Ladys Sarmiento¹, Martha Ayala ², Sandra Peña ¹, Gerzaín Rodríguez ^3,4, Zelandia Fermín ⁵, Felix J Tapia ⁶

1Unidad de Microscopía y Análisis de Imágenes, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia

Recibido: 08/06/05; aceptado: 12/12/05

Introducción. Las células dendríticas están presentes en la mayoría de los tejidos, ellas capturan y presentan antígenos para activar a los linfocitos T.

Objetivo. Se describe ultraestructuralmente la fagocitosis de Leishmania mexicana por la línea de células dendríticas FSDC, una línea de células de Langerhans obtenida de la epidermis fetal de ratón, e inmortalizada por la transducción retroviral del oncogen v-myc.

Materiales y métodos. Se obtuvieron amastigotes de la lesión de ratones Balb/c y promastigotes a partir del cultivo ( 24°C) de la lesión. Las FSDC se cultivaron con los parásitos en una proporción de 5 parásitos por célula, en medio IMDM, durante 24 horas. Los cultivos infectados y los controles se procesaron para microscopía electrónica de transmisión. Se hicieron cortes semifinos contrastados con azul de toluidina para evaluar porcentaje de fagocitosis y finos, contrastados con acetato de uranilo y citrato de plomo.

Resultados. El 13,42% de las FSDC fagocitaron promastigotes; de ellas el 8% contenían un parásito y el restante 5,2% fagocitó dos o más. El 20% de las FSDC fagocitaron amastigotes; 10% contenían un parásito y 10% dos o más. Ultraestructuralmente se observaron promastigotes en contacto con las células por el flagelo o por el polo posterior. Los fagosomas que contenían promastigotes eran organelos estrechos con uno ó dos parásitos. Los que contenían amastigotes eran de gran tamaño (8 µm) con uno o varios parásitos, libres o adosados a la membrana del fagosoma por su polo posterior.

Conclusión. La infección de las FSDC se caracterizó por una baja tasa de células infectadas al ser expuestas a promastigotes o amastigotes. La vacuola parasitofora presentó características similares a las de los macrófagos. En su mayoría las FSDC presentaban 1 a 3 parásitos por célula. Las observaciones plantean la necesidad de estudiar la relación entre capacidad de fagocitosis y función.

Palabras clave: células de Langerhans, Leishmania, fagocitosis, microscopía electrónica.

Phagocytosis of promastigotes and amastigotes of Leishmania mexicana by the FSDC dendritic cell line: Ultrastructural study

Introduction. Dendritic cells, which capture and present antigen to activate unprimed T cell, are found in most tissues.

Objective. This work describes the ultrastructure of Leishmania mexicana phagocytosis by the fetal skin dendritic cell (FSDC) line, a Langerhans cell line isolated from mouse fetal epidermis immortalized by retroviral transduction of the v-myc oncogene.

Materials and methods. Leishmania amastigotes were obtained from mouse (BALB/c) lesion and promastigotes from culture ( 24°C) of the lesion. FSDC cells were cultured with parasites (5 parasites per cell) using IMDM medium, during 24 hours. Control and infected cultures were processed for transmission electron microscopy. Semi-thin sections counterstained with toluidine blue to evaluate phagocytosis and thin sections counterstained with uranyl acetate and lead citrate were made.

Results. 13.42% of the FSDC phagocytosed promastigotes; 8% contained a single parasite and 5.2% phagocytosed 2 or more. 20% of the FSDC phagocytosed amastigotes; 10% contained a single parasite and 10% phagocytosed 2 or more. Ultrastructurally, promastigotes in contact with FSDC by the flagellum or the posterior pole were observed. The parasitophorous vacuoles harbouring promastigotes were small organelles containing one or two parasites each. Parasitophorous vacuoles containing amastigotes were larger (8µm diameter) with one or several parasites free or attached to the vacuole at the posterior pole.

Conclusion. The low rate of infected FSDC cells was characteristic and the parasitophorous vacuole showed similar characteristics to those observed in macrophages. The parasite density in the infected cells was 1 to 3 parasites per cell. These observations highlight the need to study the relationship between phagocytic capacity and function.

Key words: Langerhans cells, Leishmania, phagocytosis, electron microscopy.

Las células dendríticas son elementos clave del sistema inmune, centinelas en la periferia que alertan a los linfocitos T de antígenos invasores y dirigen el montaje de una respuesta eficiente (1). En la epidermis y otros epitelios estratificados, la célula de Langerhans es la representante por excelencia del sistema de células dendríticas (2). La leishmaniasis cutánea es producida por la inoculación intradérmica del parásito por el vector, lo que hace pensar que las células de Langerhans tienen una participación crítica no sólo durante el proceso inflamatorio sino en el inicio de una respuesta específica (3). La interacción de las células de Langerhans con parásitos de Leishmania sp. se demostró en 1990 cuando Moll et al., empleando estas células recién aisladas de la epidermis de ratones Balb/c, encontraron que 20% de ellas fagocitaban amastigotes de Leishmania major en 24 horas; sin embargo, no se produjo interacción con promastigotes, la forma inoculada por el vector en la piel (4).

Más tarde, Udey et al., empleando células expandidas de piel fetal de ratones C57BL6 (FSDDC), obtuvieron 36% de fagocitosis de amastigotes mientras que solamente el 7% fagocitaron promastigotes (5). Estos resultados con células dendríticas derivadas de la piel, contrastan con los más altos porcentajes de fagocitosis que se logran cuando se emplean células dendríticas de otro origen, como las diferenciadas de médula ósea, en las que se han encontrado porcentajes de fagocitosis de amastigotes y promastigotes de 40% y 54%, respectivamente, y de 76% y 80% (6,7).

Al emplear células dendríticas generadas a partir de monocitos de sangre periférica, se han obtenido porcentajes de fagocitosis de amastigotes y promastigotes de 58% y 38%, respectivamente, y en el caso de células dendríticas derivadas de bazo se encontró un porcentaje de fagocitosis de promastigotes del 33% (8,9). Las células dendríticas son una población celular muy heterogénea, por lo que las diferencias reportadas en la fagocitosis de las diferentes formas del parásito pueden ser producto de múltiples factores, entre ellos, su origen.

El objetivo de este trabajo fue estudiar la capacidad de la línea de células dendríticas FSDC para fagocitar parásitos de Leishmania mexicana y determinar las características ultraestructurales de la interacción con cada una de las formas del parásito. Esta determinación ultraestructural no se había realizado previamente en el modelo estudiado, en el que la microscopía electrónica se ha empleado sólo como evidencia para documentar la infección.

Parásitos

Se empleó la cepa de L. mexicana 000/00/WR-L11 CL802, donada al banco de criopreservación del Laboratorio de Parasitología del Instituto Nacional de Salud (INS) por Robert Tesh de Yale University. La identidad de la cepa se confirmó por isoenzimas y anticuerpos monoclonales.

Los amastigotes se extrajeron de la lesión desarrollada en la almohadilla plantar de ratones BALB/c inoculados 9 semanas antes con 1x106 promastigotes en 50 µl de solución salina estéril. El tejido obtenido se maceró en un filtro metálico con el émbolo de una jeringa plástica, adicionando lentamente 10 ml de medio de Schneider. Con el fin de liberar los amastigotes de los macrófagos, la mezcla se pasó a través de agujas calibre 21 y 26, se centrifugó a 246g por 5 minutos y el sobrenadante se colocó en hielo por 1 hora para retirar los residuos adheridos a los amastigotes. Luego de centrifugar a 1.120g por 5 minutos, el sedimento de amastigotes se resuspendió en medio de Schneider y se pasó por aguja número 29 para facilitar el recuento de los parásitos individuales (10). Antes de ponerlos en contacto con las células, los parásitos se lavaron en solución salina al 0,85% y se transfirieron a medio Iscove Modified Dubelcco Medium (IMDM).

Los promastigotes obtenidos del cultivo de tejido de la lesión de los ratones infectados, se mantuvieron en medio Schneider a 24°C hasta incrementar la población y 10 días después del último pasaje se lavaron en solución salina al 0,85% y se transfirieron a medio IMDM para ser puestos inmediatamente en contacto con las células, de la misma manera en que se procedió con los amastigotes.

Células

La línea FSDCfue amablemente suministrada por Paola Ricciardi-Castagnoli del Departamento de Biotecnología y Biociencias de la Universidad de Milán-Bicocca en Italia. La línea fue derivada de células dendríticas de piel fetal de ratón; si bien la suspensión de células se obtuvo de la epidermis, el crecimiento de algunos fibroblastos en los primeros pasajes no excluye contaminación dérmica. La línea fue inmortalizada por la transducción retroviral del oncogen v-myc (11); tiene características de célula de Langerhans como son la expresión de ATPasa de membrana (11), la hidrólisis de ADP pero no de ATP (12), además de un fenotipo de célula dendrítica mieloide inmadura (13). El cultivo se realizó en medio IMDM con 5% de suero fetal bovino inactivado, 2mM de L-glutamina, 100 UI/ml de penicilina,100 µg/ml de estreptomicina y 0,05mM de mercaptoetanol, a 37ºC y 5% de CO₂.

Cultivos de FSDC con los parásitos

Las FSDC con una viabilidad mayor al 98% se colocaron en medio IMDM fresco (con 5% de suero fetal bovino inactivado, 2mM de L-glutamina, 100 UI/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina y 0,05mM de mercaptoetanol) y se incubaron durante 30 minutos, tiempo requerido para su adherencia, a 37°C y 5% de CO₂. Luego, las monocapas de FSDC se pusieron en contacto con promastigotes o amastigotes, en una proporción de 5 parásitos por célula. Los cultivos se incubaron durante 24 horas a 37°C, con 5% de CO₂. Como control se emplearon FSDC cultivadas en medio IMDM en las mismas condiciones, pero sin la adición de parásitos.

Microscopía electrónica

Veinticuatro horas después de poner en contacto las células con los parásitos, los cultivos se fijaron en glutaraldehído al 3% en solución tampón de fosfato 0,01M, pH 7,2, durante 1 hora, a temperatura ambiente. Luego se posfijaron en tetraóxido de osmio al 1% durante 1 hora, a la misma temperatura. Se deshidrataron en etanol de grados ascendentes, se infiltraron e incluyeron en resina epón-araldita. Se hicieron cortes semifinos de 1 µm de espesor y cortes finos de 60 nm que se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo (14). Las muestras se observaron en un microscopio electrónico de transmisión Zeiss EM 109.

Recuentos

Por medio de la observación con microscopía de luz de los cortes de 1 µm teñidos con azul de toluidina, se efectuó el recuento para calcular el porcentaje total de células con parásitos fagocitados y el porcentaje de células que habían fagocitado 2 o más parásitos.

Se contaron 200 células en cada uno de los tres experimentos independientes realizados por duplicado.

Las células dendríticas son una población muy heterogénea. Su susceptibilidad a infectarse con Leishmania sp. parece depender no sólo del tipo y procedencia de la célula dendrítica sino también de la especie y estadio de Leishmania sp. empleada (15). Cuando se emplean células dendríticas derivadas de la epidermis como las células de Langerhans, se obtienen menores porcentajes de fagocitosis que cuando se emplea cualquier otro tipo de célula dendrítica. La línea celular FSDC mostró un comportamiento similar al reportado con las FSDDC en cuanto al porcentaje de células capaces de fagocitar el parásito (36% de amastigotes y 7% de promastigotes) (5), bajo, si se compara con los reportados para tipos diferentes de células dendríticas. También presentan similitud con los obtenidos por Moll et al. en cuanto a amastigotes se refiere (4).

La aparente menor captación de parásitos por parte de una célula que se ha venido considerando la iniciadora de la respuesta inmunitaria al transportar el antígeno hasta el ganglio linfático, si bien es un hecho que no necesariamente tiene implicaciones biológicas, sí llama la atención sobre el verdadero papel que esta célula podría estar jugando en el inicio de la respuesta a la enfermedad.

Trabajos recientes demuestran que aunque se pudieron detectar parásitos en el ganglio unas pocas horas después de la infección, éstos estaban en macrófagos. Ninguna célula dendrítica emigrante de la piel tenía parásitos, lo cual indica que no eran las transportadoras. Los parásitos se detectaron en células dendríticas en el ganglio sólo tres semanas después de la infección (16).

Otra evidencia muestra que las células dendríticas que transportaban antígeno de Leishmania tres días después de la infección eran de origen dérmico y no epidérmico, concluyendo que las células dendríticas dérmicas y no las células de Langerhans eran las principales presentadoras de antígeno en leishmaniasis (17).

Lemos et al. demostraron que no se requiere de las células de Langerhans para la presentación de antígenos ya que otras células dendríticas pueden desempeñar eficientemente el mismo papel (18). Prina et al. proponen que las células dendríticas en presencia de un bajo número de promastigotes no opsonizados podrían infectarse o no hacerlo por su baja actividad fagocítica, por la competencia con macrófagos residentes o, por el contrario, se infectarían permaneciendo inmaduras o en un estadio intermedio que no permitiría la estimulación de los linfocitos T. Por lo tanto, se retardaría el inicio de la respuesta lo que permitiría la amplificación del parásito para, luego, ya en presencia de opsoninas como los anticuerpos, fagocitar los amastigotes, madurar y amplificar la respuesta (6).

Los trabajos que varios grupos están adelantando específicamente en células de Langerhans, permitirán en un futuro aclarar su verdadero papel en el inicio de la respuesta a la leishmaniasis.

Los estudios por videomicroscopía han mostrado que los promastigotes de Leishmaniamajor y Leishmania aethiopica se unen a la célula hospedera de manera predominante por el flagelo y, ocasionalmente, por el polo posterior, mientras que Leishmania donovani lo hace por los dos sitios en igual proporción (19); también se ha documentado que Leishmania amazonensis se une al macrófago por los dos polos (20). Nosotros observamos la unión de L. mexicana por los dos polos pero no medimos la frecuencia con la que esto ocurría.

Una vez fagocitado, el promastigote se encuentra en una vacuola parasitófora característicamente muy estrecha, ajustada al parásito a manera de guante, que deja un espacio muy reducido entre el parásito y la membrana de la vacuola.

En los macrófagos, las vacuolas parasitóforas que contienen L. mexicana son grandes (20,21). Se ha identificado un proteofosfoglicano secretado a través del saco flagelar de amastigotes de L. mexicana que causa vacuolización de los macrófagos in vitro (22,23). Aparentemente, los amastigotes de L. major no secretan esta molécula y el parásito no induce la formación de grandes vacuolas parasitóforas en macrófagos (23). También se ha encontrado que el agrandamiento de la vacuola parasitófora es menos acentuado en células dendríticas que en macrófagos, lo cual indica que la biogénesis de la vacuola parasitófora es diferente en estas dos células o que su formación es retrasada en células dendríticas (6).

Los amastigotes de L. mexicana se encontraron adheridos a la membrana de la vacuola parasitófora en las FSDC por su polo posterior pero también se encuentran libres dentro de ella, de la misma manera como se ha reportado para las vacuolas parasitóforas formadas en macrófagos (24).

Si bien la aparición de gran cantidad de vacuolas en las células que no fagocitaron puede tener causas diversas, una posibilidad es que se deba a un estímulo por parte de las células infectadas, como se ha propuesto (6). Sin embargo, esto tendría que demostrarse por métodos de inmunomicroscopía electrónica para este caso.

La estructura de la vacuola parasitófora y su composición bioquímica ya han sido estudiadas en macrófagos y, más recientemente, en células dendríticas generadas de médula ósea. Se deben hacer estudios encaminados a la caracterización de la vacuola parasitófora formada específica-mente en células de Langerhans, en búsqueda de las diferencias que puedan existir con las vacuolas parasitóforas generadas en otros tipos de células dendríticas.

La alta resolución que se logra con la microscopía electrónica (100-200Å), permite aprovechar esta herramienta para el estudio detallado del suceso.

No fue posible inferir sobre la significancia estadística de los resultados entre los dos grupos de células de trabajo, debido a la alta dispersión que presentaron los datos, situación que se refleja en los altos porcentajes de los coeficientes de variación estimados. Sin embargo, se pudo observar que como célula dendrítica, ésta fagocita de manera preferencial un solo parásito. La variación observada podría estar relacionada con el tamaño reducido de las áreas de estudio para microscopía electrónica, de máximo 0,5 mm, y la forma como se distribuye la muestra; aunque la mezcla de células dendríticas y parásitos se hace homogénea, se observan diferencias entre los fragmentos de muestra escogidos.

En conclusión, en cuanto a la estructura fina, se describieron las características de la interacción célula de Langerhans-Leishmania que se relacio-naron con cada una de las formas del parásito fagocitado, especialmente en lo que tiene que ver con las diferencias morfológicas de la vacuola parasitófora. Algunas de estas características son similares a las descritas en macrófagos pero no habían sido estudiadas en detalle en células de Langerhans infectadas con Leishmania.Hasta ahora los pocos trabajos que muestran ultraestruc-turalmente la interacción célula de Langerhans-Leishmania, han empleado la microscopía electrónica sólo para documentar la infección.

Agradecimientos

A María Carlina Castillo por su asesoría en el análisis estadístico.

Conflicto de intereses

Los autores manifiestan que no existe ningún conflicto de intereses.

Financiación

Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología - Colciencias (proyecto 2104-04-10240), Banco Interamericano de Desarrollo, Instituto Nacional de Salud y FONACIT, Proyecto S1-2001000847.

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