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Introducción
La arañita roja bimaculada, Tetranychus urticae (Koch, 1836) (Acari: Tetranychidae), es un ácaro plaga altamente polífago y cosmopolita, con presencia en 1.140 especies de plantas (Migeon y Dorkeld 2017). Algunas poblaciones de este ácaro han desarrollado resistencia a diferentes principios activos utilizados para su control (Van Leeuwen et al. 2010), causando que se deban utilizar mayores cantidades de producto, mayor número de aplicaciones y combinación de diferentes productos comerciales en su control. Esto además conduce a una disminución significativa de la fauna benéfica. La búsqueda de nuevos principios activos y la creciente popularidad de la producción orgánica han motivado numerosas investigaciones en el uso de plantas para encontrar alternativas para controlar este ácaro (Hincapié et al. 2008; Afify et al. 2012; Araújo et al. 2012).
Una planta que se ha estudiado, y a la que se le ha encontrado cierto grado de toxicidad, es Blechnum cordatum (Desv.) Hieron, especie común en Centroamérica, Las Antillas y en todos los países de Sudamérica (Prada et al. 2008; Ramos et al. 2006). Se ha determinado in vitro que diferentes extractos de esta planta causan mortalidad sobre Galleria mellonella L., 1756 (Lepidoptera: Pyralidae) (Zapata et al. 2016) y muestran actividad inhibidora del crecimiento en Drosophila melanogaster (Meigen, 1830) (Diptera: Drosophilidae) (Hincapié et al. 2011) y de G. mellonella (Zapata et al. 2016). Uno de los grupos de compuestos que se encuentran en la familia Blechnaceae, a la que pertenece esta especie, son los fitoecdisteroides (FEs), también conocidos como fitoecdisonas (Prada et al. 2008; Hincapié et al. 2011). Los FEs son triterpenos esteroidales con estructura similar a los ecdisteroides que se encuentran de forma natural en insectos. En las plantas participan en la defensa contra invertebrados fitófagos no adaptados, principalmente porque poseen actividad que interfiere con los procesos de muda de los mismos (Gorelick-Feldman et al. 2008) o por su actividad disuasora de la alimentación (Malausa et al. 2006; Rharrabe et al. 2011). Los FEs, junto con otros terpenoides (drimanos, clerodanos, limonoides y agarofuranos), son los más promisorios agentes antialimentarios en plantas, que aunque pueden ser tóxicos, matan principalmente a los insectos de hambre (Descoins 2001). Se ha determinado que los FEs presentes en diferentes especies de helechos son los responsables de que sean relativamente resistentes al ataque de insectos (Mannan et al. 2008). Se ha encontrado que al alimentar larvas de Acrolepiopsis assectella (Zeller, 1839) (Lepidoptera: Acrolepiidae) con dietas que contienen FEs se inducen efectos patofisiológicos (Arnault y Sláma 1986). Las dietas ricas en dichos compuestos causaron una mortalidad del 80 % en el segundo ínstar de la larva de Cryptorhynchus lapathi L., 1758 (Coleoptera: Curculionidae) (De-fu et al. 2002).
Los ecdisteroides son hormonas que juegan un papel esencial en la muda y la metamorfosis de los insectos (Riddiford 2012). Los mecanismos de regulación del desarrollo y la reproducción por parte de estos compuestos han sido investigados exhaustivamente en los órdenes Diptera y Lepidoptera, pero pocos estudios se han realizado para identificarlos y determinar su papel sobre la fisiología de otros insectos y otros artrópodos, tales como los ácaros (Horigane et al. 2007). En estos últimos se destacan unos pocos estudios en garrapatas (orden Ixodida Leach, 1815) enfocados principalmente en vitelogénesis y oogénesis (Horigane et al. 2007; Ogihara et al. 2007; Seixas et al. 2008; Cabrera et al. 2009) y con algunos concentrados en muda (Horigane et al. 2007; Horigane et al. 2008; Seixas et al. 2008). En ellos se concluyó que los ecdisteroides pueden ser las hormonas principales reguladoras del crecimiento en las especies de garrapatas estudiadas (Horigane et al. 2007). Un trabajo realizado sobre Oligonychus perseae (Tuttle, Baker y Abbatiello, 1976) (Acari: Tetranychidae) determinó que los compuestos 20-hidroxiecdisona (20-E) y ciasterona tuvieron una influencia significativa sobre la fecundidad y la mortalidad de adultos (Aly et al. 2011). Se han reportado efectos de los ecdisteroides y FEs en mamíferos, tales como el incremento en la síntesis de proteína de los músculos esqueléticos (Gorelick-Feldman et al. 2008), efectos anabólicos (Bathori et al. 2008), inhibición de células MCF-7, línea celular del cáncer derivada del adenocarcinoma de pecho (Gaube et al. 2008), corrección de la hiperglicemia y prevención de las complicaciones derivadas de la diabetes en el hígado, páncreas y riñones en ratas (Hamden et al. 2008). El objetivo de este estudio fue evaluar la toxicidad y la repelencia de diferentes fracciones obtenidas a partir de B. cordatum sobre T. urticae y aislar e identificar los fitoecdisteroides presentes en las más efectivas.
Materiales y métodos
Material vegetal
Se recolectaron hojas jóvenes de B. cordatum en la ribera sur del río Chillán (36º38ʼ33,47”S, 72º12ʼ40,42”O, 81 msnm), Provincia del Ñuble, Región del Bio-Bio, Chile, en mayo de 2010. Se depositaron los especímenes en el herbario del departamento de Ciencia Básica de la Universidad del Bio-Bio (Voucher Nº: 2010/05).
Preparación de extractos y fracciones
Muestras del material vegetal de B. cordatum recolectadas se deshidrataron usando aire a temperatura ambiente (20 ± 5 °C; 68 ± 5 % HR; 72 h.). Enseguida, se sometieron a molienda usando un molino manual. El material resultante (646,5 g) se sometió a extracción con metanol l (1:3, p/v) durante 24 horas, cinco veces. El extracto resultante se concentró a presión reducida a 40 °C usando un rotoevaporador (Waterbath-B-480, Büchi Labortechnik AG, Flawil, Suiza) para eliminar en su totalidad el metanol. El extracto obtenido (198,2 g) se disolvió en una solución 60/40 metanol/agua destilada (1:3, p/v) y se puso en embudo de separación donde se lavó con n-hexano (150 mL, cinco veces). La fase hexánica se concentró a presión reducida a 40 °C usando un rotoevaporador. La fase metanol/agua resultante se sometió al mismo procedimiento usando acetato de etilo (EtOAc) (1:1, v/v). Las dos fases resultantes se concentraron a presión reducida a 40 °C usando un rotoevaporador (Muñoz et al. 2013).
Cría del ácaro
Se colectaron especímenes de T. urticae en diferentes cultivos de la región y se multiplicaron sobre plantas de frijol cargamanto (Phaseolus vulgaris L.) en condiciones de invernadero en el Campus Laureles de la Universidad Pontificia Bolivariana, Medellín, Colombia de acuerdo con el método citado por Hincapié et al. (2008). Las condiciones de la ciudad son 22,5 ± 5,5 °C, HR 68 ± 5 %, fotoperiodo promedio L12:O12 y 1497 msnm) (IDEAM 2014). Las condiciones ambientales del invernadero no fueron controladas ni medidas.
Biensayo de mortalidad acumulada sobre T. urticae
Todos los experimentos con el ácaro se realizaron en condiciones de laboratorio, controladas mediante el sistema de acondicionamiento de aire y sistema de iluminación (temperatura 23 ± 2 °C, HR 62 ± 2 %, fotoperiodo promedio L12: O12). Se transfirieron y mantuvieron por 48 horas (Miresmailli e Isman 2006) 100 hembras adultas de T. urticae a la cara abaxial de hojas de P. vulgaris, de esta forma se obtuvieron huevos de aproximadamente la misma edad. Esta operación se repitió todas las veces que fue necesario durante el experimento. Se recolectaron 20 huevos de forma aleatoria para cada una de las repeticiones. Una vez obtenido el material biológico se prepararon tres concentraciones (10, 100 y 250 ppm) a partir de las fracciones con acetato de etilo y n-hexano disolviéndolas en agua destilada y usando tween 80 (0,02 %) como emulsificante, además un testigo negativo (agua destilada y la misma concentración de tween 80). No se usó testigo positivo. Discos de hoja de 14 mm de diámetro de P. vulgaris fueron sumergidos en cada solución durante diez segundos y se dejaron secar hasta que no presentaran humedad en su superficie. Los discos se ubicaron sobre papel de filtro humedecido para mantener su humedad, con su cara abaxial hacia arriba, en cajas de Petri de cuatro cm de diámetro. Se ubicaron los huevos recolectados sobre la superficie de cada disco de hoja tratado (Hincapié et al. 2008). Se dejaron eclosionar y se tomó como población inicial las larvas eclosionadas. Se registraron cada 24 horas los individuos vivos y muertos en cada estadio de desarrollo (larva, ninfa y adulto) durante 12 días, cuando se dio por terminado el experimento (adaptado de Hincapié et al. 2011).
Se consideraron muertos si no se observaba movimiento después de ser tocados suavemente en varias ocasiones con un pincel. Los valores porcentuales de individuos en cada estadio fueron calculados usando las siguientes fórmulas:
donde n es el número de ácaros. Los resultados se corrigieron usando la fórmula de Abbott (1925).
Bioensayo de mortalidad en adultos de T. urticae
Se evaluaron cuatro concentraciones de las fracciones obtenidas con acetato de etilo y n-hexano (250, 1.000, 2.500 y 5.000 ppm) de acuerdo con pruebas preliminares. Todas las fracciones fueron disueltas en agua destilada usando tween 80 (0,02 %) como emulsionante. El testigo negativo se preparó solo con agua destilada y tween 80 (0,02 %) y un testigo positivo usando un producto comercial con base en abamectina al 1,8 % a 750 ppm (dosificación recomendada por el fabricante). Discos de hoja de 30 mm de diámetro fueron tratados como se ha descrito en los bioensayos anteriores. Se colocaron 15 hembras adultas de T. urticae, seleccionadas al azar de la cría establecida, en la cara abaxial de los discos tratados y se registró la mortalidad a las 24, 48 y 72 horas después de iniciado el experimento. La mortalidad se verificó como se describió (Hincapié et al. 2008; Pavela et al. 2016). El porcentaje de mortalidad fue calculado así:
donde n es el número de ácaros, ti es el tiempo cero o de inicio del experimento, to es el tiempo de observación. Los resultados se corrigieron usando la fórmula de Abbott (1925).
Bioensayo para determinar repelencia sobre T. urticae
Se siguió el protocolo establecido por Boyd y Alverson (2000) adaptado por Hincapié et al. (2008). Se evaluaron tres concentraciones de las fracciones obtenidas con acetato de etilo (100, 250 y 500 ppm) y con n-hexano (1, 10 y 50 ppm). Todas las fracciones fueron disueltas en agua destilada usando tween 80 (0,02 %) como emulsionante. El testigo negativo se preparó usando solo agua destilada y tween 80 (0,02 %) y el testigo positivo usando un producto comercial con base en ajo a 750 ppm, por la comprobada actividad repelente de ese tipo de extractos (Boyd y Alverson 2000; Dąbrowski y Seredyńska 2007; Hincapié et al. 2008). Discos de hoja de P. vulgaris de 35 mm de diámetro fueron sumergidos dentro de cada solución, se dejaron secar hasta que no se observara humedad en su superficie y se ubicaron con la cara abaxial hacia arriba sobre papel filtro humedecido para mantener su humedad en cajas de Petri de 4 cm de diámetro. Se ubicó en el medio del disco tratado un disco de hoja de 14 mm de diámetro sin tratar (DST) con su cara abaxial hacia arriba y a ese disco se transfirieron 15 hembras adultas de T. urticae, seleccionadas aleatoriamente de la cría establecida. Se registraron los ácaros que se mantenían en el disco sin tratar 1, 2, 3, 4 y 24 horas. El porcentaje de repelencia fue calculado de la siguiente manera:
donde n es el número de ácaros, ti es el tiempo cero o de inicio del experimento, to es el tiempo de observación y DST es el disco sin tratar.
Diseño experimental y análisis estadístico
Se usaron diseños completamente al azar para cada uno de los experimentos (Edwards et al. 2010; Sivira et al. 2011) con cinco repeticiones por tratamiento. Se aplicaron las pruebas de Shapiro-Wilk y Levene para verificar los supuestos de la varianza (normalidad y homocedasticidad, respectivamente). Los resultados porcentuales, en fracción, en cada experimento fueron transformados usando la función arcoseno, Vx/100, previamente a la ejecución del análisis de varianza (ANOVA) (α = 0,05) en cada tiempo de observación. Se usó la prueba de Tukey cuando se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos. Se usó el programa SAS 8.0 (SAS Institute Inc. 1999) para mortalidad y repelencia de adultos y el programa Statgraphics® Centurion XVI (Statgraphics Technologies 2013) para mortalidad acumulada y determinación de CL50.
Aislamiento e identificación de fitoecdisteroides
Se aislaron e identificaron los fitoecdisteroides de la fracción más activa (n-hexano). La fracción se sometió a cromatografía de columna en sílica gel (Merck, Kenilworth, N.J.; EE. UU.; Si-gel grade 60, 70-230, 60 A°) usando un gradiente de polaridad desde n-hexano al 100 % hasta acetato de etilo al 100 %. A partir de la polaridad intermedia (n-hexano/acetato de etilo: 30/70) fue obtenida una mezcla rica en esteroles agrupada en una sola fracción, que fue sometida a una nueva cromatografía de columna. Los principales componentes obtenidos en ésta fueron purificados e identificados con base en evidencia espectroscópica (IR, RMN-1H y RMN-13C). El espectro RMN (250 MHz para 1H y 65 MHz para 13C) se midió en CDCl3 (que también proporcionó la señal de bloqueo) con espectrómetros Bruker (AC-250). El cambio químico 13C fue asignado con la mejora sin distorsión por la polarización de transferencia (DEPT) usando un ángulo de giro de 135°. Un experimento NOESY fue realizado para determinar la estereoquímica del grupo -OH en C-6. El espectro IR fue registrado en un equipo Shimadzu FTIR-8400. Las rotaciones ópticas fueron medidas en cloroformo a 25° C (Alarcón et al. 2013).
Resultados
Determinación de la incidencia de los extractos sobre las mortalidades en cada estadio y sobre la mortalidad acumulada en T. urticae cuando el tratamiento se realiza desde la etapa larval.
La fracción hexánica, a una concentración de 100 ppm, (HB100) causó una mortalidad del 46,11 % de los individuos en el estadio larval, la cual fue significativamente más alta que la registrada en los demás tratamientos. La fracción con acetato de etilo a 250 ppm (AB250) registró una tasa significativamente mayor de mortalidad de los individuos cuando se encontraban en el estadio ninfal (64,39 %) que los demás tratamientos, seguida de las fracciones hexánica a 250 ppm (HB250) y la obtenida con acetato de etilo a 100 ppm (AB100) (54,61 y 49,68 %, respectivamente) pero sin diferencias estadísticamente significativas entre estas dos últimas. Con respecto a los individuos que llegaron a la edad adulta, se registraron mortalidades significativamente más altas con los tratamientos realizados con las fracciones hexánica a 250 ppm (HB250), 100 ppm (HB100) y la obtenida con acetato de etilo a 10 ppm (AB10). Al analizar la mortalidad acumulada se determinó que los tratamientos significativamente más efectivos, en cuanto a mortalidad, son HB250. HB100 y AB100, sin diferencias estadísticamente significativas entre ellos (Tabla 1).
Tabla 1 Porcentaje de mortalidad de individuos de Tetranychus urticae en cada estadio y mortalidad acumulada.
| Tratamiento | Larvas | Intervalo de confianza | Ninfas | Intervalo de confianza | Adultos | Intervalo de confianza | Mortalidad acumulada | Intervalo de confianza |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| HB250 | 10,85 b | (7,06-14,69) | 54,61 b | (46,21-62,81) | 13,72 a | (8,42-19,02) | 79,18 a | (69,88-88,48) |
| HB100 | 46,11 a | (42,32-49,90) | 18,04 cd | (9,84-26,34) | 10,55 ab | (5,25-15,85) | 74,70 a | (65,40-84,00) |
| HB10 | 10,00 bc | (6,21-13,79) | 23,82 c | (15,62-32,02) | 1,97 c | (-3,33-7,27)) | 35,79 c | (26,48-45,08) |
| AB250 | 6,75 c | (2,96-10,54) | 64,39 a | (56,19-72,59) | 8,41 b | (3,11-13,71) | 79,55 a | (70,25-88,85) |
| AB100 | 6,74 c | (2,95-10,53) | 49,68 b | (41,48-57-88) | 0,20 c | (-5,10-5,50) | 56,62 b | (47,32-65,92) |
| AB10 | 6,30 c | (2,51-10,09) | 11,66 d | (3,46-19,86) | 12,15 ab | (6,85-17,45) | 30,11 c | (20,82-39,42) |
Las medias con la misma letra dentro de cada columna no presentan diferencias estadísticamente significativas según la prueba de Tukey (df = 29; P ≤ 0,05) (StatPoint Technologies, Inc.2010). La mortalidad fue corregida usando la fórmula de Abbott.
Mortalidad de adultos
A las 24 y 48 horas de exposición se encontró que la fracción obtenida con acetato de etilo a 5.000 ppm (AB5000) presentaba diferencias estadísticamente significativas (P ≤ 0,05) con respecto a los demás tratamientos. A las 72 horas después de la exposición AB5000 no presentó diferencias significativas con el testigo positivo (producto comercial) ni con los tratamientos realizados con la fracción hexánica a 2.500 y 5.000 ppm (HB2500 y HB5000 respectivamente). Estas dos últimas sí presentaron diferencias significativas con el resto de los tratamientos (Tabla 2).
Tabla 2 Tasa de mortalidad (%) de hembras adultas de Tetranychus urticae.
| Tratamiento | Porcentaje de mortalidad en cada tiempo de observación (horas) | ||
|---|---|---|---|
| 24 | 48 | 72 | |
| HB5000 | 29,68 (± 2,61) c | 39,68 (± 4,51) c | 60,32 (± 4,51) b |
| HB2500 | 21,00 (± 5,35) cd | 25,76 (± 4,65) cd | 56,50 (± 1,92) b |
| HB1000 | 15,56 (± 1,92) d | 28,89 (± 1,92) cd | 35,56 (± 1,92) c |
| HB250 | 1,33 (± 0,12) d | 1,76 (± 0,15) d | 2,22 (± 0,16) d |
| AB5000 | 57,78 (± 9,71) b | 66,67 (± 5,77) b | 74,53 (± 3,49) ab |
| AB2500 | 8,89 (± 3,85) d | 13,33 (± 5,77) d | 22,22 (± 1,92) cd |
| AB1000 | 6,67 (± 3,33) d | 8,89 (± 3,85) d | 13,33 (± 3,33) d |
| AB250 | 0,00 (± 0,00) d | 0,00 (± 0,00) d | 0,00 (± 0,00) d |
| Testigo positivo | 100,00 (± 0,00) a | 100,00 (± 0,00) a | 100,00 (± 0,00) a |
Las medias con la misma letra dentro de cada tiempo de observación (columna) no son diferentes significativamente según la prueba de Tukey (df = 49; P ≤ 0,05) (SAS Institute 2004). La mortalidad fue corregida usando la fórmula de Abbott. Testigo negativo: agua destilada + tween 80. Testigo positivo: Producto comercial con abamectina como ingrediente activo a 750 ppm.
En la Tabla 3 se pueden observar las CL50 de las dos fracciones para las pruebas de mortalidad acumulada cuando se sometió al ácaro desde su estadio larval y la de mortalidad cuando se aplicaron los tratamientos directamente sobre los adultos. Se puede observar que no hay diferencia significativa de las CL50 para las dos fracciones analizadas en todos los tiempos de observación dentro de cada prueba. Sin embargo, sí se encontraron diferencias significativas entre pruebas, mostrando claramente una mayor mortalidad cuando se somete al ácaro desde su estadio larval respecto al tratamiento que cuando se aplica directamente al adulto. No se obtuvo una CL50 significativa para los tiempos 24 y 48 para la fracción hexánica en la prueba de mortalidad de adultos dado que no se presentaron mortalidades superiores al 50 % con dichos tratamientos (Tabla 2).
Tabla 3 Concentración letal media (CL50) de las fracciones analizadas sobre hembras adultas de Tetranychus urticae.
| Tipo de fracción | CL 50 (ppm) para las pruebas de mortalidad acumulada y mortalidad en hembras adultas | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Mortalidad acumulada | Mortalidad en adultos | |||||||
| 12 días | I.C. | 24 horas | I.C. | 48 horas | I.C | 72 horas | I.C. | |
| Hexano | 41,05 | (-39,15-86,22)a | N.S. | - | N.S. | - | 2816,72 | (331,59-5340,92)b |
| Acetato de etilo | 89,44 | (49,47-127,18)a | 4717,76 | (4129,26-5640,84)b | 4256,97 | (3723,04-5007,70)b | 3741,20 | (3215,04-4430,41)b |
Las CL50 obtenidas son significativas estadísticamente (P ≤ 0,05 en la tabla de análisis de desviaciones) dado que existe una relación estadísticamente significativa entre las variables concentración y mortalidad, con un nivel de confianza del 95,0%. N.S.: No es significante (P > 0,05 en la tabla de análisis de desviaciones) (StatPoint Technologies, Inc.,2010). Las CL50 con la misma letra no presentan diferencias estadísticamente significativas entre sí por el análisis de los intervalos de confianza (I.C.).
Repelencia
Se observó actividad repelente significativa (P ≤ 0,05) para los tratamientos realizados con las fracciones hexánicas a 10, 50 y 100 ppm (66,20 %, 95,78 % y 100 %, respectivamente, a las 24 horas de observación) y con las obtenidas con acetato de etilo a 250 ppm, hasta las 4 horas de observación (75,01 %) y a 500 ppm, para todos los tiempos registrados (95,75 % a las 24 horas de observación), en comparación con los testigos negativo y positivo (producto comercial con extracto de Allium sativum como ingrediente activo). Todas las concentraciones usadas de la fracción hexánica y la fracción obtenida con acetato de etilo a 500 ppm (AB500) fueron significativamente superiores al testigo positivo en todos los tiempos de observación (Tabla 4).
Tabla 4 Tasa de repelencia (%) durante cada tiempo de observación.
| Tratamiento | Horas después del tratamiento | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 24 | |
| HB100 | 100,00 (± 0,00) a | 100,00 (± 0,00) a | 100,00 (± 0,00) a | 100,00 (± 0,00) a | 100,00 (± 0,00) a |
| HB50 | 93,75 (± 2,89) a | 93,75 (± 2,89) a | 94,24 (± 2,89) a | 100,00 (± 0,00) a | 95,78 (± 2,89) a |
| HB10 | 56,23 (± 5,77) b | 49,96 (± 7,64) b | 65,40 (± 5,00) a | 80,01 (± 7,64) a | 66,20 (± 7,64) b |
| AB500 | 100,00 (± 0,00) a | 100,00 (± 0,00) a | 100,00 (± 0,00) a | 100,00 (± 0,00) a | 95,78 (± 2,89) a |
| AB250 | 74,99 (± 2,89) a | 74,99 (± 2,89) a | 71,16 (± 2,89) a | 75,01 (± 2,89) a | 0,00 (± 0,00) c |
| AB100 | 12,44 (± 7,64) d | 0,00 (± 0,00) c | 0,00 (± 0,00) c | 0,00 (± 0,00) d | 0,00 (± 0,00) c |
| Testigo negativo | 0,00 (± 0,00) d | 0,00 (± 0,00) c | 0,00 (± 0,00) c | 0,00 (± 0,00) d | 0,00 (± 0,00) c |
| Testigo positivo | 37,52 (± 7,64) c | 12,38 (± 5,77) c | 16,78 (± 5,60) c | 20,09 (± 4,33) c | 15,46 (± 2,83) c |
Las medias con la misma letra dentro de cada tiempo de observación (columna) no son diferentes significativamente según la prueba de Tukey (df = 39; P ≤ 0,05) (SAS Institute 2004). Testigo negativo: agua destilada + tween 80. Testigo positivo: producto comercial con extracto de Allium sativum como ingrediente activo a 750 ppm.
Aislamiento e identificación de fitoecdisteroides
La fracción más activa en los tres tipos de bioensayos fue la obtenida a partir de n-hexano. A partir de ella se aislaron e identificaron los siguientes cuatro Fes: ecdisona, ponasterona, shidasterona y 2-deoxicrustecdisona (Fig. 1). A continuación, se expone la información detallada que permitió la elucidación de las estructuras.
Figura 1 Fitoecdisteroides aislados de la fracción hexánica de Blechnum cordatum. A. Ecdisona. B. Ponasterona A. C. Shidasterona. D. 2-deoxicrustecdisona.
Ecdisona (A). H RMN (C5D5N): δ 4,17 (m, 1H, H-2), 4,21 (m, 1H, H-3), 3,01 (dd, 1H, H-5), 6,25 (d, 1H, H-7), 3,56 (m, 1H, H-9), 2,51 (s, 1H, H-17), 1,21 (s, 3H, H-18), 1,06 (s, 3H, H-19), 2,12 (s, 1H, H-20), 1,58 (s, 3H, H-21), 3,87 (m, 1H, H-22), 1,36 (s, 3H, H-26), 1,36 (s, 3H, H-27), C RMN(C5D5N): δ 38,08 (C-1), 68,10 (C-2), 68,10 (C-3), 32,45 (C-4), 51,41 (C-5), 203,36 (C-6), 121,61 (C-7), 165,53 (C-8), 34,63 (C-9), 38,76 (C-10), 21,20 (C-11), 31,49 (C-12), 47,70 (C-13), 83,97 (C-14), 32,03 (C-15), 26,74 (C-16), 48,28 (C-17), 15,89 (C-18), 24,55 (C-19), 43,04 (C-20), 13,74 (C-21), 74,07 (C-22), 25,69 (C-23), 42,55 (C-24), 68,80 (C-25), 30,09 (C-26), 30,01 (C-27).
Ponasterona A (B). HRMN (DMSO-d6) δ 3,60 (m, 1H, H-2), 3,76 (s, 1H, H-3), 1,57 (m, 2H, H-4), 2,20 (dd, 1H, H-5), 8,51 (s, 1H, H-7), 3,0 (ddd, 1H, H-9), 2,23 (t, 1, H-17), 0,76 (s, 3H, H-18), 0,83 (s, 3H, H-19), 1,05 (s, 3H,H-21), 3,13 (dd, 1H, H-22), 0,86(s, 3H, H-26), 0,85 (s, 3H, H-27), C RMN (DMSO-d6) δ 36,6 (C-1), 66,8 (C-2), 66,6 (C-3), 31,6 (C-4), 50,1 (C-5), 202,7 (C-6), 120,4 (C-7), 165,2 (C-8), 33,2 (C-9), 37,6 (C-10), 20,3(C-11), 30,9(C-12), 46,9(C-13), 83,0(C-14), 30,3(C-15), 20,1(C-16), 48,7(C-17), 17,1(C-18), 23,9(C-19), 75,6(C-20), 20,9(C-21), 75,6(C-22), 29,1(C-23), 36,1(C-24), 27,5(C-25), 23,0(C-26), 22,3(C-27).
Shidasterona (C). H RMN (C5D5N): δ 4,10 (m, 1H, H-2), 4,19 (ddd, 1H, H-3), 2,95 (dd, 1H, H-5), 6,29 (d, 1H, H-7), 3,53 (ddd, 1H, H-9), 1,06 (s, 3H, H-18), 1,06 (s, 3H, H-19), 1,39 (s, 3H, H-21), 4,06 (dd, 1H, H-22), 1,22 (s, 6H, H-26,H-27), C RMN (C5D5N): δ 37,7 (C-1), 67,9 (C-2), 67,9 (C-3), 32,2 (C-4), 51,2 (C-5), 203, 5(C-6), 121,5 (C-7), 166,0 (C-8), 34,2 (C-9), 38,5(C-10), 21,0 (C-11), 31,5 (C-12), 47,7 (C-13), 84,0 (C-14), 31,5 (C-15), 21,5 (C-16), 51,2 (C-17)17,8 (C-18), 24,3 (C-19), 80,3 (C-20), 21,0 (C-21), 84,8 (C-22), 27,6 (C-23), 38,8 (C-24), 75,4 (C-25), 28,2 (C-26), 28,7 (C-27), MS m/z 485 ([M + Na] + 13,7%), 463 ([M + H] + 55%), 445 ([M+H-H2O] + 24%), 123 (100 %).
2-deoxicrustecdisona (D). H RMN (C5D5N): δ 3,83 (m, 1H, H-3), 2,29 (dd, 1H, H-5), 6,23 (d, 1H, H-7), 3,70 (ddd, 1H, H-9), 3,02 (t, 1H, H-17), 1,22 (s, 3H, H-18), 0,98 (s, 3H, H-19), 1,59 (s, 3H, H-21), 3,88 (brd, 1H, H-22), 1,37 (s, 3H, H-26), 1,37 (s, 3H, H-27), C RMN(C5D5N): δ 31,71 (C-1), 27,43 (C-2), 68,07 (C-3), 38,62 (C-4), 51,34 (C-5), 203,43(C-6), 121,63 (C-7) , 166,02 (C-8), 34,46 (C-9), 37,95(C-10), 21,09 (C-11), 31,99(C-12), 48,09 (C-13), 84,18 (C-14), 32,37 (C-15), 21,40 (C-16), 50,08 (C-17), 17,84 (C-18), 24,41 (C-19), 76,85 (C-20), 21,09 (C-21), 77,54 (C-22), 27,40 (C-23) 42,46 (C-24) , 69,56 (C-25), 29,96 (C-26) , 29,96 (C-27). MS m/z (int.rel): 464 ([M], 1), 446 [M-H2O], 2), 347 (52), 329 (100), 285 (46), 234 (43), 147 (28), 121 (29), 99 (31).
De acuerdo con la inspección detallada de los datos que proporcionan los espectros 1H y 13C RMN para los compuestos A-D, permite observar en ellos señales características para compuestos del tipo fitoecdisteroides. En los compuestos A, C y D es posible apreciar un protón entre 6,25, 6,29 y 6,23 ppm respectivamente, que es asignable al protón del sistema carbonilo α,β-insaturado, que los fitoecdisteroides presentan en el anillo B. En el compuesto B, producto del efecto solvente se observa mismo protón a 8,51 ppm. Lo anterior se confirma con la señal alrededor de 203 ppm correspondiente a un carbonilo la cual se asigna al C-6. Esta señal se acompaña de una insaturación de los carbones C-7 y C-8, observándose estos a 121 y 166 ppm respectivamente. El desplazamiento a campo bajo de C-22 (84,8 ppm) y C-25 (75.4) en el espectro C RMN del compuesto C, permite postular la presencia de una función éter entre estos carbonos de la cadena lateral. La comparación de los datos espectroscópicos obtenidos con los reportados en la literatura confirma las estructuras reportadas.
No era objetivo del estudio realizar una identificación de todos los compuestos en la fracción ni los compuestos específicos responsables de las actividades encontradas.
Discusión
En el bioensayo donde se aplicaron los tratamientos a los discos de hoja, se ubicaron huevos de T. urticae y se registró la mortalidad de los ácaros desde el estadio de larva, la fracción hexánica de B. cordatum mostró ser la más efectiva, pues desde una concentración de 100 ppm se registró una reducción acumulada de la población del 74,7 % (Tabla 1). En contraste, exponer a hembras adultas a las fracciones evaluadas requirió concentraciones significativamente superiores (5.000 ppm) para obtener una tasa de mortalidad inferior (60,32 %) (Tabla 2) a las obtenidas con el experimento de mortalidad acumulada. La fracción hexánica a 250 ppm causó una mortalidad acumulada, en el respectivo bioensayo, de 79,18 % (Tabla 1) mientras que la misma concentración en el bioensayo de exposición directa a adultos solo generó una mortalidad de 2,22 % a las 72 horas (Tabla 2). Los ensayos de repelencia mostraron que, aún a concentraciones muy bajas, se presentaron altas tasas de actividad repelente de ambas fracciones, especialmente la hexánica con 80,01 % a 10 ppm (concentración varios órdenes de magnitud más baja que las usadas en el experimento de mortalidad de adultos), 4 horas después de la aplicación (Tabla 4). Estos resultados sugieren que la exposición temprana a dicha fracción debido, por lo menos en parte, a un posible efecto antialimentario de los compuestos presentes, evidenciado por la actividad repelente registrada, aún a concentraciones muy bajas. Las bajas tasas de mortalidad registradas cuando se exponen los adultos al tratamiento sugieren que, a pesar de existir indicios de toxicidad, no es esta actividad la principal responsable de la mortalidad acumulada registrada. No se encontraron investigaciones donde se hayan realizado este tipo de comparaciones en ácaros. Sin embargo, sí se encontraron algunos estudios realizados sobre insectos. Hincapié et al. (2011) encontraron que fracciones de la misma naturaleza de B. cordatum causaron pupación temprana y altas tasas de mortalidad acumulada en individuos de D. melanogaster expuestos a los tratamientos desde estadios larvales tempranos.
Algunos de los fitoecdisteroides reportados en este estudio han sido encontrados también en algunas especies de la familia Blechnaceae. Tal es el caso de la shidasterona (Takemoto et al. 1968) y ponesterona (Takemoto et al. 1969), ambas en B. niponicum; y ecdisona en B. minus (Chong et al. 1970) y B. vulcanicum (Russell et al. 1981). Como se ha mencionado, hay ausencia de información con respecto a la actividad disuasoria de los FEs en ácaros. Sin embargo, los efectos disuasorios de algunos ecdisteroides en insectos son bien conocidos. En cuatro ínstares de P. interpunctella alimentados con una dieta que contenía cuatro ecdisteroides que también se encuentran en forma común en plantas (FEs), (20-E), ponasterona A (PonA), polipodina B (PolB), y makisterona A (MakA), se encontró que evadían el alimento dependiente de la concentración de dichos FEs, que fue desde 2 a 30 mM (milimolar) (Rharrabe et al. 2011). En otro experimento, la ingestión de estos cuatro FEs a 200 ppm sobre la misma especie de insecto causó disminución en el peso larval, indujo el canibalismo e incrementó la mortalidad, causada por una disrupción en el desarrollo (Rharrabe et al. 2010). Se ha encontrado que 20-E es un efectivo disuasor alimentario para larvas del primer ínstar de Spodoptera littoralis (Boisduval, 1833) (Lepidoptera: Noctuidae) y Ostrinia nubilalis (Hübner, 1796) (Lepidoptera: Crambidae) (Marion-Poll y Descoins 2002). Se comprobó que el sensillum gustatorio de larvas de Mamestra brassicae L., 1758 (Lepidoptera: Noctuidae) responde a bajas concentraciones de 20-E y PonA (Descoins y Marion-Poll 1999). Es importante recordar que PonA fue identificada también en este estudio como uno de los FEs presentes en B. cordatum.
Los ensayos de mortalidad en adultos mostraron que se necesitan altas concentraciones de las fracciones evaluadas para causar toxicidad directa sobre el ácaro adulto. Aly et al. (2011) encontraron que aplicando estándares comerciales de ecdisterona y 20-E a 5 ppm sobre O. perseae (Tetranychidae), se registraron tasas de mortalidad de 63,3 % y 50 %, respectivamente. La diferencia en las concentraciones que causan efecto tóxico puede deberse a la baja concentración que tienen los FEs encontrados en las fracciones de B. cordatum, pero sería necesario cuantificar los mismos en dichos extractos, lo cual no fue uno objetivo de este estudio.
Conclusiones
Los extractos de B. cordatum, principalmente los de naturaleza apolar, constituyen una alternativa para el control de T. urticae, especialmente cuando su aplicación se hace desde el estadio larval. También, dichos extractos tienen un alto potencial para su uso como repelentes del ácaro. Los resultados obtenidos sugieren que los FEs identificados, dados sus antecedentes de actividad antialimentaria, juegan un papel importante en la actividad acaricida y en la repelencia registradas. El efecto repelente pudo no haber permitido la adecuada alimentación de los individuos, llevándolos a la muerte, cuando se aplicó el extracto desde el estadio larval. Para poder comprobar este planteamiento deben adelantarse, en el futuro, experimentos que permitan elucidar los mecanismos de acción de los ecdisteroides y FEs sobre T. urticae y otros ácaros. Estudiar el papel de los FEs sobre ácaros tetraníquidos abre la puerta para que puedan ser usados para su control.
