INTRODUCCIÓN

Para incrementar la vida en servicio, la manufactura, el transporte y el almacenamiento de la madera y de diversos productos maderables, estos deben ser tratados con productos químicos tóxicos a los microorganismos que causan su destrucción; estos productos son comúnmente conocidos como preservantes (^{Antwi y Damoah, 2010}; ^{González et al., 2015}). Dentro de estos resaltan los fungicidas sintéticos como las sales a base de cobre-cromo-arsénico (CCA), cobre-cromo-boro (CCB) y cobre-amonio cuaternario (ACQ), entre otros. Estos, si bien garantizan una elevada protección de la madera, muestran el inconveniente de posible lixiviación, ocasionando la pérdida de algunos de sus componentes al medioambiente. Por otra parte, los problemas toxicológicos en la salud de muchas personas en contacto directo con ciertos productos químicos empleados en la industria de la preservación de la madera (pentaclorofenol, CCA, CCB, ACQ) e incluso con la madera ya tratada, hacen necesario el estudio y búsqueda de productos alternativos capaces de inhibir el desarrollo de los agentes causantes de la pudrición en la madera, pero que a su vez presenten una adecuada inocuidad ecológica y toxicológica (^Peredo,1993; ^{Schultz y Nicholas, 2000}; 2002; Antwi y Damoah, 2010; ^{Singh y Singh, 2012}).

Muchas de las especies latífoliadas que presentan una transición abrupta albura-duramen poseen una particular bioresistencia al deterioro por acción de hongos, bacterias y al ataque de insectos. Esta resistencia se encuentra generalmente atribuida a la presencia, en las paredes celulares de las fibras, de sustancias químicas activas que desempeñan un papel importante en la durabilidad natural, ya que proporcionan propiedades fungicidas, fungistáticas, hidrofóbicas, quelantes y antioxidantes que eliminan o inhiben la actividad enzimática, el crecimiento y desarrollo de los agentes xilófagos (^{Hillis, 1987}; ^{Sjöström, 1981}; ^{Eaton y Hale, 1993}; ^{Suttie y Orsler, 1996}; ^{Schultz y Nicholas, 2000}; 2002; ^{Sen et al., 2009}). Estos metabolitos secundarios o extractivos abarcan una serie de compuestos químicos como alcaloides, flavonoides, terpenos, terpenoides, estilbenos, lignanos, quinonas y otros compuestos fenólicos, los cuales, además de contribuir como mecanismo de defensa, son responsables de las propiedades organolépticas de la madera en cada especie (Sjöström, 1981; ^{Fengel y Wegener, 1984}; Hillis, 1987; ^{Tsoumis, 1991}; Tascioglu et al., 2013).

En la actualidad se ha intensificado la evaluación, extracción, elucidación y síntesis de compuestos extraídos del duramen de especies resistentes a hongos e insectos, los cuales podrían ser empleados como ingredientes activos en la formulación de eficientes y efectivos preservantes, para maderas de baja durabilidad natural, con un mínimo de efectos colaterales (^{Doppelreiter y Korioth, 1978}; ^{Dawson y Morrell, 1990}; ^{Goktas et al., 2007}; Sá et al., 2009; ^{Antwi y Damoah, 2010}; ^{González et al., 2015}). La investigación en el área ha sido relativamente extensa, un resumen de las mismas puede consultarse en los trabajos presentados por ^{Yang (2009)}, ^{Singh y Singh (2012)} y González et al. (2015). La presente investigación pretende evaluar la potencialidad como biopreservantes de la madera de Pinus caribaea var. hondurensis, de extractos etanolicos crudos del duramen de tres especies latífoliadas de elevada durabilidad natural en Venezuela, Handroanthus serratifolius, Centrolobium paraense y Tectona grandis. La mayor contribución de esta investigación será la apertura de nuevos caminos en la obtención de compuestos orgánicos con carácter preservante a partir de material natural, los cuales pueden ser empleado en la industria de la preservación de las maderas, disminuyendo así los riesgos o problemas toxicológicos generados en el manejo y uso de los preservantes tradicionales.

MATERIALES Y MÉTODOS

Bioensayo

Para evaluar la eficiencia del biopreservante, se siguió la metodología estandarizada por American Society for Testing and Materials (2005a), en la norma ASTM D-1413. Se emplearon dos microorganismos de prueba: hongo de pudrición blanca Trametes versicolor (L: Fr) Pilát (FP-133255-R) y hongo de pudrición marrón Gloeophyllum trabeum (Fr.) Murr. (Mad-617-R). Se prepararon cámaras de deterioro de 500 cm³ de capacidad con suelo y placas de alimentación previamente esterilizadas, las cuales fueron asépticamente inoculadas y colonizadas por los microorganismos de prueba. Los bloques de madera, tratados y no tratados, fueron secados en estufa a 80 ± 5 °C durante 24 h, posteriormente esterilizados a 120 °C durante 15 minutos, enfriados en desecador y colocados sobre el micelio activo de los hongos en las cámaras de deterioro. Se expusieron a la acción degradante durante 16 semanas almacenadas en un cuarto acondicionado a 26 ± 2 °C y 75 ± 5 % de humedad relativa. Después del periodo de incubación los bloques de madera fueron extraídos de las cámaras, cuidadosamente cepillado el micelio del hongo y secados en estufa a 80 ± 5 °C hasta obtener peso constante. La pérdida de peso de los bloques de madera se determinó gravimétricamente, al comparar la variación experimentada antes y después del bioensayo. El porcentaje de pérdida del peso seco de la madera fue usado como una medida de la resistencia al deterioro que presenta la madera al ser tratada con productos químicos y se determinó empleando la ecuación:

Pp= pérdida de peso (%), Pi= peso seco inicial antes del ensayo (g), Pf= peso seco al final del ensayo (g).

La pérdida de peso fue registrada y comparada con la clasificación presentada por la American Society for Testing and Materials (2005b), en la norma ASTM D-2017.

RESULTADOS

En la figura 1 se muestran los niveles de retención promedio de los extractos etanólicos crudos del duramen de H. serratifolius, C. paraense y T. grandis empleados como biopreservantes sobre la madera de P. caribaea. El nivel de retención del biopreservante se incrementó en la medida que aumentó la concentración de la solución preservante desde 0.2 % hasta 2 %, alcanzándose el mayor nivel de retención con el extracto de H. serratifolius, de 9.61kg.m^-3, y la menor retención con el extracto obtenido del duramen de C. paraense al 0.2 % de concentración.

Figura 1 Niveles de retención de los biopreservantes en la madera de albura de P. caribaea. 

La pérdida de peso en la madera de albura de P. caribaea tratada y no tratada, bajo la acción degradante de hongos de pudrición marrón y blanca, se resumen en la tabla 2. Los resultados señalan que la madera de P. caribaea sin tratamiento muestra baja durabilidad natural en condiciones de laboratorio asociada a G. trabeum y T. versicolor, con pérdidas de 65.5 % (± 1.11) y 55.3 % (± 0.78) del peso seco de la madera respectivamente. Los resultados evidencian la elevada actividad biológica de los microorganismos de prueba con las condiciones experimentales favorables.

Tabla 2 Pérdida de peso de la madera de P. caribaea frente a G. trabeum y T. versicolor, tratada con extractos etanólicos del duramen de H. serratifolius, C. paraense y T. grandis a tres niveles de concentración (0.2 %, 1 % y 2 % p/v) 

Se indica valor promedio y desviación estándar en paréntesis. Las letras se leen horizontalmente. Letras diferentes dentro de cada microorganismo y tratamiento indican diferencias estadísticas (p= 0.05) de acuerdo a la prueba de Tukey. n=12 muestras por concentración. 16 semanas de evaluación

Se indica valor promedio y desviación estándar en paréntesis. Las letras se leen horizontalmente. Letras diferentes dentro de cada microorganismo y tratamiento indican diferencias estadísticas (p <0.05) de acuerdo a la prueba de Tukey. n=12 muestras por concentración. 16 semanas de evaluación.

Los bloques de madera sin tratamiento expuestos a los microorganismos de prueba durante 16 semanas mostraron extensivos signos de deterioro (decoloración de la madera y colonización completa de la superficie de la probeta); en cambio, en los bloques tratados estos signos fueron menos evidentes. El análisis estadístico (Anova) y comparación de medias de Tukey demuestran diferencias altamente significativas en la pérdida de peso, entre las probetas de P. caribaea tratadas y no tratadas (F_1,232 =271.4, p<0.001) así como entre la variable concentración del biopreservante (F_3,232 =295.7, p<0.001) en cada tratamiento (tabla 2 y figura 2). Estos resultados evidencian que el tratamiento de la madera con los biopreservantes, incrementan significativamente la resistencia al deterioro asociada a T. versicolor y G. trabeum.

Figura 2 Pérdida de peso de bloques de P.caribaea tratados con el extracto etanólico de diferentes especies y expuestos a T. versicolor y G. trabeum. Barras con diferentes letras difieren significativamente (p < 0.05). Para cada concentración extracto/hongo n=12. 

Los tratamientos evaluados (biopreservantes) muestran mayor eficacia en la inhibición de la actividad degradante sobre hongos de pudrición blanca que sobre hongos de pudrición marrón. G. trabeum, resulto ser más agresivo que T. versicolor, ocasionando una pérdida de peso significativamente mayor (F_1,232 = 8.25, p=0.003), sobre la madera tratada y las no tratadas. Estos resultados evidencian la preferencia de los hongos de pudrición marrón sobre las especies coníferas. El comportamiento descrito se observó en todas las concentraciones evaluadas y dentro de cada tratamiento (tabla 2 y figura 2).

En la tabla 3 se muestran los resultados del Anova y comparación de medias de Tukey al 95 % de confianza, de la pérdida del peso de P. caribaea bajo los tres tratamientos al 2 % de concentración del biopreservante. La pérdida de peso experimentada por la madera de P. caribae varió entre 17 % y 26 % frente a G. trabeum y entre 13 % y 25 % frente a T. versicolor, dependiendo del tipo de biopreservante y el nivel de retención (8.70 kg.m^-3 y 9.31kg.m^-3). El análisis estadístico reveló diferencias altamente significativas entre los tratamientos evaluados (p<0.001), evidenciándose en la formación de cuatro grupos estadísticamente diferentes, frente a cada microorganismo de prueba (tabla 3).

Tabla 3 Análisis de varianza y comparación de medias de la pérdida de peso entre tratamientos 2 % de concentración sobre la madera de P. caribae, frente a G. trabeum y T. versicolor. 

Si bien todos los tratamientos mostraron diferentes niveles de protección sobre la madera de P. caribaea, el tratamiento con extracto de H. serratifolius con el mayor nivel de retención (9.61 kg.m^-3) mostró el mejor comportamiento frente a G. trabeum y T. versicolor, con una pérdida de peso promedio por debajo del 18 %. Las probetas tratadas con esta solución experimentaron una reducción de la pérdida de peso cuatro veces menor en comparación con las muestras no tratadas. El tratamiento con extracto C. paraense mostró una efectividad moderada en comparación con los otros dos tratamientos, evidenciando una pérdida del peso tres veces menor en comparación con las muestras control. La madera tratada con el extracto de T. grandis mostró el menor nivel de protección con pérdida de peso promedio del 26 %, superior a la observada con los extractos de H. serratifolius y C. paraense.

DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos en la investigación señalan que la madera de P. caribaea sin tratamiento evidenció los mayores niveles de deterioro y pérdida de peso frente G. trabeum y T. versicolor. Hallazgos similares sobre la baja durabilidad natural de la madera de P. caribaea han sido previamente reportados. Un ejemplo de ello son los trabajos de ^{Mora y Encinas (2001)}, ^{Ramírez et al. (2005)} y ^{Gómez et al. (2011)}, quienes señalaron perdidas de peso cercanos al 60 % frente a G. trabeum y T. versicolor.

La menor pérdida de peso causada por T. versicolor en comparación con G. trabeum sobre la madera de P. caribaea, puede estar relacionada con la habilidad propia del microorganismo, ya que los hongos de pudrición blanca son más eficientes en la degradación de la madera de especies latífoliadas en comparación con la madera de coníferas (^{Pant y Tripathi, 2011}; Broco et al., 2017), tal es el caso de la especie evaluada en esta investigación.

La madera de P. caribaea tratada con los diferentes extractos mostró un incremento significativo de su resistencia frente a hongos de deterioro; estos resultados son similares a los reportados en la literatura especializada, en los cuales se evidencia la actividad biológica de los extractos naturales sobre los microorganismos que deterioran la madera. ^{Onuorah (2000)} demostró la eficacia del extracto metanolico del duramen de especies latífoliadas como preservante de la madera sobre hongos de pudrición blanca y marrón. ^{Tumen et al. (2013)} determinaron la eficiencia del tratamiento de la madera (spruce/pine/fir) con el extracto etanolico del duramen de tres especies de Juniperus en el control de G. trabeum y T.versicolor. ^{Eller et al. (2018)} reportaron la actividad biológica sobre G. trabeum y T.versicolor del aceite de Juniperus virginiana impregnado en la madera de spruce, pine y fir. Por otro lado, Kwaśniewska-Sip et al. (2018) incrementaron la resistencia de la madera de Pinus sylvestris al tratarla con extracto de cafeína frente a T.versicolor.

Los biopreservantes evaluados mostraron excelentes resultados en pruebas de toxicidad in vitro (100 % inhibición de desarrollo), a una concentración de 0.2 %, utilizando agar-extracto de malta frente a G. trabeum y T. versicolor (^{Velásquez et al., 2006}). Sin embargo, cuando estos extractos a igual concentración se introdujeron en la microestructura de la madera de P. caribaea su actividad fue menor, posiblemente debido a la lixiviación o volatilización del producto, así como una consecuencia de la resultante interacción extracto/madera (^{Eaton y Hale, 1993}). De acuerdo con ^{Syofuna et al. (2012)}, el efecto protector de los extractos del duramen empleados como preservantes sobre la madera de P. caribaea puede atribuirse a factores relacionados con la complejidad y variedad de los compuestos químicos que integran estos extractivos y a la elevada permeabilidad de la madera de P. caribaea que permite alcanzar elevados niveles de retención y protección.

Un incremento en la concentración de la solución tratante se reflejó en una mejora de la resistencia al deterioro de P. caribaea, estos resultados son similares a los obtenidos sobre otras coníferas. Tascioglu et al. (2013) impregnaron la madera de Pinus sylvestris con extractos acuoso de corteza y duramen de Acacia mollissima y Schinopsis lorentzii respectivamente, a diferentes niveles de concentración (3 %, 6 %, 9 % y 12 %). Sus resultados evidenciaron la misma tendencia, es decir, un incremento significativo de la eficacia del biopreservante en la medida que se incrementó la concentración del mismo frente a T. versicolor y G. trabeum, obteniéndose los mejores resultados antifúngicos con las muestras tratadas al 9 % y 12 % de concentración, niveles de 4 y 6 veces superiores al máximo evaluado en esta investigación, lo que demuestra la eficacia de los extractos aquí evaluados.

Al comparar los resultados con otras investigaciones en la que se busca incrementar la durabilidad de la madera de P. caribaea, se encontró que ^{Mora y Encinas (2001)} evaluaron la durabilidad inducida de la madera de esta especie tratada con sales CCA al 5 % de concentración. Sus resultados señalaron pérdidas de peso inferior al 1 %, obviamente la eficacia de este producto es superior a los obtenidos en esta investigación. Sin embargo, es importante destacar la eficacia de estos extractos naturales en el control del deterioro biológico de la madera de P. caribaea, los cuales fueron empleados a menor concentración, crudos y sin purificación o fraccionamiento de sus ingredientes activos.

La elevada actividad biológica del biopreservante de H. serratifolius obtenida en esta investigación es similar a la señalada por ^{Rodrigues et al. (2012)}, quienes determinaron la eficacia del extracto metanolico del duramen H. serratifolius sobre albura de Pinus sylvestris frente a G. trabeum. El uso del extracto etanolico de T. grandis como preservante para madera ha sido reportado por ^{Adegeye et al. (2009)} y Broco et al. (2017); sobre la madera de Gmelina arborea, Triplochiton scleroxylo y Pinus sp. respectivamente, al igual que en esta investigación, sus resultados evidenciaron la eficacia del extracto en el control de hongos de pudrición blanca. Es importante resaltar que la eficacia obtenida en esas investigaciones se logró a una concentración superior (4 %) a la máxima evaluada en esta investigación.

Estudios previos han señalado que la actividad antifúngica y protectora de los extractos del duramen de H. serratifolius y T. grandis, frente a hongos que deterioran la madera, está asociada a la presencia de compuestos de tipo quinonas en su composición, como naftoquinonas, antraquinonas y tectoquinonas (^{Velásquez et al., 2004}; ^{Kokutse et al., 2006}; ^{Thulasidas y Bhat, 2007}; ^{Nagadesi y Arya, 2013}; Broco et al., 2016). Es necesario continuar con las investigaciones en el aislamiento, elucidación y citotoxicidad de los ingredientes activos presentes en el extracto de C. paraense para ser empleados en la industria de la preservación de la madera en la formulación de nuevos productos químicos ambientalmente amigables.

Considerando el sistema de clasificación de la ASTM (2005) basado en la pérdida de peso, la madera de P. caribaea sin tratamiento, es clasificada como una madera de baja durabilidad natural o no resistente al deterioro (tabla 1). Sin embargo, con la aplicación de los extractos crudos como biopreservantes, la madera de P. caribaea supera la clasificación de durabilidad, es decir, pasa a ser una madera moderadamente resistente con el tratamiento del extracto de T. grandis y una madera resistente al deterioro con el tratamiento de los extractos de H. serratifolius y C. paraense.

Tabla 1 Índices de durabilidad de la madera expresada como pérdida de peso y masa residual. 

Fuente: American Society for Testing and Materials (2005b).

CONCLUSIÓN

Los extractos de origen natural pueden ser una alternativa importante para la industria de la protección de la madera, proporcionando biomoléculas capaces de ofrecer resistencia a la descomposición contra hongos, así como baja toxicidad sobre los seres humanos y el ambiente. Los resultados claramente demostraron la eficacia del tratamiento con extractos etanolicos del duramen de especies de elevada durabilidad natural, evidenciado en un incremento significativo de la resistencia al deterioro de la madera de P. caribaea frente a G. trabeum y T. versicolor. Los extractos evaluados mostraron bioactividades importantes sin ningún fraccionamiento o purificación previa. Al comparar los extractos se observó que el obtenido de H. serratifolius resultó ser el más efectivo en reducir el deterioro de la madera de P. caribaea, seguido del extracto de C. paraense y, con efectos más sutiles pero eficiente, el extracto de T. grandis. Continúan las investigaciones sobre el aislamiento, elucidación y citotoxicidad de las biomoléculas responsables de la actividad biológica en estos extractos.