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El lupus eritematoso sistémico es una enfermedad crónica de carácter autoinmunitario caracterizada por la producción de autoanticuerpos 1,2. Quienes lo padecen pueden presentar una amplia variabilidad clínica o de ‘endotipos’ debido al compromiso de múltiples sistemas del organismo. En diversos estudios se ha demostrado que el compromiso orgánico y la gravedad de la enfermedad varían según el grupo étnico, el sexo y la edad de aparición 3,4. Se desconocen las causas de la enfermedad, pero se ha demostrado su vínculo con factores hormonales, genéticos y ambientales 5-7.
Por otra parte, entre 10 y 25 % de los pacientes adultos con lupus eritematoso sistémico pueden desarrollar insuficiencia renal, mientras que cerca de 75 % de los niños que lo padecen desarrollan algún grado de compromiso renal y, en algún momento de su evolución, aparece la nefritis lúpica 8. Las formas proliferativas de esta condición, es decir, los tipos III, IV y V, son las más comunes y, a la vez, las más graves, pues pueden evolucionar hacia una nefropatía terminal 9.
En reportes previos, se ha demostrado el papel de algunas variantes genéticas presentes en los genes PTPN2210,11, VDR12,13, TNF14,15, y HLA16,17, entre otros 18, como factores de riesgo o de protección en los diferentes endotipos de lupus eritematoso sistémico, incluida la nefritis lúpica. La mayoría de estos estudios emplean un diseño de asociación genética de casos y controles para la detección de factores genéticos asociados a una enfermedad en particular 19,20. El grado de asociación detectado con este método depende de que el alelo identificado confiera propensión a la enfermedad, aunque también puede ocurrir que el alelo se encuentre en desequilibrio de ligamiento con un alelo del verdadero gen de propensión 21. Este enfoque metodológico puede arrojar resultados erróneos debido a variables de confusión, como la estratificación poblacional, especialmente cuando se estudian individuos con características multiétnicas como en el caso de las poblaciones latinoamericanas 22. Los estudios basados en familias ofrecen una alternativa exenta del efecto de confusión debido a dicha estratificación poblacional 23.
En el diseño de tríos de casos y padres, se seleccionan las familias a partir del caso índice y se obtiene información de ambos padres, quienes presentan una estratificación poblacional similar a la de su descendencia 24,25. En este tipo de estudios, se puede emplear el test de desequilibrio de transmisión, con el cual se evalúa la transmisión de alelos de los padres heterocigotos a los hijos enfermos 26. En pocos estudios se ha empleado este tipo de diseño en el estudio de marcadores genéticos asociados con la nefritis lúpica en niños, especialmente en Colombia.
El objetivo del presente estudio consistió en analizar la asociación de variantes genéticas de los genes PTPN22, VDR y TNF-α con la nefritis lúpica en niños y su carácter de hereditarias en tríos de familias colombianas con un caso índice de dicha enfermedad.
Materiales y métodos
Población de estudio
Se hizo un estudio de asociación genética con 46 tríos en un contexto familiar. Solo se incluyeron familias en las que ni el padre ni la madre referían antecedentes personales de enfermedades auto-inmunitarias. El diagnóstico de lupus eritematoso sistémico se determinó por la presencia de, al menos, cuatro de los 11 criterios propuestos por el American College of Rheumatology, presentes en secuencia o simultáneamente durante el tiempo de observación del individuo 27. La edad de inicio de los síntomas de la falla renal se tuvo en cuenta para establecer la presencia de nefritis lúpica en los niños.
Extracción de ADN genómico
Un equipo compuesto por flebotomistas, investigadores y médicos, se encargó de recolectar 10 ml de sangre venosa periférica por participante en tubos Vacutainer con EDTA dipotásico (Becton Dickinson & Company, Franklin Lakes, USA, Ref: 367856), para la obtención de suero y posterior extracción de ADN genómico. Las muestras se tomaron en ayunas, antes de las 7 a.m.
El ADN se extrajo a partir de la fracción leucoplaquetaria (buffy coat) de la muestra de sangre anticoagulada, usando el protocolo de salting out modificado y sometiéndola a precipitación con perclorato de sodio 28. La concentración y la calidad del ADN se midieron mediante el espectrofotómetro Nanodrop 2000/2000c (ThermoScientific™, Waltham, MA, USA). Las muestras de ADN genómico y de suero se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -70 °C hasta su posterior análisis.
Genotipificación de los polimorfismos de nucleótido simple
Se hizo la genotipificación de los polimorfismos de nucleótido simple (SNP) rs2476601 de PTPN22, rs1800629 y rs361525 del TNF-α, y TaqI [rs731236 A/G], ApaI [rs7975232 A/C], FokI [rs2228570 A/G] y BsmI [rs1544410 C/T] del VDR mediante PCR cuantitativa (qPCR) utilizando los estuches comerciales TaqMan® SNP Genotyping (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) y ABI Prism 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), en un volumen total por reacción de 5 µl (2,4 µl de ADN en una concentración aproximada de 10 ng/µl, 2,5 µl de Master Mix-2x y 0,125 µl de sondas Taqman Genotyping-40x específicas de cada SNP). Todas las reacciones de PCR se hicieron por duplicado. El programa de ciclos consistió en uno inicial de 10 minutos a 95 °C, seguido por 40 de 15 segundos a 92 °C y un minuto a 60 °C. La asignación genotípica se hizo automáticamente mediante la aplicación Allelic Discrimination del sistema Applied Biosystems, con una calidad de amplificación mayor o igual a 90 % por muestra. Todas las muestras se analizaron por duplicado para evitar errores de genotipificación; además, se verificó que no se presentaran inconsistencias mendelianas.
Análisis estadístico
El análisis estadístico consistió en determinar las frecuencias alélicas y genotípicas mediante el programa estadístico SPSS®, versión 20 (IBM SPSS Statistics 20®; IBM Corp., USA). A estas frecuencias se les estimó la desviación del equilibrio de Hardy-Weinberg (H-W), empleando el programa Arlequín, versión 3.5.
La segregación de los SNP de PTPN22, VDR y TNF se hizo mediante pruebas estadísticas del desequilibrio de ligamiento, como son el D´ y el r2, y la transmisión de estas variantes de los padres a los hijos mediante el test de desequilibrio de transmisión. Para estos análisis, se empleó el programa Haploview 4.1. La significación estadística se estableció como un valor de p<0,05.
Consideraciones éticas
Todos los participantes mayores de edad aprobaron, mediante consentimiento informado escrito, su participación voluntaria en el estudio, así como la de sus hijos, autorizando la obtención de muestras biológicas (sangre venosa periférica, ADN genómico y material genético). El Comité de Ética de la División de Ciencias de la Salud de la Universidad del Norte aprobó la realización del estudio.
Resultados
Los casos índice presentaron un promedio de edad de 16,19 ± 3,48 años. La aparición del lupus eritematoso sistémico se dio, en promedio, a los 4,47 ± 3,5 años. Por otra parte, en 35,8 % de estos casos se registraron antecedentes de enfermedad autoinmunitaria en varios miembros de las familias. Se encontró que la distribución de la enfermedad dependía del sexo, con una frecuencia mayor en niñas: 73,9 % (n=34) (cuadro 1).
Distribución de las variantes genéticas de PTPN22, TNF y VDR en las familias de estudio
En cuanto a la distribución alélica de estas variantes, se observó que el alelo A del polimorfismo rs2476601 del PTPN22 se distribuyó en 8,69 % (n=16) de los padres y aumentó a 19,5 % (n=18) en los casos. Este efecto también se vio reflejado en la frecuencia del genotipo homocigoto AA y del heterocigoto AG, distribuido en 8,6 % y 21,7 % de los casos índice, respectivamente. Se encontró que el polimorfismo exhibía equilibrio genético de Hardy-Weinberg en los padres (p=0,689), mas no así en la descendencia (p=0,035). En cuanto a las variantes de TNF-α y VDR, estas mostraron distribuciones similares entre padres e hijos. Las variantes del TNF-α no se encontraron en equilibrio de Hardy-Weinberg en los casos índice (cuadro 2).
Desequilibrio de ligamiento y transmisión genética de PTPN22, TNF y VDR
Dado que presentaron más de una variante en la genotipificación, se estimó el desequilibrio de ligamiento de los SNP de TNF-α y VDR, lo cual permitió detectar un bloque de 1 kb de distancia genómica entre los SNP rs731236, rs7975232 y rs1544410 mediante el método de solid spine, el cual abarca la región comprendida entre las posiciones 46.525.024 y 46.526.102 del cromosoma 12 del gen VDR. Estos tres polimorfismos demostraron un desequilibrio significativo, con un D´ de 0,807 y un r2 de 0,538 (figura 1). En cuanto al TNF, se observó la segregación de los dos polimorfismos en un bloque de 3 kb (figura 2).
Figura 1 Mapa pair-wise del desequilibrio de ligamiento de los SNP delVDR evaluados en los tríos. Se detectó un bloque mediante el método solid spine que recogió la información genética de los SNP TaqI, ApaI y BsmI. A) Se muestra un desequilibrio de ligamiento más marcado entre los polimorfismos rs731236, rs7975232 y rs1544410, con un D´ de 0,852 y una puntuación LOD de 16,32. B) En el bloque 1 se observa un r2 de 0,485. C) Se observa la frecuencia haplotípica del bloque 1.
Figura 2 Mapa pair-wise del desequilibrio de ligamiento de los SNP de TNF evaluados en los tríos. Se detectó un bloque mediante el método solid spine que recogió la información genética de los dos SNP de TNF caracterizados por genotipificación. A) Se muestra un evidente desequilibrio de ligamiento entre los polimorfismos rs1800629 y rs361525 con un D´ de 1,0 y una puntuación LOD de 0,5. B) Se observa un r2 de 0,007. C) Se describe la frecuencia haplotípica del bloque.
Asimismo, se evaluó la posibilidad de heredar los polimorfismos determinados por genotipificación mediante el test de desequilibrio de transmisión y se demostró que el alelo A de rs2476601 en el PTPN22 se había transmitido de los padres a la descendencia con nefritis lúpica, con una razón de 17 a 6 veces más que el alelo G (p=0,028). La transmisión de padres a hijos de los demás polimorfismos no fue significativa (cuadro 3).
Discusión
Este es uno de los pocos estudios en Colombia con un diseño basado en las familias para evaluar la asociación y la posibilidad de heredar variantes genéticas en los loci PTPN22, TNF y VDR con propensión al endotipo de nefritis lúpica del lupus eritematoso sistémico en niños. Este tipo de diseño es ideal en el estudio de enfermedades que aparecen a temprana edad 29. Como se pudo observar en este estudio, la edad promedio de inicio de la enfermedad fue a los cuatro años, aproximadamente, lo cual aumenta la probabilidad de que se produzca daño renal 8.
Se han hecho algunos estudios en población colombiana sobre la asociación entre el lupus eritematoso sistémico y los polimorfismos de PTPN22 (10,11), VDR12,13 y TNF14,15. Sin embargo, hasta la fecha solo en el estudio de Ramírez, et al.11, se había reportado la asociación del polimorfismo rs2476601, también conocido como C1858T, del gen PTPN22. En dicho estudio, los autores encontraron una asociación significativa entre dicho SNP y la propensión a esta enfermedad y a la artritis reumatoide. Cabe aclarar que, en ese estudio, se empleó un diseño de casos y controles con individuos de diferentes zonas de Colombia. En el presente estudio, se corroboró la asociación observada para este polimorfismo y la nefritis lúpica en niños de familias colombianas; además, se describió la forma en que el alelo de riesgo es heredado de padres a hijos. En las publicaciones sobre marcadores de propensión y nefritis lúpica en niños, no se han presentado resultados que asocien este polimorfismo con un efecto funcional, como tampoco se ha encontrado su asociación con algún subgrupo de la enfermedad.
En este estudio, no se evidenció ninguna asociación entre las variables genéticas estudiadas de los loci deTNF y VDR con el endotipo de la nefritis lúpica en niños; además, estas mostraron un comportamiento de segregación similar entre los alelos. En Colombia, no se han reportado datos sobre marcadores de propensión relacionados con estas variantes y esta enfermedad. Como ya se mencionó, la variabilidad observada en los resultados de los diversos estudios a nivel mundial, muy probablemente, se deba a la estratificación poblacional de cada muestra de estudio. Sin embargo, en el presente estudio, las variantes TaqI, ApaI y BsmI del VDR exhibieron un desequilibrio de ligamiento, lo cual sugiere que, a pesar de no estar relacionados directamente con la enfermedad, sí son cercanos a otros marcadores asociados con la nefritis lúpica en niños.
Entre las limitaciones de este estudio cabe señalar un tamaño de muestra relativamente pequeño, debido a la frecuencia del endotipo estudiado y la disponibilidad de las muestras biológicas del trío completo, lo cual, aunado a la posible estratificación deficiente de la población estudiada, explicaría el desequilibrio genético de Hardy-Weinberg en los SNP de VDR y TNF observados en padres e hijos. Por lo tanto, los resultados aquí presentados son aplicables exclusivamente a esta muestra de familias colombianas.
Puede concluirse, entonces, que en el caso particular de la nefritis lúpica en los niños de las familias estudiadas, el alelo A del polimorfismo rs2476601 del gen PTPN22, heredado de sus padres, presentó una asociación directa con la enfermedad. Estos resultados sirven de base para el planteamiento de futuros estudios epidemiológicos de asociación con un mayor número de familias y de grupos multiétnicos similares a la población colombiana.
