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Introducción
Los hongos entomopatógenos constituyen un grupo ampliamente diseminado en el medio ambiente que provocan infecciones fungosas a poblaciones de artrópodos (Díaz et al. 2006). Las especies más importantes por su distribución son Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin y Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin (Cañedo y Ames 2004). Estos agentes infectan insectos, a través de la penetración de la cutícula, ejerciendo múltiples mecanismos de acción, evitando que el hospedero desarrolle resistencia (Motta-Delgado y Murcia-Ordoñez 2011). La producción de hongos para el control de plagas involucra técnicas para su producción masiva, formulación y estrategias de aplicación (Butt y Goettel 2001). Al respecto, Meyling y Eilenberg (2007) afirman que para su utilización como agentes de control biológico es necesario realizar prácticas agrícolas que propicien las condiciones ambientales de humedad relativa y temperatura para favorecer la actividad de infección de los entomopatógenos, además de una selección de cepas con alta patogenicidad y virulencia sobre sus hospederos.
La infección de los hongos depende de las propiedades de la cutícula como el grosor, la esclerotización y la presencia de sustancias antifúngicas y nutricionales (Charnley 1992), así como de otros atributos que determinan su virulencia frente a sus hospedantes (Zibaee y Bandani 2009). También las enzimas específicas que degradan la cutícula como las lipasas, quitinasas, proteasas, quimoelastasas y quimotripsina, tienen relación con la virulencia (Gupta et al. 1994). Respecto a la temperatura, el hongo Isaria javanica (Friederichs & Bally) Samson & Hywel-Jones es conocido como hongo mesófilo y algunas especies son más tolerantes a alta temperatura que otras. El crecimiento de Isaria fumosorosea (Wize) es, generalmente, mayor a temperaturas bajas que altas (Fargues et al. 1992). Con relación a esto, varios autores coinciden en que la temperatura óptima de crecimiento de estos hongos se encuentra entre 25 a 30 °C (Wilding 1970; Vanegas 2006; Bugeme et al. 2008). En este sentido, Ruelas-Ayala et al. (2013) encontraron que entre 28 a 34 °C se disminuye el crecimiento de B. bassiana de 28 a 79 %, mientras que en M. anisopliae fue de 24 a 31 %, por lo tanto este hongo fue más tolerante a temperaturas altas. Por lo anterior, es recomendable combinar dos o más cepas de hongos como agentes de control en campo, en función a sus adaptaciones a su entorno para que los aislamientos funcionen (Seid et al. 2019).
Algunas especies de hongos pueden confundirse con otros géneros, dependiendo de su condición reproductiva sexual o asexual; al respecto, en M. anisopliae, estudios filogenéticos junto con evidencias morfológicas soportan la monofilia de nuevos taxa. Kepler et al. (2014) realizaron estudios moleculares para establecer la relación de este género con otras especies. También Bischoff et al. (2009) evaluaron la filogenia del complejo M. anisopliae e identificaron nueve especies mediante la morfología y secuencias de los genes EF-1, RPB1, RPB2.
Respecto al crecimiento de hongos en medios suplementados, González García et al. (2001) observaron aumentos significativos de patogenicidad de cuatro aislados de B. bassiana, cuando se subcultivaron en medio suplementado con integumento de broca del café Hipothenemus hampei (Ferrari, 1867), variando de 80 a 100% con un tiempo letal de 3,2 y 3,7 días, respectivamente; confirmando que el integumento actúa como fuente de nutrición de algunos hongos aumentando su patogenicidad. Por otro lado, Vejar-Cota et al. (2017) caracterizaron morfológicamente cepas de B. bassiana, M. anisopliae e I. javanica, además midieron durante 21 días su crecimiento, encontrando que el intervalo de crecimiento de estas cepas varió entre 2,05 y 3,03 mm/día. Torres de la C. et al. (2013) encontraron una tasa de crecimiento de 2,63 ± 0,18 mm/día a 25 °C para 17 aislamientos de M. anisopliae.
Por otro lado, se ha estudiado la relación de la virulencia de cepas de B. bassiana y M. anisopliae con respecto a la tolerancia a temperatura (Fargues et al. 1992; McCammon y Rath 1994; Selman et al. 1997; Vidal et al. 1997). Seid et al. (2019) al evaluar la germinación y tasa de crecimiento de seis cepas de B. bassiana de origen ártico y tropical a 8 y 12 °C, encontraron que los aislamientos de origen ártico mostraron mayor germinación y tasa de crecimiento que las de los trópicos. Tres de los aislamientos se probaron in vivo para determinar la temperatura de infección sobre larvas de Tenebrio molitor L., 1758 (Coleoptera: Tenebrionidae), los resultados indicaron que las condiciones en el medio natural no reflejan directamente el efecto del ambiente biótico como la infección del huésped, por lo que la selección de aislados se debe basar en la virulencia y también en consideraciones de la condición abiótica para que los aislamientos funcionen.
Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue inducir el desarrollo de cepas de B. bassiana, M. anisopliae e I. javanica con medios de cultivo suplementados con polvos de tres insectos plaga, y evaluar su macromorfología, crecimiento radial y tolerancia a la temperatura.
Materiales y métodos
Selección de cepas y viabilidad de esporas. Las cepas B1 (B. bassiana), M1 (M. anisopliae) y HPI-210 (I. javanica) fueron obtenidas de la colección de hongos entomopatógenos del laboratorio de Bioinsecticidas del CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa. La viabilidad de las esporas se determinó de acuerdo con el método de Inglis et al. (2012), la solución de esporas se puso en agitación en un tubo eppendorf de 1,5 ml con agua destilada, a partir de esta se hicieron soluciones seriadas para obtener 1 x 107 conidios/ml. La suspensión se sembró en cajas Petri con una capa delgada de PDA (10 mm) dentro de una campana de bioseguridad (Telstar bio-11-A). Las cajas se incubaron a 28 °C en una cámara bioclimática (Felisa®) por un periodo de 18-24 h. Después se cortó 1 cm2 de PDA con el hongo y se colocó sobre un portaobjetos para observar la muestra en un microscopio óptico (BOECO) a 40X y contar el número de conidios germinados. Se registraron solo los conidios cuyo tubo germinativo fue dos o más veces mayor al diámetro del conidio, se consideró una cepa viable a aquella con un número de conidios germinados mayor a 90 % (Vélez et al. 1997).
Preparación del suplemento
Se utilizaron larvas y pupas del barrenador de la caña de azúcar Diatrea considerata (Heinrich, 1931), del gusano cogollero Spodoptera frugiperda (J. E. Smith, 1797) y del gusano de la cera Galleria mellonella (L., 1756), provenientes del laboratorio de Bioinsecticidas del CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa. Los insectos se sacrificaron por enfriamiento y después de secaron en una estufa (JSGI-10T) a 50 °C durante tres días, al retirarlos se molieron en un mortero hasta obtener un polvo fino que se pasó a través de una malla de 500 mm. El polvo así obtenido fue secado en una estufa a 50 °C durante 24 h para eliminar la humedad restante.
Elaboración del medio de cultivo suplementado
A un vaso de precipitados con 500 ml de agua destilada se le agregaron 19,5 g de agar dextrosa papa (PDA) y se adicionaron 2 g de suplemento del polvo del insecto correspondiente. El caldo preparado se colocó en una plancha de calentamiento con agitación (CIMAREC), posteriormente se esterilizó en un autoclave (All American 25-x) por 15 min a 120 °C y una presión de 1,25 Kg/cm². El medio de cultivo se vació en cajas Petri estériles, vertiendo 20 ml de cada uno de ellos bajo una cámara de flujo laminar (Cobeal HLV no. 04010-INP-3,5AMP).
Cosecha y concentración de conidios
Los conidios de las cepas B1, M1 y HPI-210 de las cajas Petri fueron cosechados y puestos en tubos Falcón con 10 ml de Tween 80 al 0,25 %, en una campana de bioseguridad (Telstar bio-11-A). Se hicieron diluciones hasta obtener 1 x 107 esporas/ml; se colocaron 300 µl de la suspensión de conidios a tubos eppendorf, la cual se usó como suspensión madre para hacer diluciones seriadas, de cada una de estas se tomaron 15 µl y se pusieron entre el cubreobjetos y la cámara de Neubauer (30 x 70 y 4 mm). El conteo de conidios se realizó en un microscopio óptico marca BOECO a 40 y 100 X.
Macromorfología de las cepas
Las características morfológicas de color y aspecto de las cepas de B. bassiana y M. anisopliae suplementadas se hizo mediante la observación microscópica, una vez que se alcanzó el máximo desarrollo de los hongos, se comparó su morfología con las características descritas por Alcocer (1979), Brady (1979) y Padilla et al. (2000). En el caso de la cepa de I. javanicus se usaron las claves de Brown y Smith (1957) y Shimazu y Takatsuka (2010).
Siembra y desarrollo de las cepas
Para calcular el crecimiento radial se consideraron aspectos utilizados por Zervakis et al. (2001) y Ruelas-Ayala et al. (2013). En términos generales el procedimiento fue el siguiente: en el punto central de las cajas Petri, para cada cepa se colocaron discos de papel filtro estéril de 6 mm de diámetro, en cada disco se pusieron 2 µl de la suspensión conidial, las cajas inoculadas se incubaron en una cámara bioclimática (Telstar bio-11-A), la lectura del crecimiento de las cepas en las cajas se realizó cada 24 h durante 15 días; la variable de crecimiento en mm/d se hizo midiendo el diámetro de la colonia en dos ejes cardinales marcados al reverso de las cajas con un vernier Petrul® (VER-6PX).
Evaluación del desarrollo de las cepas a diferentes temperaturas
Se evaluó el crecimiento radial de las diferentes cepas en medio PDA con suplemento de cada insecto y un control PDA. En cada caja se colocó un círculo de 6 mm de diámetro con 2 µl de la suspensión de conidios, a 25, 28, 30, 35 y 40 °C, estas se incubaron en la cámara bioclimática. La lectura del crecimiento de las cepas en las cajas se realizó cada 24 h durante 15 días; la variable de crecimiento en mm/d se hizo midiendo el diámetro de la colonia en dos ejes cardinales marcados al reverso de las cajas con el mismo vernier (Ruelas-Ayala et al. 2013).
Análisis estadísticos
Para comparar los datos de crecimiento radial de las diferentes cepas en los medios con suplemento, se utilizó un diseño estadístico de bloques completamente al azar. Para determinar la interacción entre las tres cepas, las tres especies de insectos más el control y las cinco temperaturas se utilizó un análisis factorial 3x4x5 con tres repeticiones por cepa, el análisis de los datos se hizo mediante un ANOVA y para determinar diferencias significativas entre las medias se aplicó la prueba de rango múltiple de Tukey (α = 0,05) usando el programa SAS v.9 (SAS Institute Inc. 2009).
Resultados y discusión
Macromorfología
Para asegurar que se trabajó con las cepas adecuadas, se corroboró que las características morfológicas correspondieran a las de las claves taxonómicas mencionadas para cada especie (Fig. 1) observando el aspecto de las colonias de las cepas de B. bassiana (B1), M. anisopliae (M1) y I. javanica (HPI-210). La textura que presentaron las colonias de B1 al inicio de su desarrollo fue algodonosa de color blanco a beige, cambiando a amarillas pulverulentas durante el crecimiento micelial. Las características de la cepa B1 coincidieron con las descritas por Alcocer (1979). En el caso de M1 la morfología se mantuvo en una textura algodonosa formando halos de color blanco, beige y verde en la maduración de la cepa. La cepa HPI-210 inicialmente fue de aspecto algodonoso blanco, tornándose gris después de esporular. Respecto a M1 Brady (1979) menciona que M. anisopliae en PDA presenta micelio con borde blanco, mientras que Padilla et al. (2000) obtuvieron colonias algodonosas, aterciopeladas y compactas; en el caso de la cepa HPI-210 I. javanicus se observó que sus características corresponden a las descritas por Brown y Smith (1957) y Shimazu y Takatsuka (2010).
Efecto del suplemento y la temperatura
En la Tabla 1 se muestran los resultados estadísticos del crecimiento de las cepas con los suplementos a diferentes temperaturas. Los mejores resultados del efecto del suplemento y la temperatura en el crecimiento de las cepas se obtuvo a 28 °C; en el caso de B1 al utilizar el suplemento de D. considerata se obtuvo un crecimiento de 2,76 ± 0,06 mm/d y con HPI-210 3,27 ± 0,06 mm/d, mientras que para M1 (2,62 ± 0,08 ± mm/d). A 30 °C B1 creció 0,45 ± 0.03 mm/d en el mismo medio suplementado y con M1 1,22 ± 0,03 mm/d con S. frugiperda. No se observó crecimiento de ninguna de las cepas a 35 y 40 °C. El crecimiento diario de estas cepas fue superior al obtenido por Vejar-Cota et al. (2017) quienes determinaron un crecimiento sin suplementos de B. bassiana de 2,29 mm y para I. javanica (HPI-210) 2,07 mm/d. Por otro lado, Torres de la C. et al. (2013) encontraron una tasa de crecimiento micelial de M. anisopliae similar a nuestros resultados.
Tabla 1 Crecimiento radial de Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae e Isaria javanica suplementado con polvo de macerado de tres insectos a diferente temperatura.
| Cepa | Tratamiento polvo | Crecimiento radial ( |
||
|---|---|---|---|---|
| 25 °C | 28 °C | 30 °C | ||
| B1 | PDA + D. considerata | 2,59 ± 0,02 ab | 2,76 ± 0,06 a | 0,45 ± 0,03 f |
| PDA + S. frugiperda | 2,63 ± 0,02 ab | 2,63 ± 0,11 ab | 0,40 ± 0,04 f | |
| PDA + G. mellonella | 2,20 ± 0,02 d | 2,44 ± 0,02 bc | 0,14 ± 0,07 g | |
| PDA | 2,29 ± 0,03 cd | 1,80 ± 0,03 e | 0,40 ± 0,07 f | |
| M1 | PDA + D. considerata | 2,64 ± 0,06 a | 2,62 ± 0,08 ab | 0,86 ± 0,07 de |
| PDA + S. frugiperda | 2,41 ± 0,37 ab | 2,46 ± 0,04 ab | 1,22 ± 0,03 d | |
| PDA + G. mellonella | 2,72 ± 0,06 a | 2,77 ± 0,02 a | 0,48 ± 0,03 e | |
| PDA | 2,24 ± 0,11 b | 1,80 ± 0,07 c | 0,87 ± 0,04 d | |
| HPI-210 | PDA + D. considerata | 3,07 ± 0,07 ab | 3,27 ± 0,06 a | * |
| PDA + S. frugiperda | 3,03 ± 0,17 abc | 2,81 ± 0,10 bc | * | |
| PDA + G. mellonella | 2,76 ± 0,05 c | 3,02 ± 0,03 abc | * | |
| PDA | 2,92 ± 0,13 bc | 1,94 ± 0,12 d | * | |
1. Medias con la misma letra en la misma columna no muestran diferencias significativas (Tukey = 0,05). 2. Se omitieron las temperaturas de 35 y 45 °C ya que no presentó crecimiento en ninguno de los casos. 3. Se resaltó el mayor crecimiento para cada cepa. * No se presentó crecimiento de la colonia.
Estos resultados indicaron que las tres cepas fueron inducidas para crecer mejor en los medios suplementados con los tres insectos, este efecto se observó en la morfología de las cepas de los tres hongos (Fig. 1). En este sentido, González García et al. (2001) observaron incrementos significativos en el crecimiento de cuatro aislados de B. bassiana cuando se cultivaron en medio suplementado con integumento de broca del café, donde este aumento varió de 80 a 100 % con un tiempo letal de 3,2 y 3,7 días, confirmando que el integumento actúa como fuente de nutrición de algunos hongos.
En relación al efecto de la temperatura en el crecimiento de los hongos, varios autores coinciden en que la temperatura óptima es de 25 a 30 °C (Wilding 1970; Vanegas 2006; Bugeme et al. 2008). I. javanica con D. considerata mostró mayor crecimiento a 28 °C 3,27 ± 0,06 y no presentó crecimiento a partir de los 30 °C. No obstante, I. fumosorosea crece mejor a temperaturas bajas que altas (Fargues et al. 1992). En todos los casos se observó bajo crecimiento a 30 °C y no hubo crecimiento a 35 y 40 °C. Al respecto, Ruelas-Ayala et al. (2013) encontraron que la tasa de disminución del crecimiento de B. bassiana fue de 28 a 79 % y en M. anisopliae de 24 a 31 %, siendo esta última más tolerante a altas temperaturas.
En el estudio para determinar el efecto de los suplementos a diferentes temperaturas, el ANOVA indicó que la cepa M1 con suplemento de S. frugiperda fue la más tolerante a temperatura de 30 °C (F = 38,33, E8, P = 0,0001) (Tabla 2), por lo que los hongos B1 y M1 mostraron tolerancia a esta temperatura; esto se puede deber a que son originarios de Sinaloa, donde la temperatura media anual es de 25 °C y la máxima varía de 44 a 47 °C; mientras que HPI-210 es proveniente del estado de Morelos, donde se registran temperaturas de 21 a 32 °C. Con base a esto, se puede suponer que existe una relación estrecha entre lugares de origen y la tolerancia a altas temperaturas, como lo sugieren otros estudios (Fargues et al. 1992; McCammon y Rath 1994; Selman et al. 1997; Vidal et al. 1997; Ruelas-Ayala et al. 2013).
Tabla 2 Valores de F y (P) del ANOVA realizado para determinar el efecto de los suplementos en las diferentes cepas a tres temperaturas.
| Cepa | Temperaturas | ||
|---|---|---|---|
| 25 °C | 28 °C | 30 °C | |
| Beauveria bassiana B1 | 18,73 (0,0006) | 48,76 (0,0001) | 5,43 (0,2449) |
| Metarhizium anisopliae M1 | 3,10 (0,0899) | 20,7 (0,0004) | 38,33 (0,0001) |
| Isaria javanica HPI-210 | 2,75 (0,1120) | 25,24 (0,0001) | 41,0 (0,0001) |
Conclusiones
El uso de medios suplementados con polvo de las tres especies de lepidópteros logró inducir el desarrollo óptimo de cepas de B. bassiana (B1), M. anisopliae (M1) e I. javanica (HPI-210) a 28 °C. Las cepas B1 y M1 crecieron más a 30 °C en los tratamientos con suplementos de D. considerata y S. frugiperda, en HPI-210 no hubo crecimiento. Las cepas B1 y HPI-210 con D. considerata mostraron el mayor crecimiento radial; M1 creció más con G. mellonella a 28 °C. El medio suplementado con polvo de estos insectos logró también aumentar la tasa de crecimiento de los hongos a las tres temperaturas, lo que permite seleccionar a alguna de estas cepas con base en su macromorfología, mayor crecimiento radial y tolerancia a la temperatura para evaluar su virulencia contra insectos plaga.
