¹Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira, AA. 237, Palmira, Valle del Cauca, Colombia. ²Departamento de Biología, Universidad de Puerto Rico - Río Piedras. P. O. Box 23360, San Juan, PR 00931-3360.Autor para correspondencia: jtoteroo@unal.edu.co

Se compara el crecimiento de plántulas de la orquídeas epifita Tolumnia variegata en medios de agar con y sin hongos micorrízicos. Los métodos de germinación simbiótica produjeron embriones de T. variegata más desarrollados que los métodos de germinación asimbiótica y las diferencias fueron estadísticamente significativas. Las semillas en los controles en medio de celulosa sin hongos micorrízicos no germinaron. Las semillas de Epidendrum ramosum, Lepanthes rupestris y Psychilis monensis no mostraron diferencias significativas en germinación entre métodos simbiótica y asimbiótica utilizando hongos aislados de raíces de T. variegata, incluso algunos aislados del grupo Rhizoctonia parasitaron las semillas. Los resultados sugieren que las semillas de orquídeas epifitas y sus hongos micorrízicos son más específicos de lo que anteriormente se había creído y por tanto es necesario utilizar los hongos específicos para cada especie de orquídea. Además, se sugiere que los cultivadores de orquídeas podrían obtener mejores resultados en la propagación de orquídeas epifitas si utilizan metodologías de germinación simbiótica apropiados.

Palabras clave: Tolumnia variegata, Epidendrum ramosum, Lepanthes rupestres, Psychilis monensis. Orchidaceae, germinación, hongos micorrízicos

We compared seedling growth of the epiphytic orchid, Tolumnia variegata in agar media with and without inoculated mycorrhizal fungi. Symbiotic germination produced more-developed embryos than asymbiotic germination. Differences were highly significant, although some isolates of Rhizoctonia-like fungi were parasitic on seeds. Control seeds in a cellulose medium without Rhizoctonia-like fungi did not germinate. Seeds of Epidendrum ramosum, Lepanthes rupestris and Psychilis monensis showed no significant differences between asymbiotic and symbiotic germination using mycorrhizal fungi isolated from T. variegata roots, suggesting high mycorrhizal specificity. Our data suggest that the relationship between epiphytic orchids and the mycorrhizal fungi is more specific than previously thought. The use of the right fungal strain may enhance germination performance. Orchid growers may achieve better results in the propagation of some epiphytic orchids using symbiotic germination.

Key words: Tolumnia variegata, Epidendrum ramosum, Lepanthes rupestris and Psychilis monensi, Orchidaceae, germination, mycorrhizal fungi

Desde los trabajos pioneros de Knudson (1921), los horticultores han germinado las semillas de orquídeas mediante la utilización de combinaciones de nutrientes en condiciones estériles (Arditti 1992). Sólo cuando estos métodos fallan, los orquicultores retoman las técnicas de germinación de semillas usando los simbiontes naturales (Bernard 1899).

Todas las orquídeas requieren una asociación micorrízica para la germinación de sus semillas, principalmente con hongos basidiomicetos del grupo de Rhizoctonia (Rasmussen, 1995). Rhizoctonia sensu latu es un grupo artificial que incluye hongos cuyas etapas sexuales pertenecen a los géneros Thanatephorus, Ceratobasidium, Sebacina y Tulasnella (Sneh et al. 1991). Esta dependencia se asocia con las mínimas cantidades de nutrientes almacenados en las diminutas semillas de las orquídeas (Arditti y Ghani 2000). Sin embargo, los hongos del grupo de Rhizoctonia son bien conocidos por sus capacidades patogénicas en muchos grupos diferentes de plantas.

La germinación artificial de semillas de orquídeas terrestres de zonas templadas es extremadamente difícil y requiere formulaciones de nutrientes muy específicas en medios asépticos de germinación (Arditti, 1992). Por tanto muchos cultivadores e investigadores utilizan hongos simbióticos para la propagación. Esto contrasta con el cultivo de muchas orquídeas epifitas tropicales, que en general son relativamente fáciles de germinar en condiciones asimbióticas. En consecuencia, los cultivadores de orquídeas tropicales no utilizan la germinación simbiótica para su propagación. Por estas razones se conocen mucho mejor las interacciones simbióticas de germinación de las orquídeas terrestres de zonas templadas que las de orquídeas epífitas tropicales. Sin embargo, las técnicas de germinación simbiótica de semillas epifitas tropicales podrían mejorar el éxito de cultivo de estas orquídeas tanto para fines comerciales como de conservación. El objetivo de este estudio fue comparar el éxito en programas de propagación de orquídeas epifitas tropicales utilizando técnicas simbióticas y asimbióticas de germinación.

Tolumnia variegata (Sw.) Braem (Orchidaceae; subfamilia Epidendroideae; tribu Maxillarieae) es una orquídea epifita tropical endémica de las Antillas Mayores, con excepción de Jamaica. Su nombre hace referencia a su alta variación en sus características florales (Foto 1) (Ackerman 1995). Las semillas para este estudio se recolectaron en una población en la zona adyacente a la reserva Natural Laguna de Tortuguero en Manatí (18° 27' 37" N, 66° 25' 30" O), Puerto Rico, entre 5 y 10 m.s.n.m. La precipitación promedio anual es de 1.688 mm y la temperatura de 25.4 °C. La zona es clasificada como bosque húmedo tropical en la escala de Holdrige (Ewel y Whitmore 1973).

Se realizaron cuarenta y ocho aislamientos de Rhizoctonia (Figura 1) a partir de plantas adultas y juveniles de diferentes poblaciones puertorriqueñas de T. variegata (Otero et al., 2002, 2004, 2005, 2007). Las raíces de plantas epifitas encontradas sobre arbustos de Randia aculeata L. (Rubiaceae) y Psidium guajaba L. (Myrtaceae) se lavaron con Tween 20 en agua corriente y se esterilizaron superficialmente mediante baños seriales en etanol (70%, 1 min), hipoclorito de sodio (2.5%, 2 min) y etanol (70%, 1min). Los segmentos de raíces fueron inoculados en condiciones asépticas en agar de papa y dextrosa (PDA) y agar de extracto de malta (MEA). Los hongos endófitos fueron identificados en el microscopio utilizando la guía de Sneh et al. (1991). Los hongos con características microscópicas de Rhizoctonia fueron transferidos a PDA y caracterizados hasta morfoespecies. Caracterizaciones moleculares están disponibles en la literatura (Otero et al. 2002, 2004, 2005, 2007).

Los frutos de T. variegata fueron recolectados del sitio de estudio y esterilizados superficialmente utilizando los mismos procedimientos que se usaron para las raíces. Las semillas fueron extraídas del fruto en condiciones estériles y su viabilidad fue evaluada con tinción de cloruro de trifenil tretrazolio (TTC, por sus siglas en inglés) (Otero et al., 2005).

Para examinar el efecto de los aislados de Rhizoctonia en la germinación de semillas, en placas Petri con Agar de Celulosa (CA) se sembró una mezcla de por lo menos 100 semillas de las tres plantas con mayor viabilidad, en cada una de las cuales se había inoculado un aislado diferente de Rhizoctonia tres días antes. Se evaluaron siete hongos y se incluyeron placas control inoculadas con semillas, pero sin el hongo. La germinación asimbiótica para cada especie de orquídea fue evaluada en cinco placas con medio comercial Knudson C (KC, Sigma Aldrich Inc.). Se realizaron dos tomas de datos, a las dos semanas y, dos meses después de la inoculación. Para ello se midieron diez plántulas escogidas al azar de cada placa Petri. Adicionalmente, cada semilla fue asignada a un estado de desarrollo de acuerdo con Stenberg y Kane (1998). En ausencia de germinación la semilla se registró en estado cero (0) (Figura 2B). El embrión < 1000 µm se registró en estado 1 (Figura 2C), con pelos absorbentes se registró en estado 2, con un primordio foliar se registró en estado 3 (Figura 2D), con una hoja en desarrollo y un primordio foliar se registró en estado 4, y con 2 hojas se registró en estado 5 (Figura 2E). Finalmente, las plántulas pequeñas se registraron en estado 6 (Figura 2F). Las semillas parasitadas, determinadas por el crecimiento de hifas a partir de las semillas (Figura 2A), registraron valor negativo (-1).

El efecto de los hongos aislados de T. variegata también fue evaluado en la germinación de Epidendrum ramosum Jacq. (subfamilia Epidendroideae), Lepanthes rupestris Stimson (subfamilia Pleurotallidiinae) y Psychilis monensis Sauleda (subfamilia Epidendroideae). Los datos fueron recolectados dos semanas después de la siembra de las semillas en la misma forma descrita anteriormente para los experimentos de germinación de semillas de T. variegata. Para el análisis de los resultados se utilizó la varianza de una vía ya que cumplían con los requisitos de normalidad exigidos para el análisis.

En total fueron aislados 55 hongos (clasificados en 26 morfoespecies) de raíces de T. variegata y 48 hongos (21 morfoespecies) con características de Rhizoctonia (87.3%), 31 de los cuales (en 13 morfoespecies) fueron evaluados como micorrizantes. Algunos aislados fueron micorrízicos, pero otros parasitaron las semillas. Trece (6 morfoespecies) mostraron un efecto positivo en la germinación de semillas.

Los embriones de T. variegata que germinaron en presencia de uno de los 13 aislados de Rhizoctonia aislados a partir de T. variegata fueron significativamente más grandes que aquellos que germinaron en el medio de Knudson (ANOVA de una vía, F_(1,9) = 63,00, P < 0.0001) dos semanas después de haber sido inoculados (Figura 3). También se encontraron diferencias significativas (ANOVA de una vía, F_(1,9) = 62,32, P < 0.0001) dos meses después de la inoculación (Figura 4).

La germinación de otras especies de orquídeas con hongos micorrízicos de T. variegata no mostró ventajas relativas en relación con la germinación simbiótica (ANOVA de una vía, E. ramosum F_(1,7) = 1,15, P = 0.32; L. rupestris F_1,7 P = 0.32; y P. monensis F_1,7 = 0,53 P = 0.50). Las semillas de L. rupestris y P. monensis iniciaron germinación con todos los hongos, mientras que en E. ramosum la germinación se indujo con todos, menos dos hongos (Figura 5).

Las semillas de T. variegata germinaron mejor en presencia de hongos aislados de T. variegata que en el medio de Knudson. Aunque los hongos micorrízicos no son utilizados frecuentemente para la germinación in vitro de semillas de orquídeas epifitas, la utilización de cepas apropiadas de micorrizas podría mejorar el cultivo de estas plantas a partir de semillas. No obstante, los hongos micorrízicos aislados de T. variegata no fueron tan benéficos para inducir la germinación de otras especies de orquídeas epifitas. Los datos en este estudio sugieren que las relaciones entre orquídeas epifitas y sus micorrizas son más específicas de lo que se había creído (Arditti et al. 1990). Dicha especificidad puede complicar la aplicación comercial de estos hongos en el cultivo de orquídeas, porque implica que cada especie necesita un grupo particular de ellos. Se precisa más investigación para identificar los simbiontes naturales asociados con las especies de importancia económica y con las especies amenazadas, con el fin de mejorar las condiciones de cultivo a partir de semillas. Esta meta se facilitaría mediante la creación y el análisis in vitro de un banco de cepas micorrízicas de orquídeas y la evaluación de los efectos en la germinación de diferentes especies de orquídeas. Estos resultados permitirán el aprovechamiento sostenible de un recurso importante en la floricultura, como lo son las orquídeas epifitas tropicales.

La germinación simbiótica de semillas de orquídeas también tiene otra ventaja sobre la germinación asimbiótica. Los medios de cultivo para germinación asimbiótica (como el medio de Knudson C que se utilizó en este ensayo) son ricas en azúcares y nutrientes, y las plántulas tardan meses para establecerse. Esta combinación pone las plántulas suceptibles a la contaminación fúngica. La inoculación de las semillas con un hongo micorrízico contribuye a evitar el crecimiento de otros hongos que las pueden contaminar (Porras and Bayman, 2007).

Las técnicas de germinación simbiótica utilizando hongos micorrízicos de orquídeas son una alternativa para la germinación de semillas de estas plantas epifitas tropicales. En comparación con la utilización de métodos asimbióticos, el uso de simbiontes naturales puede ser más eficiente si se cuenta con los hongos apropiados para la germinación. Desafortunadamente, aún se conoce muy poco sobre cuáles son los simbiontes más apropiados para las especies de orquídeas con importancia económica y por tanto es recomendable hacer estudios más profundos que permitan identificar los mejores hongos para estimular la germinación in vitro de dichas especies.

A L. Amaury Castro, Angélica Carrillo, Jessyka García, Laura Fidalgo, Paola Pabón, Andrea Porras y Sergio Rocafort por su ayuda en el laboratorio. Nicola S. Flanagan nos brindó un inmenso apoyo. Esta investigación fue apoyada por una beca de NSF-EPSCoR (NSF grant EPS-9874782) y de NASA-IRA otorgada a J. T. Otero.

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