Consorcios microbianos mixtos, presentes en lodos de plantas de tratamiento de aguas residuales domésticas productores de PHA's

En la etapa upstream del proceso de biomanufactura se tienen en cuenta el cultivo del microorganismo (en este caso bacteriano) bien sea axénico o que actúen en consorcio, nativo o genéticamente modificado, así como las condiciones de fermentación y la estrategia de acumulación del polímero. Desde hace varios años se ha trabajo con cultivos de cepas puras altamente productivas (nativas o modificadas genéticamente) y sustratos esterilizados de alto costo para un proceso fermentativo de una sola etapa. Posteriormente, se abordó el estudio de microorganismos nativos agrupados los cuales les permite resistir condiciones adversas, aprovechar sustratos complejos y generar metabolitos que favorecen a la industria, sin embargo, algunos de ellos presentan bajas productividades volumétricas [¹⁰]. Hoy en día, los estudios de genómica y proteómica, como ejemplos permiten identificar microorganismos acumuladores de PHA's. En la literatura revisada se resalta la importancia de los consorcios microbianos nativos mixtos en contrarrestar los altos costos de producción por la utilización de una amplia gama de sustratos, incluidos los desechos industriales o agrícolas y que no requieren procesos de esterilización o desinfección [¹¹-¹³].

Ren et al. [¹⁴] evaluaron la versatilidad de los cultivos mixtos nativos en lodos activados y encontraron que los cultivos enriquecidos con acetato producen de forma eficiente polihidroxialcanoatos en condiciones aeróbicas.

En cuanto a la caracterización de estos consorcios microbianos mixtos se han identificado diferentes géneros, algunos de ellos son: Thauera sp, Alcaligenes sp, Paracoccus sp, Bacteroides sp, Pseudomonas sp. [¹¹,¹⁵,¹⁶,¹⁷,¹⁸]. Szacherska et al. hicieron énfasis en que los cultivos mixtos son comunidades de microorganismos que tienen la capacidad de cooperar entre sí llevando a cabo reacciones intracelulares y extracelulares específicas que permiten el aprovechamiento de sustratos mediante diferentes vías metabólicas [¹⁹]. En la Figura 4, Hao et al. [²⁰] describen la abundancia relativa de los géneros presentes en una comunidad microbiana de un hidrolizado de lodo tratado térmicamente.

Fuente: autoría propia.

Figura 3 Número de artículos publicados en el periodo 2013 - 2023.  

Figura 4 Abundancia relativa de géneros en la comunidad microbiana en un lodo activado original (a) y un cultivo microbiano mixto (b). Los géneros con abundancia relativa menor del 1% se clasifican en otros [²⁰]. 

En el análisis de la abundancia relativa de géneros se observa que Delftia acidovorans fue el microorganismo que más predominó en el cultivo enriquecido, dada la afinidad que tiene hacia el hidrolizado con valerato cómo sustrato dominante, formando el copolímero poli 3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV). Esta bacteria predominó sobre Lysinibacillus y Brevundimonas, productoras también de PHA [²⁰].

En cuanto a los microorganismos modificados genéticamente se han descrito diferentes géneros, entre ellos: Ralstonia eutropha, Alcaligenes latus, Burlkholderia sacchar, Aeromonas hydrophila y cepas recombinantes de Escherichia coli anclados en R. eutropha para alcanzar entre un 80-90 % de PHA en peso seco de la célula [¹²].

Estrategias de adaptación para el aumento de la biomasa microbiana y la acumulación de PHA's a partir de cultivos microbianos mixtos usando lodos del tratamiento de agua residual doméstica

Los lodos de depuradora bien sean primarios, secundarios, activados o anaerobios, pueden ser utilizados como sustrato para la obtención de ácidos grasos volátiles (AGVs) que favorezcan la selección de bacterias acumuladoras de PHA's o utilizarlo como suplemento a un medio sintético formulado. Las condiciones que han propuesto para favorecer la adaptación del consorcio microbiano y el aumento de la biomasa presente en lodos activados para la producción del biopolímero de interés pueden ser aeróbicas y anaeróbicas. Diferentes autores proponen tres etapas en diferentes secuencias para el proceso de producción del biopolímero, por ejemplo: anaeróbica para la fermentación acidogénica y aeróbica tanto para la etapa de enriquecimiento y para la producción de PHA's [¹¹,¹⁵,¹⁷,²¹,²³]. En cuanto a las fuentes nutricionales necesarias para favorecer el crecimiento del consorcio microbiano y la utilización de lodos como sustrato o materia prima, distintas investigaciones concuerdan con que los AGV's se utilizan mayoritariamente como fuente de carbono para llevar a cabo las estrategias de alimentación [²²,²⁴,²⁵], seguido de acetato [²¹,²⁶]. En la Tabla 4, se observa una publicación de Szacherska et al. con diferentes fuentes de carbono utilizadas para la producción de PHA's [¹⁹]. Además, del tipo de consorcio microorganismo mixto que produce el biopolímero de forma intracelular, su estructura está relacionada con la composición del sustrato y puede determinar un polímero o copolímero de cadena corta y media como se observa en la Tabla 4. Se resalta el uso de ácido acético solo o en proporciones con otros ácidos grasos volátiles.

En cuanto a la estrategia de alimentación, la fase de acumulación de PHA's al interior de las bacterias se favorece bajo la metodología de feast and famine. La primera etapa es el periodo de tiempo en el que se consume el sustrato con altas concentraciones de carbono. En la segunda etapa se observa una limitación en la cual el sustrato no está disponible y favorece la acumulación de los gránulos de reserva de polihidroxialcanoatos. Ambas condiciones fuerzan una adaptación fisiológica en los microorganismos los cuales son capaces de prosperar en condiciones de estrés [²²,²⁴]. En las Figuras 5 y 6, se observan ejemplos de estrategias de fermentación de feast and famine, que facilita la descripción de este proceso.

Fuente: Crisafi et al. [²⁴].

Figura 5 Esquema de producción de PHA con la estrategia de feast and famine utilizando lodo activado. 

Fuente: Pittmann & Steinmetz [²³].

Figura 6 Esquema de producción de PHA con la estrategia de feast and famine utilizando lodo primario. 

Estos procesos fermentativos se llevan a cabo en reactores generalmente de tipo discontinuo secuencial (SBR) donde se usa un primer reactor para la selección del cultivo microbiano mixto y el enriquecimiento de microorganismos acumuladores de PHA, y un segundo reactor para la acumulación de PHA dentro de la célula, el cual es alimentado de forma intermitente para favorecer la capacidad de almacenamiento de PHA a partir del lodo [²¹,²⁴].

En la Tabla 5 se presentan ejemplos del tipo de fermentación, estrategia de alimentación y porcentajes de producción de PHA, entre otros aspectos a partir de aguas y lodos residuales. En cuanto a los microorganismos evaluados han descrito tanto Gram positivos como Gram negativos. Además, se observa que la fermentación más utilizada es la acidogénica y la alimentación es de tipo aeróbica y dinámica siendo frecuente la estrategia de feast and famine. El tipo de lodo más evaluado es el lodo activado.

Los valores de PHA's obtenidos son variables y están relacionados con el tipo de lodo utilizado y diferentes condiciones de operación. Pittmann & Steinmetz [²³] alcanzaron una producción de PHA (28,40 % del peso seco) a una baja concentración de sustrato, 20 °C, pH neutro y ciclos de 24 horas y, por otro lado, Hao et al. [²⁰] obtuvieron un contenido de PHA del 42,31% observando que la producción se inhibe cuando los sustratos exceden un límite determinado. Pei et al. [³¹] produjeron 0,18 a 0,42 g PHA/g VSS utilizando lodos activados y resaltaron que la etapa de enriquecimiento fue un factor importante en el proceso. Morgan-Sagastume et al. [²⁶] lograron incrementar la capacidad de almacenamiento de PHA, bajo la estrategia feast and famine hasta un 34% utilizando acetato durante 20 horas y confirmaron que los AGVs obtenidos de la fermentación de lodos activados es una materia prima adecuada para la producción de PHA.

Factores y variables que afectan la acumulación de PHA's a partir de lodos de depuradora

La fuente nutricional proporcionada condiciona la síntesis y acumulación de este polímero teniendo en cuenta las condiciones de crecimiento del consorcio nativo, así como la condición de estrés que se logra con una limitación de fósforo, nitrógeno, oxígeno, un pH no óptimo y/o un exceso de la fuente de carbono [¹⁹,³⁴]. Pittmann & Steinmetz [²³] evaluaron una condición limitada de nutrientes de carbono, nitrógeno y fósforo (C:N:P) en un rango de 100:2:0.5 a 100:3:0.8 y encontraron que la cantidad de PHA producido está influenciada por las condiciones de operación de los reactores relacionadas con la temperatura y el pH. Otros autores refieren que cuando hay una relación baja entre el tiempo de reacción de la etapa de feast y el tiempo proporcionado en condiciones aeróbicas se favorece la selección del consorcio microbiano mixto con una mayor capacidad de almacenamiento de PHA's [²¹,³⁵,³⁶]. Barati et al. mencionaron que la duración de la fase de feast se mantuvo entre el 12 y el 15 % de la duración total del ciclo aeróbico. Los valores en este rango fueron inferiores al umbral encontrado previamente (20 %) y identificaron como valor límite, por debajo del cual aumenta la presión selectiva sobre la biomasa [³⁶].

En cuanto a la temperatura se encontró que algunos investigadores evaluaron dos temperaturas 15 y 30 °C, obteniendo resultados similares en comparación con un ensayo realizado sin control de temperatura variando de 15 °C hasta 25 y 28 °C [²¹]. Observaron que el contenido de PHA a 15 °C fue de 23 % y a 30 °C de 19 %, mientras que sin control de temperatura fue del 29 %. Sin embargo, a 30 °C se favoreció el crecimiento celular frente al almacenamiento de PHA y a 15 °C mejoró el proceso con respecto a los 30 °C. Concluyeron que los mejores resultados fueron alcanzados cuando la temperatura no se controló ya que diferentes temperaturas van a corresponder a diferentes productividades de PHA con una pequeña variación del contenido Anal entre el 3648 % g PHA/ g VSS.

La Demanda Química de Oxígeno (DQO) es un parámetro que está relacionado con la materia orgánica que pueden transformar los microorganismos y que es fácilmente biodegradable. Valentino et al. [²⁵] mencionan que una alta relación de AGVs, así como la relación AGV/DQO favorece mayores rendimientos que oscilan en los rangos de 1,5 - 1,7; 31 - 40 y 7,7 g DQO/L. Asimismo, la relación carbono/nitrógeno (C/N) favorece el crecimiento de los microorganismos responsables de la acidogénesis [¹⁵] ya que el consumo lento de acetato en relaciones de C/N altas puede causar la ausencia o baja acumulación de biopolímeros [¹⁷]. Un parámetro también analizado es el potencial de acumulación de PHA (PAP) el cual sugieren que sea al menos 40 % g PHA/g SSV para la recuperación económica del polímero. Werker et al. [³⁵] evaluaron 15 plantas de las cuales cuatro tenían un nivel de PAP de al menos 38 °% g PHA/g SSV e hicieron énfasis que en las plantas depuradoras se puede alcanzar hasta un 60 % de PAP. Estévez-Alonso et al. encontraron que una etapa de aclimatación de la biomasa combinado con una estrategia de alimentación de un pulso permitió alcanzar el promedio máximo del contenido de PHA y rendimientos de producto. Además, no encontraron efectos observables en la productividad del PHA con un control de pH y nitrificación activa [³⁷].

Ben desarrolló el proceso en 3 etapas: fermentación acidogénica, cultivo en condiciones aeróbicas y pulsos de altas concentraciones de AGVs para promover el almacenamiento intracelular de PHA's controlando el pH en el reactor acidogénico a un valor de 6,2 [²¹]. Sin embargo, en la literatura revisada diferentes rangos de pH pueden cambiar bien sea para el incremento de la biomasa (un valor de pH 5,5 disminuyen la actividad celular) o bien si el interés es la acumulación de PHA's (pH 7,5 - 8,5). Además, en el proceso fermentativo se encontró que el pH puede controlarse o dejarlo sin ajuste [¹⁹].

En cuanto a la estrategia de alimentación, varios autores coinciden en que la metodología feast and famine es una opción. Alzate et al. desarrollaron este proceso en dos etapas (selección de microorganismos y producción) [³⁸], mientras que Sruamsiri et al. lo realizaron en tres etapas (fermentación, selección de microorganismos y la producción del biopolímero) [¹⁸]. Por su parte, Zhang et al. mencionan que el desarrollo del proceso en dos etapas simplifica la producción de PHA y reduce costos. También resaltan que la estrategia de feast and famine en condiciones aeróbicas y anaeróbicas respectivamente (densificación y producción) se pueden lograr de forma simultánea para reducir el aporte de energía de aireación [³⁹].

Otra condición para evaluar es la tasa de carga orgánica (organic loading rate - ORL por sus siglas en inglés). Mineo et al. evaluaron tres ORL durante la selección de bacterias acumuladoras de PHA en lodos de depuradora en ensayos en batch (en lote o cerrados) durante 30 a 56 horas alcanzando un contenido de PHA de 60 %% en peso con la carga orgánica más alta (1,8 g COD L^-1 d^-1) [⁴⁰]. Por su parte, Cabrera et al. ratifican que feast/ famine (F/F) es una estrategia que favorece la selección de los microorganismos acumuladores de PHA y resaltan que los niveles de oxígeno disuelto pueden ser utilizados para el control del tiempo en los ciclos. Realizaron ensayos en batch alimentándolos con acetato como fuente de carbono y evaluaron dos ratios F/F de 0,2 y 0,6 y encontraron que con el último ratio se consiguió mayor productividad de biomasa y contenido de polihidroxibutirato (PHB), el tipo de compuesto esperado cuando se utiliza acetato como fuente de carbono [⁴¹].