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INTRODUCCIÓN
La leucosis bovina enzoótica (LBE) es una enfermedad que afecta a los bovinos, especialmente los dedicados a producción de leche y es causada por el virus de la leucosis bovina (VLB) el cual pertenece a la familia Retroviridae (Wu etal. 2003). Los animales aparentan estar clínicamente sanos durante los primeros años de edad, pero entre 3070% de los animales infectados pueden desarrollar Linfocitosis Persistente (LP) y entre el 0,1-10% de los bovinos con más de tres años de infección presentan algún tipo de Linfosarcoma (LS) (OIE 2004).
El inventario ganadero en Colombia tiene un total de 20'920.410 cabezas de ganado de las cuales el 60% son hembras, y de ellas, 2'546.231 corresponden a vacas para ordeño con una producción de 5,2 litros de leche vaca/día (DANE 2014). A su vez, solo el 6,4% de total de la ganadería colombiana es destinado para lechería especializada y el 35% hace parte de sistemas doble propósito (Fedegan 2011); además, un gran número de animales usados para la producción lechera provienen del cruce con animales criollos.
Estudios han demostrado que los animales infectados con el virus de leucosis bovina presentan disminución en la producción de leche que oscila entre el 2,5 al 5% respecto al hato (Cadavid 2012; Emanuelsson et al. 1992; Ott et al. 2003) y un aumento en la tasa de pérdidas selectivas, así como mayor susceptibilidad a otras enfermedades de etiología infecciosa como mastitis, diarrea y neumonía (Emanuelsson et al. 1992). Las pérdidas económicas anuales por el VLB pueden ser del orden de 806 dólares en un hato de 50 animales (Chi et al. 2002). A su vez, la seropositividad al VLB ha sido relacionada con pérdidas de 285 millones de dólares del excedente económico para los productores y de 240 millones de dólares del excedente económico para los consumidores (Ott et al. 2003). Por otra parte, para Colombia las pérdidas por la infección con el VLB son del orden de 24^098.700 COP anuales en un hato de 100 animales, además, la producción de leche por animal se reduce hasta en un 5% en comparación con el resto del hato (Cadavid 2012).
Por su parte, la producción de leche en climas medios y cálidos se dificulta por la escasa capacidad genética de las razas nativas y la poca adaptación de las razas especializadas a las condiciones medio ambientales de dicha zona. Sin embargo, el ganado criollo Blanco Orejinegro (BON) presenta vigor, resistencia y adaptabilidad (Buitrago y Gutiérrez 1999) y en cruce con la raza Holstein se pude mantener una buena adaptabilidad a condiciones medioambientales adversas, buena producción de leche y mejora de la sanidad de hato, factores de importancia para la economía pecuaria.
Se ha comprobado la resistencia in vivo del ganado BON a la larva de la Dermatobia hominis, lo que se puede deber a diferentes factores como: piel más gruesa que impide la entrada de las larvas, el pelo fino impide ser parasitado (Mateus 1967), e inmunidad congénita (López 1977). Se ha demostrado además que la raza BON es resistente in vitro a infecciones virales como virus de fiebre aftosa (FMDV) y estomatitis vesicular (VSV) (López et al. 2000). También hay estudios que reportan la resistencia del BON a infecciones bacterianas como brucelosis causada por Brucella abortus (Martínez et al. 2005), además, se ha establecido que la raza BON presenta alelos de resistencia a la infección por VLB (Hernández 2010).
Es importante llevar un control para leucosis mediante el uso de metodologías que provean resultados confiables sobre la presencia del virus en los animales y mecanismos que permitan ejercer control sobre la diseminación de la enfermedad. En la actualidad se presentan problemas para el diagnóstico de esta enfermedad por su sintomatologia inespecífica, además, hasta el momento no existe una vacuna por lo que la erradicación y control de esta enfermedad se basa en el diagnóstico temprano, la separación de los animales infectados y en la introducción de cruces dentro de los hatos lecheros para reducir el nivel de infección.
El objetivo del presente estudio fue determinar, mediante el uso de la técnica molecular PCR anidada, si el cruce entre las razas BON y Holstein es resistente a la infección por el virus de la leucosis bovina (VLB) en un hato lechero del departamento de Antioquia.
MATERIALES Y MÉTODOS
Animales y muestras
Se tomó una muestra de sangre de 59 vacas Holstein, 40 vacas BON y 25 vacas F1 del cruce BON x HOL, todas ubicadas en el mismo hato en el corregimiento de Santa Elena a 16 km del municipio de Medellín-Antioquia, con las siguientes características climáticas: altitud 2500 msnm, zona de vida bmh MB, temperatura 14°C, precipitación anual 2500 mm y humedad media de 75,5%. Las vacas Holstein y BON x HOL se encontraban en un sistema de manejo de lechería intensiva con 38 ha, mientras que las vacas BON pertenecían a un núcleo genético extensivo con 32 ha. Los tres componentes raciales tuvieron el mismo manejo sanitario. Para la toma de muestras se obtuvo la aprobación por parte del comité de ética de la Universidad Nacional de Colombia (CEMED-007, 14 de mayo de 2012).
La toma de muestras de sangre se hizo por medio de punción en la vena coccígea media, con una aguja calibre 18, con sistema al vacío vacutainer (DBvacutainers®) y EDTA como anticoagulante, se recolectaron 8 ml de sangre por animal. Posteriormente, las muestras se homogenizaron por inversión y se trasladaron al laboratorio en condiciones de refrigeración para realizar la extracción de DNA, la cual se llevo a cabo en el Laboratorio de Ciencias Básicas Animales de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín, mediante la técnica de salting out propuesta por Miller et al (1988) y se resuspendió en buffer TE 1X pH 8,0 (Tris HCl 1 M y EDTA 0,5 M). La calidad y cantidad del DNA obtenido se evaluó en un espectrofotómetro (NanoDrop2000®, Massachusetts-Estados Unidos) y en gel de agarosa al 1%, sin realizar dilución.
Prevalencia Molecular de VLB
La prevalencia molecular se determinó por PCR anidada en el Laboratorio de Biotecnología Animal de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín. A partir del DNA se amplificó una región del gen env viral para obtener un fragmento de 444 pares de bases en las vacas positivas, los cebadores utilizados fueron descritos por Beier et al. (2001). La primera reacción se realizó en un volumen final de 25 [ü con 150 ng de DNA, 3,0 [ü de 10 mM de cada primer env 5023 (5'-TCTGTGCCAAGTCTCC-CAGATA-3') y env 5608 (5'-AACAA-CAACCTCTGGGGAGGGT-3'), 0,4 mM de dNTPs en total, 1X de tampón PCR, 3 mM MgCl2 y 1U de Taq DNA Polimerasa (ThermoScientific®). En la segunda reacción de PCR se utilizó como DNA molde 5 [ü del producto de PCR de la primera amplificación, con las mismas concentraciones de los otros reactivos y los primers env 5099 (5'-CCCACAA-GGGCGGCGCCGGTTT-3') y env 5521 (5'-GCGAGGCCGGGTCCA-GAGCTGG-3'), en un volumen final de 30[l. Las reacciones para las dos PCR fueron idénticas y se realizaron en un termociclador T3 (Biometra®, Gõttingen-Alemania) con el siguiente protocolo: la desnaturalización inicial fue a 94°C durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos de: 94°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos y 72°C por 1 minuto, para terminar con una extensión final a 72°C por 5 minutos. Como control negativo se hicieron reacciones en ausencia de DNA y como control positivo se usó inicialmente el DNA de una vaca positiva para leucosis por la técnica de ELISA; después de esto se utilizó el DNA de una de las vacas que resultó positiva para la prueba. El producto de la segunda reacción se verificó en un gel de agarosa teñido con EZ-VISION (Amresco®) al 2% en un documentador de geles (Biorad®, California-Estados Unidos).
Análisis estadístico
Se utilizó una tabla de contingencia para establecer la prevalencia del virus de la leucosis bovina. Se realizó la prueba de Chi-cuadrado (X 2 ) para determinar la posible asociación entre la raza y la presencia o ausencia del virus. Además, se realizó comparación de porcentajes para establecer la diferencia entre la prevalencia de los grupos Holstein, BON y BON x Holstien. Para determinar la resistencia a la infección con VLB de la raza BON y el cruce BON x HOL respecto a la raza Holstein, se determinó el Odds ratio (OR) a través de una regresión logística; si el OR es mayor a 1 hay una asociación positiva y la raza o cruce tiene bajo riesgo de ser positivos al VLB, por el contrario, si el OR es menor a 1 hay una asociación negativa y la raza o cruce tiene alto riesgo de ser positivo a VLB. Por su parte, la significancia de los datos se aceptó como p < 0,05. Todo el análisis se realizó con el programa SAS® versión 9.2 para Windows (SAS Institute Inc, Cary NC, USA).
RESULTADOS
Se identificó el genoma del provirus de VLB en el las vacas a través de la técnica molecular PCR anidada, por medio de la cual se amplificó un fragmento de 444 pb correspondiente a una fracción del gen env que codifica para la proteína de envoltura gp51. A través de la PCR anidada se identificó un mayor número de animales positivos a VLB en la raza Holstein (33/59), para un total de 56,0% de prevalencia; por su parte, el número de animales positivos a VLB en el cruce BON x HOL fue menor (6/25), lo cual correspondió al 24% de prevalencia (Figura 1). Es de resaltar que la raza BON fue la que presentó la prevalencia más baja, solo el 5% de individuos estaban infectados por VLB.
FIGURA 1 Porcentaje de animales positivos y negativos para VLB diagnosticados por PCR anidada, para cada componente racial evaluado.
Del total de animales evaluados se encontró que la prevalencia de VLB en el hato era del 33,1% (Tabla 1), el 80,5% de los animales positivos está representado por las vacas Holstein y el 4,9% por la raza BON, mientras que su cruce tiene el 14,6% de infección.
TABLA 1 Frecuencia de animales positivos y negativos al VLB por PCR de acuerdo al grupo racial.
| Grupo | PCR (env+)/Total | PCR (env-) | Porcentaje de infección | Porcentaje del total |
|---|---|---|---|---|
| Holstein | 33/59 | 26 | 55,9%a | 80,5% |
| BON | 2/40 | 38 | 5,0%b | 4,9% |
| BON x HOL | 6/25 | 19 | 24,0%c | 14,6% |
| Total | 41/124 | 83 | 33,1% |
a,b,c Diferencia estadísticamente significativa del porcentaje de infección entre los tres grupos raciales (p < 0,05). PCR (env+) = vacas positivas al provirus del VLB. PCR (env-) = vacas negativas al provirus del VLB.
Al relacionar los grupos raciales con la infección se encontró una reducción en el porcentaje de prevalencia de VLB del 32% en las vacas BON x HOL respecto a la raza Holstein. La prueba de Chi-cuadrado (X 2 ) indica que la presencia o ausencia del virus está asociada con el grupo racial (X 2 c = 29,10 p < 0,001). A su vez, la prueba para comparación de proporciones mostró diferencia estadísticamente significativa entre las vacas Holstein y las BON x HOL (Xc = 7,19 p = 0,0073 p < 0,05); entre las Holstein y BON (Xc = 27,05 p < 0,001) y entre las BON x HOL y BON (Xc = 5,14 p = 0,023 p < 0,05). Al relacionar los dos sistemas de manejo en el hato se encontró que hubo diferencia estadísticamente significativa entre las vacas de lechería especializada (Holstein y BON x HOL) y las vacas BON en el sistema extensivo (Xc = 21,01 p = 0,000005 p < 0,05)
Se determinó el OR para la raza BON y el cruce BON x HOL respecto a la raza Holstein (Tabla 2). El OR para la raza BON respecto a la raza Holstein fue mayor a 1 (p < 0,05) por lo que se encontró una asociación significativa entre la ausencia de infección con el VLB y la raza BON, es decir que la raza BON es resistente frente a la infección con VLB. Por otra parte, se encontró que el OR para el cruce BON x HOL respecto a la raza Holstein fue mayor a 1 (p > 0,05), aunque el resultado no es estadísticamente significativo (p < 0,05) el cruce BON x HOL presenta un OR de resistencia a la infección con el VLB (OR=3,77).
DISCUSIÓN
En 1982 se registraron seroprevalencias para el VLB del 24,9% en la región andina (Griffiths et al. 1982). Para 1989 se encontró una seroprevalencia del 12,07% para el VLB en ganadería especializada en San Pedro de los Milagros, Antioquia (Aguilar et al. 1989). En el mismo año la seroprevalencia del VLB en el hato Paysandú fue de 14,65%, la cual se midió a través de la presencia de títulos de anticuerpos (Trujillo 1989). La leucosis bovina enzoótica se encuentra dentro de las 14 enfermedades sin control en nuestro país (Santos 2014), además, son pocos los estudios sobre la presencia del VLB en los hatos lecheros de nuestra región lo que ha contribuido a su diseminación en los sistemas de producción lechera. En el 2004 se hizo seguimiento de 985 vacas de 14 hatos de lechería especializada, se registró una prevalencia serológica del 44% de infección con variaciones dentro de fincas del 21% al 85% (Fedegan 2014). Durante el 2005 y 2009 se procesaron muestras de suero para determinar la seroprevalencia de VLB en algunos departamentos de Colombia; Antioquia obtuvo una seropositividad del 28% y Córdoba registró la mayor seroprevalencia de todos los departamentos evaluados (59%), en tanto el resultado total para Colombia fue del 25 % de positividad (Alarcón 2013). Posteriormente, la prevalencia molecular para el departamento de Antioquia en el año 2013 fue del 44% de infección, se encontró el provirus del VLB en 219 muestras de sangre de vacas Holstein pertenecientes a lechería especializada (Úsuga-Monroy et al. 2015); esta prevalencia molecular es menor a la encontrada en la presente investigación la cual fue del 56,0% para la raza Holstein.
Los resultados del presente estudio mostraron una prevalencia molecular para VLB del 33,1%, esto indica la importancia de la transmisión de las partículas virales ligado a malas prácticas sanitarias durante la producción como vacunación, descorne (Darlington et al. 1985), castración o palpación rectal (Divers et al. 1995), además, de la trasmisión vertical por calostro (Nagy et al. 2007) y por vectores como Tabanus sp. (Manet et al. 1989). Las vacas BON x HOL presentaron una prevalencia del 24% para VLB la cual es menor a la prevalencia encontrada en ganado doble propósito de Montería, Córdoba por medio de la prueba serológica ELISA, la cual fue de 29% (Betancur y Rodas 2008).
En un estudio realizado por Hernández et al. (2011) el ganado Blanco Orejinegro no presentó DNA proviral de VLB, sin embargo, aunque en este estudio si se encontró el provirus de VLB en la raza BON, el porcentaje de infección fue bajo (5%). Lo anterior podría explicar la reducción en el número de animales positivos en las vacas F1 (BON x HOL) con respecto al ganado Holstein, ya que la raza BON puede conferir genes de resistencia a la enfermedad.
El gen BoLA DRB 3.2 (Antígeno Leucocitario Bovino) se encarga de la presentación de antígenos a las células T para iniciar la respuesta inmune adquirida (Tizard 2008), sus alelos se han asociado con resistencia o susceptibilidad a varias enfermedades como mastitis (Yoshida et al. 2009), leucosis bovina (Hernández 2010; Juliarena et al. 2008; Miyasaka et al 2013; Sulimova et al. 1995) o infestación por garrapatas (Wu et al. 2003). En un estudio realizado por Hernández (2010) se encontró que el ganado BON presenta tres alelos asociados con resistencia a la infección por el virus de la leucosis bovina (BoLA DRB 3.2*21, BoLA DRB 3.2*24 y BoLA DRB 3.2*37), lo cual nos indica la presencia de factores genéticos innatos al animal que le ayudan a controlar la infección por el VLB.
El ganado BON posee características de rusticidad y ha tenido una mayor adaptación a las condiciones ambientales, plagas y enfermedades que circulan en nuestro medio (Buitrago y Gutiérrez 1999), esta puede ser la razón por la cual en este estudio se encontró DNA proviral en solo dos animales de esta raza. Las vacas Holstein y BON x HOL se encuentran en un sistema de manejo de lechería intensiva y comparten la mayor parte del manejo del hato, mientras que las vacas BON pertenecen a un núcleo genético extensivo; sin embargo, las prácticas de manejo como pesaje, vacunación o descorne se realizan en conjunto para todos los componentes raciales del hato, en las cuales si los protocolos de bioseguridad no son los adecuados (reutilización de agujas o guantes de palpación) la diseminación iatrogénica de la infección se puede dar con mayor facilidad (Darlington et al. 1985; Divers et al 1995).
Los estudios estadísticos mostraron una diferencia estadísticamente significativa (p = 0,0073 p < 0,05) entre los porcentajes de presencia del virus en BON x HOL (24%) y Holstein (56%) y entre el cruce BON x HOL (24%) y la raza BON (5%) (p = 0,023 p < 0,05), también se encontró diferencia altamente significativa entre la raza Holstein (56% de infección) y BON (5% de infección) (p < 0,001). Este resultado ratifica que el grupo racial está asociado a la presencia o ausencia del VLB, ya que se detectaron diferencias entre los animales Holstein, BON y el cruce BON x HOL (Xc = 29,10 p < 0,001). Estos resultados difieren de los obtenidos por Betancur y Rodas et al. (2008) quienes no encontraron diferencia estadísticamente significativa entre la raza y la prevalencia al VLB (X 2c = 5,59 p = 0,061 p > 0,05), pero sí entre el tipo de sistema de producción (carne o doble propósito) y los resultados positivos o negativos a la enfermedad (X 2c = 8,695 p = 0,03 p < 0,05).
Al relacionar los dos sistemas de manejo en el hato se encontró que hubo diferencia estadísticamente significativa entre las vacas de lechería especializada (Holstein y BON x HOL) y las vacas BON en el sistema extensivo (Xc = 21,01 p = 0,000005 p < 0,05). El sistema de producción de lechería especializada presenta mayores prevalencias para el VLB respecto al sistema doble propósito y la ganadería de carne, lo cual puede explicarse porque la producción de leche intensiva requiere una mayor intervención durante el ordeño lo que facilita la diseminación iatrogénica de partículas virales. Adicionalmente, se ha detectado el provirus en muestras de calostro el cual es muy importante en la alimentación de los becerros en la lechería especializada, lo que lo convierte en una importante fuente para la diseminación del virus (Gutiérrez et al., 2015).
En el presente estudio la raza BON (OR = 22,64 p < 0,05) presentó una asociación significativa frente a la ausencia del virus respecto a la raza Holstein. Aunque el OR para el cruce BON x HOL también fue mayor a 1, no se encontró una asociación estadísticamente significativa. Estos resultados indican la presencia de factores asociados a la raza que influyen en la resistencia al infección por e VLB.
CONCLUSIONES
Se detectó que el nivel de infección en el cruce BON x HOL es menor que en la raza Holstein, la cual se ha visto más afectada por el VLB, la prevalencia para esta raza fue del 56% mientras que para la raza BON fue del 5%. La raza BON presentó una asociación significativa frente a la ausencia de del virus respecto a la raza Holstein (OR = 22,64 p < 0,05), lo que sugiere que el ganado BON posee resistencia frente a la infección del VLB y la confiere al cruce BON x HOL. El uso de razas locales como el BON en hatos de lechería especializada puede mejorar la sanidad del hato, disminuir la susceptibilidad a esta infección, reducir el descarte de animales positivos y los costos por el uso de pruebas diagnósticas y medicamentos para tratamientos de infecciones secundarias.
