Anticuerpos anti-CCP en artritis reumatoidea: relación con características clínicas, citocinas Th1/Th2 y HLA-DRB1

Paula A. Correa ^1,2, Gabriel J. Tobón ^1,2, Gustavo Citera ³, José Cadena 1, Emilce Schneeberger ³, José F. Camargo ¹, José A. Maldonado-Cocco ³, Juan Manuel Anaya ^1,2

1 Unidad de Biología Celular e Inmunogenética, Corporación para Investigaciones Biológicas, Medellín, Colombia.

Palabras clave: artritis reumatoidea, anticuerpos antipéptidos citrulinados cíclicos, factor reumatoideo, HLA-DRB1, citocinas, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjögren, espondilitis anquilosante.

Key words: rheumatoid arthritis, anti-cyclic citrullinated peptide antibodies, rheumatoid factor, HLA-DRB1, cytokines, systemic lupus erythematosus, Sjögren's syndrome, ankylosing spondylitis.

La artritis reumatoidea (AR) es una enfermedad articular autoinmune, inflamatoria y crónica, que afecta principalmente a las mujeres. Frecuentemente compromete otros órganos distintos a las articulaciones y tiene un impacto adverso en la esfera biopsicosocial. Su causa es desconocida No obstante, se han identificado factores endocrinos, ambientales y genéticos involucrados en el desarrollo de la misma, los cuales son variables de una población a otra (1).

Se ha sugerido una variedad de autoantígenos como inductores de la respuesta autoinmune en la AR (2-5). Hasta hace poco, la determinación sérica del factor reumatoideo (FR), una inmunoglobulina dirigida contra la fracción constante (Fc) de las inmunoglobulinas de clase IgG, era la única prueba utilizada para el estudio de esta patología. De hecho, su presencia es considerada como criterio de clasificación de la enfermedad (6). Sin embargo, el FR no es altamente sensible ni específico (sensibilidad 66%; especificidad, 87%) (7), y puede encontrarse en otras enfermedades autoinmunes, enfermedades neoplásicas, infecciones crónicas e, incluso, en personas sanas.

Nienhuis y Mandema, en 1964, fueron los primeros en describir autoanticuerpos específicos en pacientes con AR, distintos al FR (8). El primero de este grupo de autoanticuerpos se denominó factor antiperinuclear (FAP), por dirigirse contra el factor perinuclear, un componente de los gránulos queratohialinos que rodean el núcleo de las células de la mucosa oral humana en diferenciación. Estos autoanticuerpos se reportaron como positivos muy temprano en el curso de la enfermedad, con una frecuencia de 49% a 91% y con una especificidad entre el 73% y el 99%, lo cual los convertía en posibles marcadores diagnósticos confiables (8). No obstante, dado que no todas las células de la mucosa oral humana expresan el sustrato antigénico y a que la prueba se realiza mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI), en la cual los resultados dependen en gran parte del observador, su determinación cayó en desuso.

En 1979, Young et al. describieron, mediante IFI, otro tipo de autoanticuerpos que parecían ser específicos en AR (9). Éstos reaccionaban contra proteínas presentes en el epitelio estratificado del esófago de rata y se denominaron anticuerpos antiqueratina (AKA). Se reportaron como positivos en el 40% de los pacientes, con una alta especificidad. Incluso, se podían encontrar positivos antes del inicio de los síntomas osteoarticulares (10). En un estudio previo, observamos la presencia de AKA en el 61% de los pacientes con AR establecida (11).

El antígeno reconocido por los AKA y el FAP es el mismo y corresponde a la (pro)filagrina (12-16), la cual se expresa en diferentes sustratos (15). Por lo tanto, estos anticuerpos se denominan actualmente anticuerpos anti-filagrina o antiprofilagrina (17). La filagrina ( filament aggregating protein) es una proteína producida durante las fases finales de diferenciación de las células epiteliales de los mamíferos. Es sintetizada como un precursor proteico (profilagrina) que contiene entre 10 y 12 moléculas de filagrina (18). Posteriormente, se demostró que cerca del 20% del aminoácido arginina de la filagrina se convertía a citrulina por la enzima peptidil arginina deaminasa (PAD) (18). Este cambio pequeño, relacionado con la masa molecular, genera importantes cambios en la carga eléctrica, lo cual produce diferencias en la interacción de la proteína con otras moléculas. Además, la citrulina es esencial para el reconocimiento antigénico por los anticuerpos antifilagrina (19). No obstante, la AR no afecta los tejidos que contienen normalmente la filagrina, como la piel o la mucosa oral, y no se encuentra en la membrana sinovial. Sin embargo, la membrana sinovial de pacientes con AR está infiltrada por células plasmáticas productoras de anticuerpos antifilagrina, lo cual sugiere la presencia en dicho tejido de un autoantígeno reconocido por estos anticuerpos (19). En este sentido, se observaron en la membrana sinovial de los pacientes con AR proteínas intracelulares citrulinadas, que no eran reconocidas por anticuerpos monoclonales contra la filagrina, y no se encontraron en los controles (20). Recientemente, un estudio demostró la citrulinación de proteínas sinoviales en los modelos murinos de AR, como un proceso activo, debido a la presencia de PAD4, y sugirió que la inducción de autoanticuerpos contra estos nuevos antígenos (proteínas citrulinadas) es específica de los humanos (21). En resumen, las proteínas citrulinadas de la membrana sinovial, no relacionadas con la filagrina, podrían disparar respuestas autoinmunes en la AR.

Schellekens et al. desarrollaron una prueba de inmunoanálisis ligada a enzimas (ELISA) para la detección de anticuerpos contra péptidos cíclicos citrulinados derivados de la filagrina (anti-CCP1) (22). El estudio con este método reveló una sensibilidad del 68% y una especificidad del 98% en pacientes con AR (22). Como la filagrina no se expresa en la membrana sinovial, se escogieron posteriormente otros péptidos no relacionados con ella para mejorar la técnica, la cual se conoce como CCP2 (23). Su uso en población caucásica ha mostrado una sensibilidad que oscila entre el 66% y el 82% y una especificidad que oscila entre el 90% y el 98% (23,24). Por lo tanto, su determinación ha mostrado ser de interés diagnóstico (23-26). No obstante, su valor pronóstico es controvertido.

El objetivo del presente estudio fue evaluar la sensibilidad, la especificidad y los niveles de los anticuerpos anti-CCP2 en pacientes con AR, y examinar su relación con la actividad de la enfermedad y con sus características inmunogenéticas y fenotípicas (FR, alelos HLA, citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias).

Se estudiaron 79 pacientes con AR (69 con enfermedad establecida y 10 con AR temprana, vistos en la primera consulta y que no habían recibido ningún tratamiento para su enfermedad). En todos los casos, las pacientes cumplieron los criterios de clasificación para AR (6). La actividad de la enfermedad en el momento del estudio se registró y evaluó de acuerdo con el número de articulaciones con sinovitis activa y los parámetros clínicos y biológicos sugeridos por el Colegio Americano de Reumatología, previamente descritos en detalle (27). De acuerdo con su actividad, la AR se clasificó como muy activa, moderadamente activa y en remisión (27).

Se incluyeron también 56 pacientes con espondilitis anquilosante (EA) definida (28), 25 pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES) (29), 50 pacientes con síndrome de Sjögren primario (SSp) (30) y diez individuos sanos. Todos los pacientes con AR, LES, SSp e individuos sanos fueron mujeres atendidas en la Clínica Universitaria Bolivariana, en Medellín, Colombia. El 91% de los pacientes con EA fueron hombres atendidos en el Instituto de Rehabilitación, en Buenos Aires, Argentina. Esta investigación se llevó a cabo de acuerdo con la Resolución No 008430 de 1993 del Ministerio de Salud de la República de Colombia y se consideró como de riesgo mínimo. El estudio contó con la aprobación del comité de ética de la Corporación para Investigaciones Biológicas.

Las muestras de sangre se tomaron en el momento de la evaluación clínica, en horas de la mañana y sin ayuno. De éstas se obtuvo el suero, el cual se almacenó a -20o C hasta su procesamiento. La detección de anticuerpos anti-CCP2 se realizó mediante ELISA, utilizando el estuche Quanta Lite (Inova Diagnostics Inc., San Diego, CA, USA). En este estuche, la placa se encuentra sensibilizada con un péptido citrulinado cíclico. El suero de los pacientes, diluido 1:101, se agregó a los pozos por separado, lo que permitió que los anti-CCP presentes en dicho suero se unieran al antígeno inmovilizado. Luego, cada pozo se lavó con solución tamponada de fosfatos (PBS), eliminando los residuos de muestra y las uniones inespecíficas antígeno-anticuerpos, y se procedió a agregar un conjugado de anti-IgG humana marcado con enzima. Una segunda incubación le permitió a este conjugado unirse a los anticuerpos que se habían adherido previamente al pozo. Luego de lavar el conjugado no fijado, la actividad enzimática se midió agregando un sustrato cromogénico y se determinó por el cambio en la intensidad del color que se produjo. Los sueros se examinaron por duplicado, y la lectura se hizo en el lector Bio-Rad modelo 550, California, EE.UU. Los resultados se expresaron en unidades internacionales (UI) y se clasificaron de acuerdo con los títulos de la prueba, definidos por la curva de calibración y por las instrucciones de la casa comercial, así: negativo, si era menor de 30 UI; levemente positivo, entre 30 y 39 UI; moderadamente positivo, entre 40 y 59 UI, y fuertemente positivos cuando eran mayores de 60 UI. El valor negativo (<30 UI) se reconsideró luego de obtener el promedio más dos veces la desviación estándar del resultado observado en los controles sanos.

Se calcularon la sensibilidad, la especificidad, las razones de probabilidades y los valores predictivos de los anti-CCP de acuerdo con las fórmulas previamente descritas (31).

El FR IgA e IgM se analizó mediante ELISA utilizando los estuches Quanta Lite (Inova Diagnostics Inc., San Diego, CA, USA), según las instrucciones de la casa comercial. Los resultados se hicieron en el lector Bio-Rad modelo 550. Los valores inferiores a 20 UI se consideraron negativos tanto para el FR IgA como IgM.

Los alelos HLA-DRB1 se determinaron en AND genómico usando la técnica de reacción en cadena de polimerasa, con iniciadores específicos (UCLA HLA-DR, UCLA Tissue Typing Laboratory, Los Angeles, CA, USA), tal como se describió anteriormente (11). Se evaluó la presencia del epítopo compartido, que corresponde a las secuencias de aminoácidos en las posiciones 70 a 74 de la cadena â del HLA-DRB1 (11).

Los resultados individuales se recolectaron y analizaron con el paquete SPSS versión 9.05 para Windows (Chicago, IL). Se utilizaron porcentajes y medidas de tendencia central para describir las variables, cuyos resultados se reportan en promedios y desviaciones estándar, o en mediana y rango intercuartil, dependiendo de su distribución, la cual se evaluó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov.

Las diferencias entre los promedios se examinaron mediante la prueba de Mann-Whitney a dos colas, y aquéllas entre porcentajes mediante las pruebas de ÷2 o Fisher a dos colas. Las diferencias entre los niveles de anticuerpos anti-CCP en las dos evaluaciones realizadas se examinaron mediante la prueba t pareada. Las correlaciones entre los niveles de citocinas, autoanticuerpos y la duración de la enfermedad se calcularon mediante la prueba de Spearman a dos colas. En todos los casos, el valor de p<0,05 se consideró significativo.

Se realizaron tres determinaciones de anticuerpos anti-CCP en pacientes con AR. En la primera evaluación se examinaron los anticuerpos anti-CCP en 69 pacientes con AR establecida, de las cuales en 66 (96%) fueron positivos, así: 4 (5,8%) positivos bajos (rango: 31-36 UI), 4 (5,8%) moderados (rango: 43-55 UI) y 58 (84,1%) positivos altos (rango: 68-222 UI). En 3 (4,3%) pacientes fueron negativos (7, 9 y 15 UI, respectivamente).

Se evaluaron también 10 pacientes con AR temprana (atendidos por primera vez luego de la presentación de los síntomas), en quienes la seropositividad para anti-CCP fue de 80%, en todos los casos con valores positivos altos (rango: 77-168). Los niveles negativos de las dos pacientes en este grupo fueron 15 y 24 UI, respectivamente.

De los 56 pacientes con EA, sólo uno presentó anticuerpos anti-CCP (53 UI) ( p<0,001 comparado con el grupo de AR). En 25 pacientes con LES, los anti-CCP fueron positivos en tres (12%) ( p<0,001 comparado con el grupo de AR). Dos presentaron niveles positivos altos (66 y 111 UI, respectivamente), y una niveles positivos bajos (39 UI). De las 50 pacientes con SSp, 6 presentaron anticuerpos anti-CCP (12%) ( p<0,001 comparado con el grupo de AR). Cinco de éstas tuvieron niveles altos y una, nivel bajo. En el grupo de control sano, sólo un caso (10%) fue positivo (37 UI) ( p<0,001 comparado con el grupo de AR).

Al evaluar en conjunto las 79 pacientes con AR, la sensibilidad de los anti-CCP fue del 94% y la especificidad diagnóstica del 92%. La razón de probabilidades positiva fue de 12 y la razón de probabilidades negativa fue de 0,06. El valor predictivo positivo fue de 87% y el valor predictivo negativo de 96,3%. Cuando se consideraron sólo los individuos con títulos altos (66 de 79 pacientes con AR, 2 de 25 pacientes con LES, 5 de 50 pacientes con SSp y ningún control sano ni con EA), la sensibilidad fue de 84% y la especificidad de 95%.

El análisis de las manifestaciones clínicas de la AR en función de los niveles de anticuerpos anti-CCP no mostró asociación significativa en ninguna de las evaluaciones. De la misma manera, no se observaron diferencias significativas entre la presencia o los valores de estos anticuerpos y la actividad de la enfermedad.

La genotipificación del HLA-DRB1 se realizó en las 69 pacientes con AR establecida. No se observaron asociaciones significativas entre alelos del HLA-DRB1 o el epítopo compartido y la presencia de anticuerpos anti-CCP. De las 66 pacientes anti-CCP positivo, 32 (48%) fueron HLADRB1* 04, 23 (35%) presentaron el epítopo compartido ⁷⁰QRRAA⁷⁴ y 3 (4,5%) el epítopo ⁷⁰QKRAA⁷⁴.

En este estudio se encontró una alta sensibilidad (94%) y especificidad (92%) de los anticuerpos anti-CCP en pacientes con AR. Estos anticuerpos se mantuvieron estables durante la evolución de la enfermedad y no se asociaron con la actividad de la misma, manifestaciones extraarticulares, niveles de citocinas, HLA-DRB1 ni epítopo compartido. La razón de probabilidades positiva indica que un resultado de anticuerpos anti-CCP superior a 30 UI es 12 veces más probable que corresponda a un paciente con AR que sin esta enfermedad. De manera similar, la probabilidad de que un individuo con resultado negativo no padezca AR es del 96,3% (valor predictivo negativo). Es importante anotar que cuando se consideraron sólo los niveles altos (>60 UI), la sensibilidad fue de 84% y la especificidad de 95%.

El daño articular en la AR puede presentarse de manera temprana, incluso antes de que se detecten cambios erosivos o disminución del espacio articular mediante los métodos radiológicos convencionales (32). Se ha propuesto que el progreso radiológico en la AR no sigue un curso lineal y que, por el contrario, puede comportarse como una cinética de primer orden, en la que dicho daño podría ocurrir en los primeros años de la enfermedad (33). Sin embargo, no hemos observado una correlación significativa entre la duración de la enfermedad y el progreso radiológico (Anaya et al., datos sin publicar).

A pesar de esto, los cambios radiológicos se incluyen en los actuales criterios de clasificación de la AR (6), lo cual indica que su diagnóstico puede ser tardío si se tiene en cuenta este criterio. Por otro lado, el único criterio serológico es el FR, una prueba con moderada especificidad (87%) y sensibilidad (80%). Por lo tanto, es necesaria la modificación de los actuales criterios de clasificación de la AR para poder considerar como tales a pacientes con enfermedad temprana, y así iniciar un tratamiento precoz que permita prevenir el progreso de la misma.

La sensibilidad encontrada en este estudio para los anti-CCP fue del 94%, cifra superior a la observada en algunos estudios previos (24-26). Este resultado se podría explicar por las diferencias en el tamaño de la muestra, el origen de las poblaciones estudiadas, por tratarse, en su mayoría, de pacientes con AR establecida y por los niveles que se consideraron como positivos. Cuando se consideraron sólo aquellos individuos con niveles positivos altos, la sensibilidad de la prueba fue de 84%. Dubucquoi et al. compararon la positividad de anticuerpos anti-CCP en pacientes con AR en función de la linealidad del péptido citrulinado (34). El uso de péptidos citrulinados cíclicos mostró mejor sensibilidad y especificidad que los AKA y que el péptido citrulinado lineal (34). Igualmente, este estudio mostró una menor sensibilidad de los anticuerpos anti-CCP al inicio de la enfermedad que en pacientes con AR establecida (34).

La presencia y los niveles de anticuerpos anti-CCP fueron independientes del HLA-DRB1 y del epítopo compartido. Los principales estudios que han investigado la relación entre HLA y los anticuerpos anti-CCP, incluso el nuestro, muestran una ausencia de asociación entre el HLA-DRB1 y los anti-CCP. En la población colombiana, el epítopo compartido ⁷⁰QRRAA⁷⁴ en los alelos DRB1*04 confiere un riesgo 23 veces mayor de desarrollar AR (45). El HLA-DRB1*0401, portador del epítopo ⁷⁰QKRAA⁷⁴, y considerado el alelo de mayor riesgo de gravedad de la enfermedad, es escaso en poblaciones de Suramérica (46-48), particularmente en Antioquia, Colombia, de donde provinieron los pacientes con AR (45). Esto podría explicar, en parte, la ausencia de asociación no sólo entre el HLA y los anticuerpos anti-CCP, sino también entre éstos y las características clínicas de la AR.

La susceptibilidad genética a desarrollar anticuerpos anti-CCP podría estar asociada con el polimorfismo de los genes de las enzimas responsables de la citrulinación, en particular, con el gen PADI 4, situado en el cromosoma 1 (1p36), y cuyo producto 'citrulina' los residuos de arginina. Este hallazgo, inicialmente descrito en población japonesa (49), no se replicó en población caucásica inglesa (50), lo cual confirma la necesidad de realizar estudios de inmunogenética en cada población, antes de extrapolar resultados obtenidos en poblaciones distintas a la nuestra (1).

Se han descrito cinco tipos de PAD, las cuales son reguladas por estrógenos y activadas durante la apoptosis (51,52). Nissinen et al. demostraron la presencia de anticuerpos anti-PAD en el 88% de pacientes con AR en fases iniciales, pero sólo en el 22% en AR de larga duración (53). A diferencia de los anti-CCP, los anticuerpos anti-PAD se encontraron en una alta proporción de pacientes con otras enfermedades reumatológicas autoinmunes, como LES y SSp (44% y 84%, respectivamente), pero no en otras enfermedades autoinmunes como la esclerosis múltiple. Por lo tanto, los anticuerpos anti-PAD podrían ser marcadores de autoinmunidad en general.

En el presente estudio observamos anticuerpos anti-CCP en un solo paciente (2%) con EA definida. Este resultado, original y no publicado previamente, indica que la respuesta autoinmune articular en pacientes con EA, en cuanto a la citrulinación de péptidos se refiere, es distinta en AR que en EA. También se estudiaron 3 pacientes con artropatía psoriásica y uno con EA asociada con una enterocolopatía. En todos estos casos los resultados de anti-CCP fueron negativos (no se muestran los resultados).

Se observó una prevalencia de anticuerpos anti-CCP en el 12% de los pacientes con LES y SSp, no significativamente diferente al 10% observado en la población sana. Estudios previos señalaron una prevalencia de hasta el 20% en pacientes con LES (54) y del 4% en pacientes con SSp (34). Además del origen racial que pudiera explicar la diferencia entre los resultados, los criterios de selección de los pacientes deben ser también considerados en la interpretación de los mismos. Los pacientes incluidos en el presente estudio cumplieron criterios estrictos de clasificación que incluyeron la ausencia de erosiones óseas en los pacientes con LES y SSp, y una biopsia de glándula salivar positiva en aquéllos con SSp. Los resultados indican que los anticuerpos anti-CCP son de ayuda diagnóstica diferencial entre AR y otras enfermedades reumatológicas tales como LES, SSp y EA.

Los autores agradecen la participación de los pacientes en el presente estudio, a los dos revisores anónimos por sus comentarios útiles y a S. Ahuja por su apoyo. Este estudio fue financiado en parte por Colciencias (22130412672).

Igualmente, declaran no tener ningún conflicto de interés con las compañías mencionadas en este trabajo.

Correspondencia:

Juan Manuel Anaya, Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB),

Cra. 72 A N° 78 B-141, Medellín, Colombia.

Teléfono: (4) 441 0855 y 441 8846; fax:(4) 441 5514

Recibido: 27/10/03; aceptado: 27/05/04

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