Introducción
Tuta absoluta (Meyrick, 1917) (Lepidoptera: Gelechiidae) es una de las plagas principales a nivel suramericano y la principal plaga en varios países de Europa (De Vis et al. 2001; Desneux et al. 2010). Las larvas de T. absoluta son consideradas minadores de las hojas, barrenadores del tallo, perforadores de flores y frutos (Caffarini et al. 1999). El daño en la planta es iniciado desde el semillero y se extiende durante todo su desarrollo (López-Ávila 2002). Ataca cultivos de solanáceas y el daño más importante ocurre en cultivos de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) tanto bajo invernadero como al aire libre causando pérdidas en producción de hasta un 90 % (Desneux et al. 2010).
El principal método de control para T. absoluta es el químico, que a pesar de su rápido efecto presenta desventajas para la salud humana y el ambiente (Vargas 1996). Por esta razón el estudio de enemigos naturales ha cobrado importancia como método de control biológico. En Colombia se ha registrado la existencia de enemigos naturales como Apanteles gelechiidivoris (Marsh, 1975) (Hymenoptera: Braconidae) parasitoide de larvas de tercer estadio y responsable de más del 70 % de mortalidad de larvas en laboratorio (Agudelo y Kaimowitz 1997) y 80 % en campo, cuando es usado en combinación con el control etológico (Morales et al. 2014). El combinar estos dos métodos ha permitido mantener la plaga como secundaria y a niveles no económicos de daño, aumentando la productividad de los cultivos (López-Ávila 2002).
Uno de los procesos importantes para la producción masiva de A. gelechiidivoris es contar con la opción de almacenamiento en frío de pupas. De esta manera se obtiene una cantidad suficiente, constante (van Lenteren 2000) y en un mismo estado de desarrollo para ser liberado en campo (López y Botto 2005). La baja temperatura de almacenamiento es un método que permite aumentar la vida de los enemigos naturales reduciendo el desarrollo o la tasa metabólica del insecto. Cada parasitoide tiene diferente capacidad de tolerar las bajas temperaturas dependiendo de su historia evolutiva y adaptación (Colinet y Boivin 2011). Sin embargo, algunos reportes indican que las bajas temperaturas afectan la calidad de los insectos almacenados al disminuir el porcentaje de emergencia, los días de emergencia de los adultos, la longevidad y su capacidad reproductiva en campo, perjudicando su eficiencia al momento de ser liberados (Leopold 1998; Chen et al. 2008).
Según Rodrigues y Sampaio (2011) las bajas temperaturas, por prolongados periodos de tiempo, afectan parámetros biológicos de los insectos como longevidad, emergencia y fecundidad. Los estudios de Bajonero et al. (2008) revelan que la tasa de producción de huevos y la fecundidad en A. gelechiidivoris varía con la temperatura. La reducción en la fecundidad por efecto de la temperatura puede determinar un bajo parasitismo. Igualmente, la longevidad también puede aumentar por efecto de las bajas temperaturas (Jervis y Kidd 1996). Este factor afecta la duración del ciclo de vida de los individuos ya que para completar una fase de desarrollo se requiere cierta cantidad de unidades térmicas (grados día) (Orozco et al. 1990).
Actualmente no se conocen estudios relacionados con el efecto de diferentes temperaturas y días de almacenamiento en frío para A. gelechiidivoris. En este trabajo se evaluó el efecto de diferentes temperaturas y tiempos de conservación en frío sobre la emergencia, longevidad del estado de pupa y proporción sexual y porcentaje de parasitismo de adultos de A. gelechiidivoris.
Materiales y métodos
Área de estudio
Esta investigación se llevó a cabo durante 2011, en las instalaciones de la Facultad de Ciencias Básicas de la Universidad Militar Nueva Granada (UMNG) en el Campus Nueva Granada, localizado en Cajicá, Cundinamarca, bajo condiciones de laboratorio, con temperaturas de 18 ± 2 °C y 65 % de humedad relativa.
Fase de laboratorio
Se evaluó el efecto de temperaturas (4, 8 y 12 °C) y tiempos de almacenamiento [7, 14, 21 y 27 días de conservación en frío (DCF)] sobre emergencia, longevidad, proporción sexual y porcentaje de parasitismo de adultos de A. gelechiidivoris. Las temperaturas se eligieron teniendo en cuenta el umbral mínimo de desarrollo (4 °C) para el estado de pupa de A. gelechiidivoris definido por Bajonero et al. (2008). Se utilizaron neveras horizontales (Ultra-lab, Colombia) calibradas a 4 y 8 °C, y para la de 12 °C se utilizó una incubadora vertical (Thermo Scientific™, Precision™, Waltham, Estados Unidos). Los tiempos de almacenamiento se eligieron de acuerdo a estudios realizados en Apanteles galleriae (Wilkinson, 1932) (Hymenoptera: Braconidae) por Uçkan y Gülel (2001) donde a 6 °C, el parasitoide sobrevive por un período máximo de 15 días.
Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con estructura de tratamientos factorial (3x4) para los factores de temperatura y tiempo de almacenamiento. Se empleó como unidad experimental una caja de petri con una pupa de A. gelechiidivoris por caja. Se realizaron diez repeticiones por tratamiento.
Las pupas fueron tomadas de un pie de cría realizado en cajas plásticas de 0,30 x 0,11 x 0,20 m donde se colocaron hojas de tomate con larvas en tercer estadio y se liberaron adultos del parasitoide. Luego de, aproximadamente, un mes las pupas se individualizaban y se esperaba a que se tornaran de un color oscuro (próximas a emerger), lo que permitía que todas las pupas que iban a ser sometidas a los diferentes tratamientos tuvieran la misma edad.
Recolección de datos
Una vez cumplido el tiempo de almacenamiento definido en cada tratamiento, las cajas eran retiradas de su contenedor y trasladadas de inmediato a las condiciones climáticas del laboratorio. Se realizaron evaluaciones diarias de emergencia (número de adultos emergidos de la avispa/pupa), días de emergencia, donde se sumaron los días desde que el individuo fue introducido en la caja hasta su emergencia, longevidad (número de días que permanecen vivos los adultos del parasitoide una vez han emergido) y proporción sexual (adultos hembra/individuos totales).
Las avispas hembras que emergían de los diferentes tratamientos fueron llevadas a cajas plásticas, donde se les colocaba diariamente una hoja de tomate con 20 larvas de tercer estadio de T. absoluta hasta el momento de la muerte. Finalmente, se registraba el número de larvas parasitadas (porcentaje de parasitismo) y los adultos producidos en cada uno de los diferentes tratamientos. Para identificar las larvas parasitadas, se observó el color rosa presente en el abdomen y su comportamiento (movimiento lento).
Análisis estadístico
Se realizó un análisis de modelo lineal generalizado para todas las variables. Para la proporción sexual la sobrevivencia se asumió distribución binomial, mientras que para las otras variables se asumió distribución normal. Se tuvo en cuenta el efecto separado de las variables temperatura y días de almacenamiento, y el efecto de la interacción para conocer cómo se comporta la variable de respuesta en función de la combinación de factores.
Resultados y discusión
Temperatura vs días de emergencia
Aunque la posibilidad de lograr el almacenamiento de los parasitoides representa un avance importante para una unidad de producción, también es necesario determinar el tiempo de emergencia del adulto parasitoide después de retirar las pupas de los diferentes tratamientos de almacenamiento en frío, con el fin de programar adecuadamente los tiempos de liberación en campo del parasitoide. La temperatura no afectó el tiempo de emergencia, aunque la interacción entre tiempos de almacenamiento y temperaturas fue altamente significativa (p ≤ 0,001). A medida que aumentaron los días de almacenamiento en frío 4 °C se presentó un aumento significativo (p ≤ 0,001) en el tiempo de emergencia de los adultos. Esto debido al retraso de las actividades metabólicas después del tiempo de almacenamiento, siendo siete días de conservación en frío el tratamiento en el que menos tiempo transcurrió para que se diera la primera emergencia (Fig. 1).
A 4 y 8 °C, la emergencia más rápida se dio a los siete días de conservación en frío y disminuyó a medida que aumentaron los días de almacenamiento. Por el contrario, a temperatura de 12 °C las pupas emergieron más rápido cuando aumentó el tiempo de exposición al frío (28 DCF) (Fig. 1).
A 4 y 8 °C se detuvo el desarrollo embriónico de la pupa de A. gelechiidivoris, retrasando el tiempo de emergencia (Fig. 1). Esto también fue observado por Zúñiga y Gerding (2002) para Trichogramma nerudai (Pintureau y Gerding, 1999) (Hymenoptera: Trichogrammatidae). Ellos encontraron que las bajas temperaturas de almacenamiento afectaron el desarrollo de la pupa. En 12 °C, los adultos emergieron a los 4 días aproximadamente (Fig. 1). Esto se podría explicar porque, cuando la temperatura aumenta, en un rango favorable para el insecto, se acelera el metabolismo y, consecuentemente, incrementa la tasa de desarrollo (López y Botto 2005) lo que es desfavorable si se va a tomar esta temperatura como opción de almacenamiento, dado que no permitirá conservar los individuos por el tiempo mínimo (7 días).
Emergencia
La emergencia de los adultos del parasitoide varió significativamente por efecto de los días de almacenamiento y las temperaturas evaluadas (P < 0,05). La temperatura que presentó mayor emergencia de A. gelechiidivoris (100 %) fue la de 12 °C, sin embargo, no se considera apta para un programa de almacenamiento en frío porque, como se mencionó, emergen antes de ser retiradas del tratamiento (Fig. 2). Esto implica, que a esa temperatura no se logra reducir el metabolismo en forma suficiente para que el tiempo de almacenamiento pueda prolongarse por al menos siete días, que desde el punto de vista práctico, sería el tiempo mínimo que se esperaría ganar para un proceso de acopio del enemigo natural.
A 4 °C se presentó 50 % de emergencia menor al observado en el tratamiento de 8 °C, en todos los días de almacenamiento (Fig. 2). Algunas especies de parasitoides almacenados a 4 °C, no tienen los recursos y la energía suficiente para completar su desarrollo y emerger (Colinet y Boivin 2011).
Un ejemplo de esto fue registrado por Ayvaz et al. (2008) en los Trichogrammatidae Trichogramma cacoeciae (Marchal, 1927) (Hymenoptera: Trichogrammatidae), Tr. brassicae (Bezdenko, 1968) y Tr. evanescens (Westwood, 1833) donde la emergencia disminuyó después de haber sido almacenados a 4 °C por tres semanas. Al igual que para Lysiphlebus testaceipes (Cresson, 1880) (Hymenoptera: Braconidae) y Schizaphis graminum (Rondani, 1852) (Hemiptera: Aphididae) los cuales al ser almacenados a 4 y 5 °C disminuyen su emergencia a medida que aumenta el período de almacenamiento de 4 a 45 días (Rodrigues et al. 2003; Rodrigues et al. 2004). Rundle et al. (2004) también reportaron que temperaturas menores a 10 °C para Tr. carverae (Oatman y Pinto, 1987), tienen efectos negativos en el porcentaje de emergencia, al igual que para Telenomus podisi (Ashmead, 1893) (Hymenoptera: Scelionidae) donde bajas temperaturas afectan el desarrollo del individuo negativamente, disminuyendo su porcentaje de emergencia (Bayram et al. 2005).
En la temperatura de 8 °C se pudieron conservar los individuos de A. gelechiidivoris por más tiempo (hasta 21 días) con 50 % de emergencia (Fig. 2).
Para los días de almacenamiento se encontró un efecto altamente significativo (P < 0,01). Se observó que a medida que aumentan, disminuye el porcentaje de emergencia en un 60 %, siendo siete días el tratamiento que presentó la mayor emergencia en todas las temperaturas evaluadas (Fig. 2). En parasitoides solitarios como A. gelechiidivoris se presenta una mortalidad más alta cuando se incrementa la duración y disminuye la temperatura de almacenamiento. Lo que sugiere que el retraso y el daño son procesos acumulativos, pues no solo se retrasa el tiempo de emergencia, sino que aumenta la mortalidad. Esto también se encontró para A. galleriae, donde adultos sometidos a 6 °C por más de siete días mueren, al disminuir su actividad metabólica hasta detenerla por completo (Uçkan y Gülel 2001) y para Aphidius colemani (Viereck, 1912) (Hymenoptera: Braconidae) donde la falta de reservas de energía baja la sobrevivencia de las avispas después de 21 días de exposición al frío (Colinet et al. 2006). En esta variable no se observó un efecto significativo en la interacción entre las variables de temperatura y días de almacenamiento.
Proporción sexual
La proporción de hembras a los siete días de almacenamiento a 4 °C, fue de 0,87 ± 0,12 (promedio ± error estándar) y para 8 °C y 12 °C fue de 0,7 ± 0,14, a los 14 días de almacenamiento. En 4 °C se obtuvo una proporción de hembras de 0,5± 0,25, en 8 °C fue de 1 ± 0 y en la de 12 °C fue de 0,7 ± 0,19. Para los 21 días de almacenamiento a 4 °C se obtuvo una proporción de hembras de 0,3 ± 0,27, a 8 °C, 0,6 ± 0,22 y a 12 °C de 0,8 ± 0,18. A los 28 días de almacenamiento la proporción de hembras expuestas a 4 °C, 8 °C y 12 °C fue de 0,5 ± 0,35. Estos resultados sugieren que no existe un efecto significativo de las temperaturas y los días de almacenamiento o su interacción en la cantidad de hembras producidas (P > 0,05), lo que implica que no hay mortalidad de pupas dependiendo del sexo debido al almacenamiento en frío.
Lo anterior coincide con lo registrado por Weiser et al. (2004) quienes no encontraron diferencias en la proporción sexual de Habrobracon hebetor (Say, 1836) (Hymenoptera: Braconidae) cuando las pupas fueron sometidas a diferentes periodos de almacenamiento. Foerster y Doetzer (2006) no encontraron relación entre la duración del almacenamiento y la proporción sexual en Telenomus remus (Nixon, 1937) (Hymenoptera: Platygastridae). En el caso de parasitoides Hymenoptera donde la hembra es capaz de escoger el sexo de su progenie controlando la fertilización (determinación haplodiploide), las bajas temperaturas pueden modificar la proporción de sexos en los insectos producidos (Colinet y Boivin 2011). Este fenómeno pudo presentarse causando la disminución en la cantidad de hembras producidas en las diferentes temperaturas, sin importar el tiempo de exposición.
Longevidad
Se observaron efectos significativos al considerar el efecto lineal y cuadrático de los días de almacenamiento (P < 0,05) y la interacción entre la temperatura y efecto cuadrático de los días de almacenamiento (P < 0,05). A medida que aumentaban los días de almacenamiento en las temperaturas de 8 y 12 °C, disminuye la longevidad de las pupas, siendo siete días de almacenamiento cuando se presentó la mayor longevidad (Fig. 3). Foerster et al. (2004) encontraron disminución en la longevidad de Trissolcus basalis(Wollaston) (Hymenoptera: Scelionidae) yT. podisi cuando las pupas son sometidas a bajas temperaturas durante el almacenamiento. Esta disminución se debe a que los individuos tienen recursos limitados los cuales gastan para el crecimiento, reproducción y mantenimiento (Chen et al. 2011).
Esto no coincide con lo observado en el tratamiento a 4 °C, donde aumentó la longevidad en los adultos que estuvieron expuestos a 21 y 28 días. Esto se puede explicar debido a que la baja emergencia a estas temperaturas (Fig. 3) generó alta mortalidad, reduciendo drásticamente el número de adultos evaluados. En relación a los otros días de almacenamiento (7 y 14 días) se observó disminución que puede ser explicada porque después de estar sometidas a prolongados tiempos de exposición al frío, pueden sufrir de inanición, pérdida de agua y acumulación de metabolitos tóxicos que pueden causar la muerte o reducir la capacidad física de adaptarse al medio ambiente (Chen et al. 2011).
A 8 °C se presentó la mayor longevidad (9 días) a 7 y 14 días de almacenamiento (Fig. 3), lo que concuerda con Bajonero et al. (2008) donde la longevidad en condiciones adecuadas para el parasitoide fue de 8 días en promedio.
Parasitismo
No solo es importante conocer a que temperatura y por cuántos días almacenar las pupas del parasitoide, sino cómo se afecta la capacidad parasítica de los individuos que van a ser liberados en campo. Se encontró que hay efecto significativo de las temperaturas y días de almacenamiento sobre el porcentaje de parasitismo, al igual que los días de almacenamiento (P < 0,05).
La temperatura que registró el menor parasitismo en todos los días de almacenamiento fue 4 °C, con un porcentaje máximo de 25 % (Fig. 4). Estos resultados coinciden con Colinet y Boivin (2011), quienes indican que una baja temperatura afecta el sistema reproductivo, causando retardo de la maduración del huevo o malformación en los órganos reproductivos de ambos sexos, disminuyendo la habilidad para parasitar y, por lo tanto, los porcentajes de parasitismo de Euchalcidia caryobori (Hanna, 1934) (Hymenoptera: Chalcididae). Foerster y Nakama (2002) encontraron que hay una disminución en la fecundidad de las hembras de T. basalis yT. podisicuando son sometidas a bajas temperaturas. A 8 y 12 °C, se encontró que el porcentaje de parasitismo fue mayor que el registrado a 4 °C.
Los días de almacenamiento presentaron un efecto negativo significativo (P < 0,05) disminuyendo el porcentaje de parasitismo a medida que aumenta el tiempo de conservación en frío. Yilmaz et al. (2007) observaron una reducción en la tasa de parasitismo de T. evanescens sobre huevos de Ephestia kuehniella (Zeller, 1879) (Lepidoptera: Pyralidae) cuando fue almacenada a 9 y 12 °C, y cuando se incrementa la duración del almacenamiento. Para el parasitoide H. hebetor se ha encontrado que el parasitismo sobre larvas de Plodia interpunctella (Hubner, 1813) (Lepidoptera: Pyralide) disminuye con el incremento en los días de almacenamiento, registrando porcentajes de 44 % a 72 horas y de 90 % a 24 horas. Luczynski y Shi (2007) y Leopold (1998) sugieren que esto se debe a que el almacenamiento en frío, induce estrés oxidativo en las células, reduciendo las actividades metabólicas, lo que induce deshidratación y anoxia (falta o disminución de oxígeno en las células).
Lo anterior también fue encontrado por Khosa y Bar (2000), Pitcher et al. (2002) y Ozder (2004) quienes reportaron que el porcentaje de parasitación disminuyó con el incremento en el período de almacenamiento. Para Trichogramma chilonis (Ishii, 1941) (Hymenoptera: Trichogrammatidae) disminuyó a 53 % en 60 días, en el caso de Tri. ostriniae (Pang y Chen, 1974) (Hymenoptera: Trichogrammatidae), disminuyó con más de 4 semanas de almacenamiento, y para T. cacoeciae el porcentaje de parasitismo fue menor a 8 °C a medida que aumentan los días de almacenamiento.
El porcentaje de parasitismo más alto (80 %) fue encontrado en 8 °C, al emplear un almacenamiento de siete días, seguido por el 60 % alcanzado a los 14 días (Fig. 4) bajo la misma temperatura. Lo anterior permite establecer que las pupas cumplen con los parámetros de calidad de agentes de control biológico producidos masivamente (van Lenteren 2009) si son almacenadas a 8 °C, por máximo 14 días.
A pesar de la efectividad de A. gelechiidivoris como enemigo natural de T. absoluta, la viabilidad de su uso depende de la posibilidad de producirlo masivamente y asegurar un suministro suficiente y oportuno al agricultor, con individuos de un nivel adecuado de calidad. Las condiciones de almacenamiento juegan un papel fundamental en la producción comercial de enemigos naturales, ya que muchos de ellos presentan una demanda marcadamente estacional dependiendo de las épocas de siembra de los cultivos en los que se utilizan.
En caso de no disponerse de técnicas de almacenamiento por periodos convenientes de tiempo, las instalaciones de cría deben adecuarse para efectuar incrementos de producción durante las épocas de alta demanda, con los problemas que eso puede conllevar, como aumento de los costos variables de producción y, posiblemente, reducción de la calidad. De modo similar, en periodos de baja demanda de los enemigos naturales, las unidades de cría son subutilizadas, lo que de nuevo es inconveniente desde el punto de vista económico, dado que hay que incurrir en costos fijos para mantener operando la unidad de producción (Van Driesche y Bellows 2001).
En Colombia la siembra del tomate se realiza durante todo el año, aunque tiene un comportamiento periódico semestral: durante el primer semestre el área sembrada va de un 6 % aproximadamente en enero hasta alcanzar su máximo en marzo (aproximadamente 12 % del área sembrada anualmente), mientras que en el segundo semestre se incrementa desde julio (aproximadamente 7 %) hasta su máximo en septiembre (nuevamente 12 % del área sembrada anual) y de nuevo decae hasta finalizar el año (Agronet 2016). Al tomar en cuenta que a una temperatura promedio de 20 °C el tiempo de desarrollo de A. gelechiidivoris está en torno a 34 días (Bajonero et al. 2008), una unidad de cría del parasitoide debe empezar a incrementar el número de cohortes en producción desde los inicios de diciembre de cada año, hasta alcanzar aproximadamente el doble en torno a la mitad de enero, con el fin de lograr un volumen de producción adecuado hacia la segunda semana de febrero y así contar con la producción requerida durante marzo, teniendo un margen de tiempo de almacenamiento de dos semanas a 8 °C.
A partir de la tercera semana de enero el número de cohortes en producción puede disminuir de nuevo gradualmente hasta la mitad en mayo, para suplir bajos volúmenes del parasitoide en junio, momento en el cual la proyección descrita en el primer semestre se deberá repetir en forma similar, para suplir la demanda máxima del parasitoide en agosto. Los volúmenes de demanda por parte de los clientes en cuanto a cantidades y momentos requeridos para la entrega son difíciles de pronosticar, y los periodos de almacenamiento en el caso de los parasitoides y depredadores no son tan amplios como en el caso de agentes de control biológico microbianos como virus y bacterias que pueden almacenarse en estado latente por meses e incluso años (van Lenteren 2003).
Pese a lo anterior, contar con un periodo de almacenamiento permite tener un margen de maniobra entre el proceso de producción y la comercialización, que también es de utilidad cuando los tiempos de entrega son prolongados debido a las distancias entre las unidades de producción de enemigos naturales y las zonas de cultivo, caso en el cual deben garantizarse las características de calidad biológica de los individuos después del transporte.
Conclusión
La temperatura de 4 °C a largos periodos de almacenamiento de 21 y 28 días, afecta negativamente el porcentaje de emergencia de adultos y de parasitismo. Para conservar en condiciones ideales para su uso en campo, las pupas de Apanteles gelechiidivoris deberían ser almacenadas a 8 °C por un periodo de 14 días, condiciones que no afectan parámetros claves como porcentaje de emergencia y de parasitismo.