio en tampon Tris. Posteriormcnte, se aplicaron las enzimas de restriccion Eco RV, Bgl II, Sal I, Eco RI, Pvu II, Sac I, Cla I y Bam HI, segun las recomendaciones del fabricante (Bochringer). Terminada la digestion se corrio una electroforesis del ADN digerido usando un gel de agarosa al 1 % en tampon TEP (9 mM Tris-fosfato, 2 mM EDTA, pH 8.0) (Zeddam et al. 1999). Los tratamientos consistieron en larvas provenientes de la Planta Semicomercial de Baculovirus y un tratamiento control consistente en ADN de PhopGV patron.

Inmunodifusion. El virus purificado se analizo en un gel de agarosa mediante la tecnica dc inmunodifusion (Ouchterlony 1948). El antisuero utilizado se produjo sobre raton por inyeccion de cuerpos de inclusion de PhopGV previamente disueltos con carbonato de sodio. Los tratamientos fueron los cuerpos de inclusion de larvas provenientes de la Planta Semicomercial dc Baculovirus y un tratamiento control consistente en cuerpos de inclusion de larvas infectadas con PhopGV patron.

Validacion de la tecnica de cuantificacion viral

De la suspension viral preparada en la Planta Semicomercial de Baculovirus se tomaron ocho muestras que fueron filtradas usando una jeringa dc filtracion con un filtro de 0,8 micras. Posteriormente, con una micropipeta se tomo un volumen de la muestra y se coloco en la camara de Neubauer, la cual se cubrio con su respectiva laminilla de cuarzo y observada en el microscopio de campo oscuro a 400X, ajustando la cuadricula central de la camara. Se tomo una fotografia de la imagen con una camara digital acoplada al mtcrocopio y se imprimio para realizar el conteo de cuerpos de inclusion. El conteo de las particulas virales se realizo en cada uno de los 25 cuadrados que conformaron el cuadrante. Los resultados se promediaron y se utilizo el factor de conversion de la camara para calcular el numero de cuerpos de inclusion por mL.

El procedimiento descrito se repitio con cada muestra. Para la evaluacion de repetibilidad, las ocho muestras evaiuadas se tomaron de la misma suspension viral y se evaluaron con los mismos equipos, en el mismo dia y con el mismo analista.

Determinacion de las concentraciones letales

Para determinar la concentracion letal media y noventa del PhopGV, tres larvas muertas de T. solanivora con sintoma viral fueron maceradas y llevadas a l00mL con una solucion de Tween 80 al 0,1 %, consistiendo esta en la dilucion 10°, a partir de la cual se prepararon 100mL de las diluciones decimales 10^-1, 10^-2, 10^-3y 10^-4, determinando su concentracion mediante conteo en camara de Neubauer en microscopio de campo oscuro siguiendo la metodologia descrita anteriormente despues de habcr sido validada. En cada dilucion se sumergieron tres tuberculos de papa pastusa lavada durante 1 minuto, momento en el cual las papas fueron retiradas del liquido y puestas sobre un papel servilleta al ambiente para permitir el secado. Cada papa seca se ubico en un recipiente plastico de 16 onzas y fue infestada con 20 larvas de T.solanivora de primer instar. Los recipientes sc cerraron se ubicaron aleatoriamente en un estante ubicado en un cuarto con temperatura promedio 25°C. Se conto con un testigo absoluto en el cual los tuberculos no fueron inoculados. Pasados 30 dias, se registro la mortalidad de las larvas en :ada unidad experimental mediante una evaluacion destructiva de los tuberculos. los insectos se clasificaron como vivos larvas con movimiento y pupas) y muertos (larvas sin movimiento y larvas desaparecidas, lo que sugiere que murieron en estado neonato). Los resultados se utilizaron para calcular el porcentaje de eficacia mediante la formula de Schneider-Orelli (Ciba Geigy 1973) y se empleo el analisis Probit para determinar las concentraciones letales.

Elaboracion del bioplaguicida

Una vez determinadas las concentraciones letales del aislamiento, se ajusto el proceso de manufactura del bioplaguicida para que la concentracion final del producto fuera la concentracion letal noventa (CL₉₀) determinada. Para tal fin se calculo la concentracion requerida en la suspension viral a partir de la cual se elaboro la formulacion y basados en la desviacion estandar de los resultados de la validacion de la tecnica de cuantificacion viral se fijaron los limites de aceptacion para dicha variable. Una vez fijado este paramelro, se elaboraron tres lotes del bioplaguicida en la Planta Semicomercial de Baculovirus.

Validacion de tecnicas de control de calidad

Con los productos se validaron las pruebas de control de calidad para el producto terminado. Dichas pruebas consistieron en la determinacion del pH, la voluminosiad, el tamaño de particula y la eficacia biocontroladora.

pH. Este se midio con un potencidmetro, para lo cual se pesaron lOg de producto y se suspendieron en 100mL de agua destilada, a esta suspension se le determino el pH con el equipo previamente calibrado. La determinacion se realizo a cinco muestras aleatorias provenientes de los tres lotes de bioplaguicida.

Voluminosidad. Es el volumcn ocupado por un material solido. Para su determinacion se pesaron 50g de producto y se dejaron caer libremente en una probeta de 100 mL. Posteriormente, se leyo el volumen ocupado por este material en la probeta (VI) y se calculo la voluminosidad con la formula: Voluminosidad = VI/50g. Este parametro se realizo a cinco muestras aleaiorias provenientes de los tres lotes de bioplaguicida.

Tamaño de particula. Se lomaron lOOg dc producto y se ubicaron en el primer tamiz de unacolumnadetamicesorgani-zados segun el tamaño de poro de mane-ra descendente de arriba hacia abajo, los cuales se aseguraron a un agitador vibra-torio. El agitador se acciono por 10 mi-nutos y terminada la agitacion se peso el material retenido en cada tamiz y se esta-blecio en cual de ellos quedo la mayor cantidad de peso retenido. La determinacion se realizo a cinco muestras aleaiorias provenientes de los tres lotes de bioplaguicida.

Eficacia. Se realizaron bioensayos en los cuales la unidad experimental con-sistio en un tuberculo de papa ubicado en un recipiente plastico de 16 onzas infestado con 20 larvas de primer instar de la polilla guatemalteca. Se utiliza-ron tres repeticiones por tratamiento y cstos consistieron en tuberculos pelleti-zados con el producto a base de PhopGV y un testigo absoluto que consistio en tuberculos lavados y secos. Pasados 30 dfas se realizo la evaluacion destructiva de los tuberculos estableciendo el porcentaje de mortalidad. Los resultados se utilizaron para calcular el porcentaje de eficacia mediante la formula de Schnei-der-Orelli (Ciba Geigy 1973). La determinacion se realizo a cuatro muestras aieatorias provenientes de los Ires lotes de bioplaguicida.

Identificacion viral

Microscopia electronica

En las imagenes de microscopia electronica dc las muestras se observaron estructuras ovoides que coincidieron con la descripcion tipica de los cuerpos de inclusion del granulovirus de Phthorimaea operculella (Fig. 1). Los cuerpos de inclusion aparecieron como corpusculos de forma de baston con un ancho aproximado de 260 a 280 nm y un largo aproximado de 460 a 480 nm. Estas caracteristicas coincidieron con las reportadas para los granulovirus, los cuales han sido descrtos como estructuras de esta forma con un tamaño entre 160 y 300 nm de ancho y entre 300 y 500 nm de largo (Caballero etal. 2001).

Analisis molecular del ADN

Los patrones de distribucion dc los fragmentos de ADN generados por la muestra digerida con las ocho enzimas de restriccion, coincidieron con los obtenidos con el tratamiento control para las diferenles enzimas utilizadas. Este resultado confirma la identidad del virus como el granulovirus de Phthorimaea operculella.

La gran similitud en el ADN de diferentes aislamientos de este virus facilita su identificacion por este metodo. La razon para la alta conservacion de los sitios de restriccion en lassecuenciasdeADN viral es desconocida, esta conservacion ademas no es unica de los granulovirus (Zeddam et al. 1999). A pesar de que se han reportado algunas pequeñas variaciones, como en el caso de granulovirus patogenos de Pieris brassicae y Pieris rapae, los cuales mostraron algunas diferencias en los patrones de distribucion de los fragmcntos de ADN, las diferencias mfnimas encontradas no han dificultado su identificacion por esta tecnica molecular (Crook 1986).

Inmunodifusion

La reaccion de inmunodifusion mostrd bandas identicas en los dos tratamientos consistentes en la muestra proveniente del principio activo del bioplaguicida y del tratamiento control (Fig. 2). Esto sugiere que el virus presente en la muestra es antigenicamenie estrechamente relacionado con el PhopGV.

Los resultados de la aplicacion de las tecnicas de microscopia, serologia y biologia molecular son coherentes y permiten concluir que las larvas de Tecia solanivora examinadas estaban infectadas masivamcnte por un granulovirus. Las caractensticas establecidas por este permitieron concluir que se trataba del granulovirus de Phthorimaea operculella descrito por primera vez en 1967 por Sleinhaus y Marsh.

Validacion de la tecnica de cuantificacion viral

Al observar las muestras en el microscopio de campo oscuro se observaron los cuerpos de inclusion (CI) como puntos brillantes con un ligcro movimiento Browniano. Los resultados de concentracion expresada como CI.mL ' para cada una de las ocho muestras evaluadas fueron 3,61 x 10*, 4,75 x 106, 6,73 x 106, 4,23 x 106, 4,40 x 10", 5,71 x 106, 6,49 x 106 y 4,47 x 106 y el valor medio fue de 5,04 x 106. Los resultados se transformaron calculando el logaritmo decimal de cada valor y con dichos valores se calcularon la desviacion estandar, la varianza y el coefieiente de variacion de los datos. El coeficiente de variacion expresado como porcentaje fue del 1,38%, indicando baja variabilidad y alta repetibilidad; en consecuencia, estos sugieren que la tecnica utilizada para evaluar la variable concentracion de cuerpos de inclusion en la suspension viral es precisa y confiable, por lo que puede utilizarse para el control de calidad del producto en proceso. Este mctodo es el mas ulilizado para la cuantificacion de cuerpos de inclusion en suspensiones acuosas puras o semipuras y se recomienda para facilitar la lectura un numero de cuerpos de inclusion entre 20 y 40 por cuadricula (Caballero et al. 2001). La implementacion de dicho control en la manufactura del bioplaguicida perm kid establecer una concentracion fija y constante del virus en el producto.

Determinacion de las concentraciones letales

Una vez validada, la tecnica de cuantificacion viral se utilize) para ajus-tar la concentracion de difcrentes suspensiones virales. Al evaluar las diferentes concentraciones del virus se encontro que a mayor concentracion viral inoculada en los tuberculos, mayor numero de larvas muertas y las pocas que se encontra-ban vivas, presentaron la sintomatologia tipica de la infeccion viral expresada como retardo en el crecimiento, disminucion de la movilidad y una coloracion blanca lechosa a traves del integumento, la cual fue mas notoria en la zona ventral (Fig. 3). A menor concentracion del virus se encontro mayor numero de pupas y larvas vivas de mayor tamaño. En el tratamiento control, en el cual no se aplico virus, se obtuvo un 5% de mortalidad, 88% de los individuos se encontraban en estado de pupa y el 7% como larvas vivas y sanas sin sintomatologia viral. Los porcentajes dc eficacia para las diferentes concentraciones del virus correspondientes a 10², 10³ 10⁴, 10⁵y 10⁶CI.mL^-1 fueron del 5,26%, 14%, 59,5%, 59,7% y 92,9% respectivamente. Estos resultados indican que la concentracion del virus es directamente proporcional a la mortalidad de las larvas de la Polilla guatemalteca de la papa.

El programa Probit determino como concentracion letal media 1.4 x l0⁴CI.mL^-1 y como concentracion letal noventa 8.0x10⁵ CI.mL^-1 (Tabla 1). Existen algunos trabajos en los que se ha buscado determinar las conccntracioncs letales de aislamientos de baculovirus, sin embargo, en la mayoria de los casos se ha utilizado el numero de larvas o equivalentes larvales (E.L.) para medir las concentraciones y no la cuantificacion de particulas virales por lo que los resultados han sido inconsistentes. Al trabajar con equivalentes larvales las concentracioncs virales son variables pues cada larva puc-de tener un contenido diferentc de cuerpos de inclusion dependiendo de como se haya desarrollado la infeccion.

Con un aislamiento de PhopGV procedente de Yemen se establecio como concentracion letal media un valor de 7.3 x 10⁴ CI.mL^-1, mediante un experimento en el cual se expusieron neonatos de P. operculella a tuberculos tratados con diferentes concentraciones del virus (Kroshel et al. 1996 citado por Zeddam 1999).Esta concentracion es similar a la obtenida en el presente trabajo con T. solanivora, a pesar de que el virus empleado en los dos estudios es un granulovirus de Phthorimaea operculella, por lo que se esperaria que prescntara mayor palogenicidad contra su hospedero natural.

Alcazar et al. (1992) establecieron la CL₅₀ para un aislamiento de PhopGV para el control de P. operculella en 3.83 x 10³ CI.mL^-1. resultado aproximadamente 10 veces menor del encontrado en el presente estudio. Esto podria sugerir que dicho aislamiento es mas patogenico que el evaluado en este trabajo o que P. operculella es mas susceptible a este virus que T. solanivora.

Zeddam et al. (1999), establecieron la CL5n de diferentes aislamientos de PhopGV en Phthorimaea operculella para lo que prepararon diferentes dosis del virus utilizando como variable los equivalentes larvales. Con dichas suspensiones inocularon tuberculos de papa que infestaron con larvas de segundo o tercer instar de la polilla. Los autores concluyeron que todos aislamientos virales presentaron la misma patogenicidad y sus CL₅₀ oscilaron entre 15.6 y l8.5 E.L.100mL^-1

Despues de determinar la CL₉₀ del virus, se realizaron los cambios necesarios en el proceso de manufactura del bioplaguicida para ajustar en el producto una concentracion final equivalenle por unidad de peso, esta fue de 8.0 x l0⁵CLg^-1 y se establecio como concentracion optima en el producto con la cual se fijaron los limites de aceptacion para la concentracion de la suspension viral utilizada para elaborar el formulado entre 2.0 x 10⁶ y 6.2 x 10⁶ CI.mL^-1. De esta forma, cada vez que se elabora un lote de bioplaguicida, se realiza como control de calidad la determinacion de la concentracion de la suspension viral. Asi el producto solo se usaria cuando se encuentra dentro de dicho rango. Esto ha permitido asegurar que todos los lotes de producto tengan la misma concentracion viral y en consecuencia una eficacia biocontroladora constante.

Validacion de tecnicas de control de calidad

Para la variable pH se obtuvieron resultados que oscilaron entre 9.33 y 9.64 (Tabla 2), valor que se debe al soporte inerte utilizado como vehiculo de la formulacion. Los valores obtenidos presentaron baja variabilidad entre las diferentes muestras, con un bajo coeficiente de variacion del 1.47%, que sugiere que la tecnica es confiable y precisa y puede ser utilizada como un control de calidad para el producto. Con el resultado promedio y la desviacion estandar de los datos se establecio como limite de aceptacion para esta caracteristica un rango entre 9.38 a 9.66.

Para la voluminosidad del bioplaguicida, caracteristica quo determina la facilidad en la manipulacion del producto durante los procesos de llenado de empaques (Voight y Bomschein 1982). se obtuvieron valores entre 0.88 mL.g^-1 y 0.96 mL.gr^-1 (Tabla 3) que se consideran bajos y estan determinados por la voluminosidad del vehiculo inerte. Estos valores se consideran adecuados segun la industria farmaceutica, la cual recomienda voluminosidades inferiores a 3 mL.g^-1 para asegurar que no presentara problemas de manipulacion durante cl proceso de manufactura y empaque (Voight y Bomschein 1982). Los resultados presentaron una baja variabilidad entre replicas, con un coeficiente de variacion del 3.59%, el cual indico que esta tecnica tambien es altamente repetible y puede ser utilizada como un control de calidad confiable. Los limites de aceptacion para esta caracteristica se fijaron entre 0.60 mL.g^-1 y 1.26 mL.g^-1 y se establecio que dicho control debe realizarse al producto antes de iniciar la operacion de llenado sde envases.

En la determinacion del tamaño de particula del productoan, la mayor ctidad de peso retenido se obtuvo en el tamiz con tamaño de poro 59 micras (Tabla 4). Tambien se observo que en el colector de polvos finos quedo retenido un 40.72% del material, resultado que indica que un año porcentaje de las particulas presentan un tamaño inferior a 59 micras. Este aspecto asegura una buena adherencia sobre la superficie de los tuberculos. Los resultados de las diferentes muestras presentaron coeficientes de variacion inferiores al 5%, valores bajos que indicaron que la tecnica es precisa,con alta repetibilidad y es adccuada como control de calidad del producto.

En cuanto a la evaluacion de la eficacia del bioplaguicida, los resultados con las cuatro muestras oscilaron entre 89.2% y 100% (Tabla 5), valores que muestran que el producto es eficiente para el control de la plaga. Estos resultados ademas presentaron un coeficiente de variacion del 5.5%, considerado bajo para este tipo de ensayos biologicos; este indica que la metodologia empleada para el bioensayo es precisa y de alta repetibilidad. Si se tiene en cuenta que la tecnica desarrollada es sencilla, rapida y economica, puede considerarse optima para el control de calidad del producto.

La validacion de estas tecnicas permitio elaborar Procedimientos Operativos Estandar (POEs) que describen la metodologia detallada de cada prueba y un formato para el registro de los resultados parciales y finales de cada evaluacion. Con base en dicha documentacion el laboratorio de control de calidad Biotecnica adscrito al laboratorio de Control Biologico dc Corpoica se registro ante el ICA. Este presta el servicio de control de calidad a la Planta de Produccion de Baculovirus y es el unico laboratorio registrado en el pais para desarrollar dichos analisis.

Agradecimientos

Los autores expresan sus agradecimientos a Colciencias por su apoyo financiero para el desarrollo del presente trabajo.

Literatura citada

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Recibido: 14-dic-04 - Aceptado: 25-jul-05