Patogenicidad de Lecanicillium lecanii (Fungi) sobre la garrapata Boophilus microplus
(Acari: Ixodidae) en laboratorio

Pathogenicity of Lecanicillium lecanii (Fungi) on the tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) in the laboratory conditions

CATALINA BELTRÁN ALZATE¹, ANA ISABEL GUTIÉRREZ G.², YAMILLÉ SALDARRIAGA O.³

² Bióloga. M. Sc. Investigadora Asociada al Grupo de Micología. Instituto de Biología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Corporación para el Estudio de Patologías Tropicales. Universidad de Antioquia. A. A. 1226. Medellín, Colombia. anaisaguti@gmail.com.

³ Autor para correspondencia: Licenciada en Biología y Química. M. Sc. Profesora de Micología. Instituto de Biología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Corporación para el Estudio de Patologías Tropicales. Universidad de Antioquia. A. A. 1226. Medellín, Colombia. Fax: 2105666. ysaldar@matematicas.udea.edu.co.

Resumen:

Se determinó en laboratorio la patogenicidad del hongo Lecanicillium lecanii sobre la garrapata del ganado Boophilus microplus. Se sumergieron las garrapatas en soluciones con concentraciones de L. lecanii (CIAT 215), 1,25 x 101, 1,25 x 105 y 1,25 x 108 conidios/mL colocándolas individualmente en cajas de Petri. Los testigos fueron sumergidos en agua destilada. El análisis estadístico mostró que los periodos de preoviposición en las hembras tratadas con L. lecanii y los testigos presentaron diferencias significativas. En el periodo de oviposición hubo diferencias significativas entre los testigos y las concentraciones 1,25 x 101, 1,25 x 105 y 1,25 x 108 conidios/mL. La supervivencia de las garrapatas mostró diferencias entre los testigos y las concentraciones de L. lecanii. De las 120 garrapatas inoculadas 115 (95,8%) fueron conidiadas, y se observó una invasión total al noveno día. El porcentaje de eclosión se redujo notablemente en todos los tratamientos comparados con el testigo. Se observó una supervivencia reducida de las larvas tratadas a la concentración de 1,25 x 108 conidios/mL (73%) comparada con el testigo (100%). La concentración 1,25 x 108 conidios/mL del hongo L. lecanii presentó un efecto significativo sobre la oviposición, la supervivencia de las hembras teleoginas inoculadas, el porcentaje de eclosión de las masas de huevos y la supervivencia de larvas provenientes de huevos de B. microplus inoculados.

Palabras clave: Supervivencia. Hongo entomopatógeno. Oviposición. Preoviposición.

Abstract:

The pathogenicity of the fungus Lecanicillium lecanii on the cattle tick Boophilus microplus was determined under laboratory conditions. Ticks were submerged in solutions of three concentrations of L. lecanii (CIAT 215), 1.25 x 101, 1.25 x 105, and 1.25 x 108 conidia/mL, and these were placed individually in Petri dishes. Control ticks were submerged in distilled water. Statistical analyses showed significant differences in the period of preoviposition of females treated with L. lecanii between treatments and the control. In the period of oviposition there were significant differences between the controls and the concentrations 1.25 x 101, 1.25 x 105, and 1,25 x 108 conidia/mL. The survival of ticks showed differences between the control and the concentrations of L. lecanii. Of the 120 ticks inoculated, 115 (95,8%) were conidiated, and a total invasion was observed at ninth day. The percentage of emergence was notably reduced in all treatments compared with the control. A reduced survival of the larvae was observed at the concentration 1.25 x 108 conidia/mL (73%), compared with the control (100%). The concentration 1.25 x 108 conidia/mL of the fungus L. lecanii presented a significant effect on oviposition, the survival of the engorged females inoculated, the percentage of emergence of egg masses, and the survival of the larvae coming from the inoculated eggs of B. microplus.

Key words: Survival. Entomopathogenic fungus. Oviposition. Preoviposition.

Introducción

En áreas tropicales y subtropicales como Colombia, existen serias limitantes para el desarrollo de la industria bovina por la presencia de diversas especies de garrapatas, no sólo por los daños directos que ocasionan, sino también por ser transmisoras de microorganismos, principalmente los causantes de la anaplasmosis y babesiosis bovina. Estas enfermedades están ampliamente difundidas en Colombia desde el nivel del mar hasta los 2.200 msnm, en las cuales los factores climáticos (temperatura, humedad, precipitación y altitud) son favorables para la multiplicación y desarrollo de la garrapata del ganado Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Benavides 1983; Benavides et al. 1999; Lamberti y Bulman 2002; De la Cruz y Vahos 2004). B. microplus, es un ectoparásito hematófago, con cubierta quitinosa, dura y protectora que puede soportar largos periodos de inanición; cuenta con un amplio rango de hospederos, alta tasa de oviposición, prácticamente carece de enemigos naturales y las condiciones ecológicas donde se encuentra comúnmente favorecen la infestación provocando graves alteraciones en los animales con repercusiones en la economía de la actividad ganadera (Marín 2002; Armendáriz 2003).

Una de las estrategias más utilizadas para el tratamiento de animales infestados con B. microplus es la aplicación de acaricidas como organofosforados, amidinas, piretroides e ivermectinas a intervalos específicos; también se han utilizado extractos de plantas y semillas. Sin embargo, la resistencia adquirida por las garrapatas a estos productos ha motivado el uso de métodos alternativos de control parasitario como el uso de hongos entomopatógenos. Estos organismos se han constituido en grandes biocontroladores de insectos y ácaros plagas de cultivos y animales. El control biológico utilizando estas alternativas consiste en el empleo de biopreparados a partir de los hongos que son aplicados por medio de baños al ganado o en el pasto (García 2002; Martínez et al. 2002; Fragas et al. 2006).

El hongo Lecanicillium lecanii (Zimmerman) Zare & Gams, 2001 [=Verticillium lecanii (Zimmerman) Viégas] tiene amplia distribución mundial y un gran espectro como agente potencial en control biológico de diferentes hospederos como áfidos, escamas, coleópteros, dípteros, colémbolos y garrapatas, por esta razón ha sido estudiado como posible agente de control de estos artrópodos en diferentes investigaciones (Tanada y Kaya 1993; Humber 1997; Obregón 2002). Rijo et al. (1998) realizaron un estudio en la Provincia de la Habana (Cuba) determinando la efectividad del biopreparado a base del hongo V. lecanii cepa LBVL-2 para infectar a los estados parasíticos de B. microplus encontrando una efectividad entre el 47,5 y 78,7%. Vitorte et al. (1998, 2003) realizaron estudios en novillos de establo asperjados con biopreparados de L. lecanii encontrando resultados similares.

Por otro lado, Díaz y Chuquiyaury (2002) en la provincia de Oxapampa, departamento de Pasco (Perú), evaluaron el efecto de las dosis de los hongos entomotopatógenos Beauveria bassiana (Balsamo) Vuill, 1912 y L. lecanii a concentraciones de 3x1011 conidios/g en 92 vacunos de diferentes razas, sexo y con diferentes grados de infestación de garrapatas, obteniendo mortalidad a los 12 días después de la inoculación. La mezcla de ambos entomopatógenos, produjo una mejor respuesta con un 77% de efectividad. En un estudio en Colombia se evaluaron de forma comparativa 10 aislamientos de Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sor. 1883, B. bassiana y L. lecanii sobre teleoginas ingurgitadas (hembras maduras y listas para desprenderse del hospedador) de B. microplus encontrándose el mayor efecto sobre la reproducción con el aislamiento Mt019 de M. anisopliae con el cual se obtuvo un 87% de inhibición en la reproducción a la dosis de 109 conidios/mL (FAO 2003).

Recientemente, Cardona (2005), evaluó el efecto de B. bassiana y M. anisopliae y una combinación de ambos hongos sobre B. microplus adultas y su oviposición en condiciones de laboratorio. En sus resultados se observó que tanto la supervivencia de los adultos como el porcentaje de eclosión de larvas se redujo por efectos del hongo entomopatógeno, especialmente por la mezcla de ambos.

El potencial biocontrolador del hongo L. lecanii contra B. microplus, demostrado en los estudios mencionados, justifica la búsqueda de aislados mas eficientes, no sólo en el control de las hembras teleoginas sino también en huevos o larvas. El objetivo de este estudio fue evaluar en el laboratorio la patogenicidad del hongo entomopatógeno L. lecanii (CIAT 215) en hembras ingurgitadas de B. microplus y sus huevos.

Materiales y Métodos

Recolección de las garrapatas. El estudio se realizó en el laboratorio de Micología del Instituto de Biología de la Universidad de Antioquia. Se colectaron manualmente aproximadamente 500 garrapatas teleoginas de B. microplus sobre bovinos en la Central Ganadera de la ciudad de Medellín. Las garrapatas se depositaron en frascos de vidrio de boca ancha (7cm de diámetro) que fueron tapados con gasa y llevados al laboratorio donde se verificó su identidad taxonómica utilizando las claves de López (1980) y Parra et al. (1999). Las garrapatas se lavaron con agua y se sumergieron durante un minuto en solución de hipoclorito de sodio al 1% para desinfectarlas, luego se secaron y pesaron individualmente en una balanza (Adam Equipment, AE, ACB 600, max = 600 g, d = 0,02 g). Se conformaron tres grupos homogéneos en peso (el primero de 0,10 a 0,19 g, el segundo de 0,20 a 0,29 g y el tercero de 0,30 a 0,39 g).

Origen y mantenimiento de la cepa del hongo. El hongo L. lecanii aislado de mosca blanca Trialeurodes vaporariorum Westwood, 1856 (Hemiptera: Aleyrodidae) (CIAT 215) fue suministrado por el laboratorio Biotropica, Medellín, Colombia y cultivado a temperatura ambiente en botellas de arroz acidificado (ácido láctico) y en cajas de Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA), MERCK KgaA Darmstadt, Alemania, al cual se le adicionó un macerado de garrapatas (1,5 g) obtenido después de someterlas por un tiempo de 30 minutos a soluciones de HCl al 0,2 N y NAOH al 0,1 N (Protocolo adaptado de Barranco et al. 2002). El hongo se mantuvo en el laboratorio de Micología del Instituto de Biología de la Universidad de Antioquia por un tiempo de cultivo de 20 días antes de la inoculación. Para reactivar in vivo la patogenicidad del hongo se realizaron bioensayos con 90 hembras de B. microplus ingurgitadas utilizando diferentes concentraciones como tratamientos: 1,25 x 101, 1,25 x 105 y 1,25 x 108 conidios/mL de L. lecanii. Las garrapatas muertas diariamente fueron llevadas a cámara de humedad para evaluar la conidiación del hongo como una prueba de su patogenicidad. Del hongo obtenido a partir de los cadáveres se realizaron cultivos monospóricos siguiendo la técnica descrita por Calle (2000). La determinación taxonómica y verificación del hongo, previo a cada ensayo, se realizó siguiendo las claves de Barnett (1967), Samson et al. (1984), Domsch y Gams (1993), Kirk et al. (2001) y Barnett y Hunter (2003).

Pruebas de Patogenicidad

Preparación de la suspensión de conidios. A partir de los cultivos en PDA y Arroz acidificado se preparó una suspensión inicial de conidias de L. lecanii en 200 mL de agua destilada con Tween 80 (0,05%), y se estimó su concentración mediante conteo de conidios utilizando cámara de Neubauer (Goettel e Inglis 1997; Pérez 1997). A continuación se prepararon las concentraciones de 1,25 x 101, 1,25 x 105 y 1,25 x 108 conidios/mL.

Bioensayos

1. Inoculación de hembras teleoginas de Boophilus microplus.

Se conformaron 16 grupos cada uno constituido por 30 hembras de B. microplus completamente ingurgitadas, homogéneas en cuanto a peso, tamaño y vitalidad. Se seleccionaron cuatro grupos como testigos, los doce grupos restantes fueron utilizados con las concentraciones a evaluar. Cada uno se sumergió en 100 mL de las suspensiones conidiales de L. lecanii (1,25 x 101, 1,25 x 105 y 1,25 x 108 conidios/mL) durante diez minutos y los testigos se sumergieron en agua destilada estéril. Se eliminó el exceso de humedad y después cada garrapata se depositó de manera individual en una caja de Petri y fue incubada en cámara climatizada (WTBbinder 78532, Tuttlingen, Alemania) con temperatura controlada de 28 ± 0,5ºC y humedad relativa superior al 85% durante 21 días, periodo en el cual la hembra ingurgitada no necesita alimentarse y lleva a cabo la oviposición.

Después de la inoculación se determinó el período de prepostura, de oviposición y la supervivencia de las garrapatas. Luego de 21 días de realizado el ensayo y una vez finalizado el periodo de oviposición, se recogieron los huevos de cada garrapata, se pesaron en masa, cada masa de huevos se depositó en un tubo de ensayo y se llevaron a cámara climatizada en condiciones similares a las descritas anteriormente durante ocho días para medir el porcentaje de eclosión. Para evaluar el desarrollo del hongo en el cuerpo de las garrapatas muertas éstas se colocaron en cámara de humedad y se observaron diariamente, se estableció el tiempo de aparición del micelio hasta la invasión completa. Posteriormente se realizaron montajes con azul de lactofenol del hongo obtenido de algunas garrapatas muertas colonizadas para verificar la presencia de L. lecanii en el cuerpo.

2. Inoculación de huevos obtenidos de hembras teleoginas de B. microplus

Se recolectaron hembras de B. microplus teleoginas y se incubaron en cámara climatizada (a 28 ± 0,5ºC y humedad relativa superior a 85%) durante 21 días para obtener huevos. Después de este tiempo, los huevos se pesaron y se formaron 40 grupos de 0,1 g de peso y se sumergieron en 50 mL de las suspensiones de hongo así: diez para la concentración 1,25 x 101, diez para la concentración 1,25 x 105, diez para la concentración 1,25 x 108 conidios/mL, y diez para los testigos (agua destilada estéril). Luego se eliminaron los excesos de la solución y se dejaron sin tapar durante 24 horas para permitir un secado adecuado. Para cada tubo se utilizó un tapón con una envoltura adherible transparente que permitió la ventilación y se dejaron en cámara climatizada durante 21 días realizando observaciones al estereomicroscopio para determinar el tiempo de eclosión y el porcentaje de supervivencia larvaria postinoculación de los huevos.

Parámetros evaluados

Supervivencia de garrapatas adultas. Se registró diariamente el número de garrapatas adultas muertas para cada concentración del hongo L. lecanii.

Periodo de preoviposición y oviposición. Se calculó el periodo de preoviposición y oviposición en las hembras teleoginas inoculadas con las diferentes concentraciones del hongo.

Porcentaje de eclosión y supervivencia larvaria. Para los dos ensayos el porcentaje de eclosión se calculó mediante un conteo de cascarones y la supervivencia larvaria se determinó ocho días después de observar la eclosión de todos los huevos.

Índice de eficiencia de la conversión (IEC). (IEC) = Peso de los huevos de la unidad experimental / peso de las hembras de la unidad experimental al inicio del ensayo, es un parámetro cuantitativo utilizado para determinar la conversión del peso de una hembra ingurgitada en huevos (Benavides et al. 1999).

Eficiencia del hongo (EH). El índice de eficiencia de la conversión (IEC) de cada grupo de garrapatas tratadas se comparó con el IEC de los grupos control para obtener la eficiencia del hongo. EH = (IEC grupo control – IEC grupo tratado)/ (IEC grupo control) x 100 (Raymond et al. 2004).

Análisis estadístico. Las variables peso final, peso de la oviposición, periodo de preoviposición, periodo de oviposición, y porcentaje de eclosión de huevos se estudiaron mediante análisis de varianza bifactorial teniendo en cuenta como factores el peso inicial de la garrapata y la concentración del hongo. La mortalidad diaria para cada concentración se comparó mediante las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier aplicando la prueba Generalizada de Gehan Wilcoxon. Se calculó también el tiempo letal 50 (TL50) para cada concentración. Las comparaciones múltiples de medias se efectuaron con la prueba de Newman- Keuls para a = 0,05. Los análisis se realizaron con el paquete estadístico STATISTICA 7.0 (Statsoft, Inc. Tulsa, Ok, U.S.A).

Resultados y Discusión

Periodos de preoviposición y oviposición. Independientemente de la concentración de L. lecanii el peso inicial más bajo de las hembras inoculadas de B. microplus (0,10 – 0,19 g) presentó mayor tiempo promedio de preoviposición (Anova Peso inicial: F2,461 = 23,48, P < 0,001. Concentración: F3,461 = 1,75; P = 0,16. Interacción: F6,461 = 1,01; P= 0,42) (Tabla 1). A diferencia de este resultado, Gallardo y Morales (1999) trabajando con B. microplus no inoculadas en condiciones de laboratorio (23 ± 1ºC de temperatura y 85 ± 10% de humedad relativa y fotoperiodo de 12:12 horas Días: Noche) encontraron una correlación baja y positiva entre el peso inicial de las teleoginas y el periodo de preoviposición, (r = 0,27). Una correlación negativa como la encontrada en el presente estudio se registró por Davey et al. (1980) y la Universidad de la Habana (1974) (citados por Gallardo y Morales 1999), en este último trabajo se resaltó que solo existe esta correlación negativa entre los dos factores a temperaturas entre 30 y 32°C pero que dado que la correlación es débil quizás un número mayor de garrapatas podrían detectar lo que ocurre a temperaturas inferiores.

En el presente estudio se evaluaron 120 garrapatas en grupos de peso homogéneos a temperatura de 28 ± 0,5°C (superior a la reportada por Gallardo y Morales y un poco inferior a la reportada por el trabajo de la Universidad de la Habana) y la relación entre las dos variables fue negativa (menor peso, mayor periodo de preoviposición), sugiriendo de esta manera que dicha correlación depende de la temperatura y que ella podría ser un factor crítico para aumentar o disminuir el periodo de preoviposición de acuerdo al peso de las garrapatas. En cuanto a la concentración ésta no tuvo efecto en dicho periodo, estos resultados concuerdan con lo encontrado por Cardona (2005) trabajando con B. microplus, utilizando M. anisopliae y B. bassiana en condiciones de laboratorio a concentración 1,25 x 108 conidios/mL. Además, Cardona (2005) encontró que el periodo de preoviposición fue de 5,42 y 5,5 días respectivamente, mucho mayor que el encontrado en este trabajo.

Por otro lado, el período de oviposición de B. microplus resultó influenciado significativamente tanto por el peso inicial como por la concentración (Tabla 1). La prueba de Newman-Keuls mostró que a medida que crece la concentración del hongo disminuye el periodo de oviposición (18,5, 16,3, 13,6 y 7,2 días respectivamente) y, por otra parte, las garrapatas con mayor peso inicial presentaron un periodo de oviposición más prolongado (14,8 días); sin embargo, el periodo más corto fue para el peso intermedio (0,20 – 0,29 g) con 13 días (ANOVA Peso inicial: F2,461 = 13,41; P < 0,001. Concentración: F3,461 = 266,4; P < 0,001. Interacción: F6,461 = 3,70; P = 0,0013). Cardona (2005) además encontró que a 1,25 x 108 conidios/mL el período de oviposición fue de 6,7 y 4,53 días respectivamente.

Gallardo y Morales (1999) encontraron que el período de preoviposición y oviposición de B. microplus sin tratamiento con hongo en condiciones controladas de laboratorio fueron mayores (4,74, 23,4 días respectivamente) que los obtenidos en nuestro estudio con los testigos. Al respecto, Gallardo y Morales, (1999) encontraron que durante el proceso de oviposición el 58,61% del peso de la garrapata se convirtió en huevos. Meléndez (1998) reporta que en hembras ingurgitadas el 55-60% de su peso corporal corresponde a huevos y el 40- 45% restante a sangre y órganos.

Índice de eficiencia de la conversión. Al calcular el índice de eficiencia de la conversión (IEC) se encontró que para los testigos fue de 0,4727 y para las garrapatas inoculadas a la concentración más alta, 0,3715 lo que indica que L. lecanii reduce la conversión del peso corporal de la garrapata en huevos (Tabla 2).

En cuanto a la concentración se encontró que solamente la más alta (1,25 x 108 conidios/mL) redujo significativamente el peso de la masa de huevos (0,087 g.) comparado con el peso promedio de las demás que presentaron un peso similar (0,118; 0,106 y 0,112 g en orden decreciente respectivamente), (Tabla 1) (ANOVA Peso inicial: F 2,461 = 87,2; P < 0,001. Concentración: F3,461 = 12,1; P < 0,001. Interacción: F6,461 = 4,8; P < 0,001). Aunque la interacción peso inicial versus concentración fue significativa, ésta no fue influyente (Fig. 1).

El porcentaje de eclosión de huevos que provenían de teleoginas, inoculadas con L. lecanii no resultó influenciado por el peso inicial de la garrapata pero si lo fue por la concentración del hongo. La concentración más alta obtuvo el porcentaje de eclosión más bajo (74,4%) mientras que las demás presentaron porcentajes similares (90,7, 89,4 y 93,8%) (ANOVA Peso inicial: F2,432 = 0,54; P = 0,58. Concentración: F3,432 = 10,45; P < 0,01. Interacción: F6,432 = 1,52; P = 0,17). Cardona (2005) en estudios similares realizados con B. microplus, a la concentración 1,25 x 108 conidios/mL con M. anisopliae y B. bassiana en condiciones de laboratorio, encontró que el porcentaje de eclosión de larvas fue de 95% y 93,33% respectivamente.

El análisis de supervivencia de las hembras teleoginas de B. microplus inoculadas con diferentes concentraciones de L. lecanii mostró diferencias significativas entre las concentraciones del hongo X2 = 299,3; P < 0,001) (Fig. 2). Las curvas se compararon entre sí siguiendo el método de Bonferroní con a = 0,017. Se encontró que a mayor concentración del hongo fue menor el promedio de días de supervivencia como el TL50 (Tabla 3). Cardona (2005) con B. microplus, encontró que a esta misma concentración utilizando M. anisopliae y B. bassiana, el tiempo promedio de supervivencia de garrapatas adultas inoculadas fue de 15,1 y 11,4 días, respectivamente.

Por su parte, Benjamín et al. (2002) evaluaron en condiciones de campo y de laboratorio el efecto del hongo M. anisopliae sobre garrapatas adultas Ixodes scapularis Say, 1821 encontrando que a 4,0 x 109 conidios/mL hubo una mortalidad del 53% y 96% respectivamente después de cuatro semanas de inoculado el hongo. En condiciones de campo la mortalidad más alta de garrapatas ocurrió entre las semanas dos y tres. La mortalidad del grupo testigo fue del 3% en las garrapatas infectadas en condiciones de campo y del 2% para las inoculadas en condiciones de laboratorio.

Comparando los resultados de supervivencia obtenidos en el presente estudio con los investigadores anteriores, se observa un mayor efecto potencial de L. lecanii sobre B. microplus seguido por B. bassiana y M. anisopliae, concluyéndose que a medida que se aumentan las concentraciones del hongo disminuye la supervivencia de las garrapatas. Igualmente, Khodadad et al. (2007) en un estudio en Irán evaluaron la virulencia de 11 aislamientos nativos de hongos entomopatógenos; M. anisopliae (tres aislamientos), B. bassiana (seis aislamientos) y Lecanicillium psalliotae (Treschow) Zare & W. Gams (dos aislamientos) que fueron estudiados contra diferentes estados de desarrollo de Riphicephalus (Boophilus) annulatus (Say, 1821) a diferentes concentraciones 103, 105, 107 conidios/mL), encontrando que el porcentaje de mortalidad de las hembras ingurgitadas era dependiente de la dosis con respecto a la concentración conidial usada y los porcentajes de mortalidad total observados fueron de 90-100%, 70 y 56,6% para M. anisopliae (IRAN 437 C y DEMI 001), B. bassiana (IRAN 403 C) y L. psalliotae (IRAN 468 C) postinoculación con 107 conidios/mL, respectivamente.

En laboratorio, la patogenicidad de M. anisopliae sobre los adultos de I. scapularis fue evaluada encontrándose que la mortalidad de la garrapata I. scapularis fue positivamente relacionada con la concentración de esporas de M. anisopliae, como fue demostrado previamente con adultos y larvas de I. scapularis por Zhioua et al.1997 (citados por Benjamín et al. 2002). Una concentración de 106 conidios/mL tendría un efecto bajo en la mortalidad de garrapatas, mientras que una concentración de 107 conidios/mL produciría una mortalidad cercana al 50%. Similares resultados han sido registrados para B. microplus por otros autores (Benjamín et al. 2002). En cuanto a la conidiación, observada en los cadáveres de las garrapatas analizados en placas con azul de lactofenol para identificación, se encontró que a medida que aumenta la concentración del hongo también aumenta el porcentaje de garrapatas conidiadas (Tabla 4) y presentaron invasión total entre el noveno y catorceavo día postinoculación (Figs. 3A-E).

Cardona (2005) en estudios realizados con B. microplus, a 1,25 x 108 conidios/mL con M. anisopliae y B. bassiana en condiciones de laboratorio, encontró que a las dos semanas el 75% y el 90% de las garrapatas tratadas estaban completamente cubiertas por los hongos después de ocho días postinoculación. Benjamín et al. (2002) evaluaron el efecto de M. anisopliae y B. bassiana a 4,0 x 109 conidios/mL en I. scapularis observando que el hongo requiere dos semanas para invadirlas y que a mayor concentración de L. lecanii, se presenta mayor invasión de éste sobre la garrapata.

De los testigos el 45% resultaron infectados por hongos ambientales: Aspergillus sp. y Penicillium sp., bacterias: Staphylococcus aureus, Pseudomona sp. y Serratia sp., lo que concuerda con Jonsson (2004) quien plantea que muchas especies de bacterias como Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas spp., Staphylococcus spp., Serratia marcescens, Enterobacter cloacae, y Escherichia coli han sido aisladas de garrapatas.

En este estudio las garrapatas inoculadas con diferentes concentraciones del hongo L. lecanii presentaron infección por bacterias, pero no infección por bacterias y hongos al mismo tiempo (Tabla 4). El aclaramiento de estas garrapatas inoculadas con KOH al 5, 10, 15 y 20% y las preparaciones con azul de lactofenol mostraron que la conidiación fue la causa principal de su muerte.

Dosificación Media ± DE TL50 (Mediana) Testigo 20,2 ± 1,7 21 1,25 x 101 17,9 ± 3,7 19 1,25 x 105 15,6 ± 4,0 15 1,25 x 108 9,3 ± 2,6 10 Tabla 3. Estadísticos descriptivos para la supervivencia de garrapatas hembras inoculadas con L. lecanii, durante 21 días (n = 120).

Porcentaje de eclosión de huevos de B. microplus inoculados con L. lecanii. El porcentaje de eclosión, de la masa de huevos (0,1 g) al día ocho para la concentración 1,25 x 108 conidios/mL fue significativamente inferior al porcentaje para las demás concentraciones. (ANOVA Concentración: F3,36 = 12,2; P < 0,001). Khodadad et al. (2007) en un estudio en Irán al evaluar el efecto de aislamientos nativos de hongos entomopatógenos; M. anisopliae, B. bassiana y L. psalliotae sobre los huevos de R.(B.) annulatus a una concentración de 107 conidios/ml encontraron que dichos hongos disminuyeron el porcentaje de eclosión de los huevos siendo de 89,1%, 35,5% y 56,3% para cada especie.

Con respecto al porcentaje de supervivencia de las larvas provenientes de huevos de B. microplus, 21 días después de inoculación, los resultados mostraron que la concentración 1,25 x 108 conidios/mL presentó un porcentaje significativamente inferior al de las otras concentraciones (ANOVA Concentración: F3,36 = 94,5; P < 0,001). Este resultado se esperaba dado que las concentraciones mayores del hongo entomopatógeno poseen una mayor cantidad de conidios que se adhieren a la cutícula de la garrapata aumentando las probabilidades de que un mayor número de propágulos infectivos penetren y se multipliquen dentro del cuerpo de la garrapata, ocasionando daños, ya sea mecánicos (destrucción de tejidos), deficiencias nutricionales o liberación de toxinas que disminuyen la supervivencia (Steinhaus 1949; Tanada y Kaya 1993). Igualmente la densidad de los conidios debe lograr un umbral para alcanzar una efectiva penetración a la cutícula de la garrapata y la posterior muerte del hospedero (Benjamín et al. 2002). Cardona (2005), utilizando masas de huevos de 2,85 g e inoculándolas a la concentración 1,25 x 108 conidios/mL con M. anisopliae y B. bassiana en condiciones de laboratorio, encontró porcentajes de mortalidad superiores al 95% para ambos hongos.

Conclusiones

El uso de hongos entomopatógenos, la aplicación de extractos vegetales, el pastoreo conjunto o alternado con animales no aptos para la garrapata, así como la utilización de una vacuna antigarrapaticida, son alternativas de control que se hallan bajo evaluación. Los resultados del presente trabajo sugieren que el aislado de L. lecani (CIAT 215) debería ser probado en campo; en condiciones in Vitro el hongo mostró ser efectivo contra hembras teleoginas de B. microplus especialmente en la concentración 1,25 x108 conidios/mL que indujo un 100% mortalidad, un menor tiempo de supervivencia, un menor tiempo de oviposición y de eclosión de huevos provenientes de teleoginas de B. microplus inoculadas. Además, la habilidad de este aislado para penetrar la cutícula de garrapatas adultas y la duración del proceso de invasión total que para este caso fue entre el noveno y catorceavo día postinoculación, podría permitir en campo que garrapatas infectadas inoculen a las no infectadas.

Debido a la importancia económica que B. microplus representa al ser uno de los principales ectoparásitos presentes en la ganadería bovina, el estudio sobre su biología contribuye al mejor diseño de estrategias de control de esta garrapata. Más investigaciones sobre sus enemigos naturales, bioecología y dinámica de poblaciones permitirán mejorar puntos clave en los programas de control.

Agradecimientos

Los autores agradecen a los profesores Abel Díaz Cadavid por el análisis estadístico y la redacción de los resultados, Sandra Uribe Soto, Fabio Pineda Gutiérrez y Duverney Chaverra Rodríguez por las correcciones y aportes científicos a este manuscrito, Edison Cardona Zuluaga por el planteamiento y sugerencias al proyecto. A los compañeros del laboratorio de Micología y Microbiología de la Universidad de Antioquia por el soporte técnico y logístico en el desarrollo de esta investigación. A Jorge Henao y a Saulo Correa Zapata por el soporte técnico del equipo utilizado en esta investigación. Se agradece a la Corporación para el Estudio de Patologías Tropicales y al Instituto de Biología de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Antioquia por el apoyo logístico y técnico.

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Recibido: 4-ene-2007 • Aceptado: 24-mar-2008