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La leptospirosis es una enfermedad zoonótica de distribución mundial, ocasionada por bacterias espiroquetas patógenas pertenecientes al orden Spirochaetales, familia Leptospiraceae, género Leptospira. Se dividen en 22 especies clasificadas en tres grupos: patógenas, intermedias y saprófitas o de vida libre, de las cuales las patógenas e intermedias tienen mayor importancia debido a su capacidad de ocasionar desde una amplia gama de signos o síntomas clínicos similares a los de un resfriado común, hasta un daño funcional multiorgánico y la muerte 1,2.
La enfermedad es más frecuente en regiones con climas tropicales o subtropicales, al igual que en zonas que presentan inundaciones o precarias condiciones higiénicas y sanitarias 3. La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha clasificado la leptospirosis como una de las enfermedades reemergentes y desatendidas 4.
Diversos animales domésticos y silvestres, así como accidentalmente el humano, están involucrados en el ciclo de infección de la leptospirosis; sin embargo, los reservorios de mayor relevancia son los pequeños mamíferos silvestres o sinantrópicos pertenecientes al orden Rodentia 1. Estos animales constituyen la fuente de infección más importante para los humanos y otros huéspedes vertebrados sensibles, los cuales se infectan principalmente por el contacto directo o indirecto con orina de roedores que contenga leptospiras viables 2.
En México la leptospirosis se cataloga como un problema de salud pública y veterinaria, reportándose distintas tasas de incidencia y prevalencia en todo el territorio nacional. La leptospirosis humana se ha reportado en 27 de los 32 estados que conforman el país, en los cuales los brotes se presentan de manera ocasional 4.
En estudios previos en Yucatán, se ha reportado que los roedores capturados en el peridomicilio son reservorios de leptospiras patógenas 5,6. Asimismo, en otros animales silvestres, como las zarigüeyas 7, y en los domésticos, como cerdos, vacas y perros, la infección también se ha documentado 8,9. Sin embargo, no se han hecho estudios en roedores silvestres de las áreas rurales de Yucatán, por lo que el objetivo de esta investigación fue determinar la circulación de Leptospira spp. en el tejido renal de roedores sinantrópicos y silvestres capturados en un ambiente urbano y en otro selvático de Yucatán empleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el análisis de alineamiento.
Materiales y métodos
Sitio de estudio
El estudio se llevó a cabo en la comunidad rural de Cenotillo (paralelos 20° 55’ y 21° 09’ de latitud norte y los meridianos 88° 26’ y 88° 48’ de longitud oeste), ubicada al este de Yucatán y a 107 km de Mérida, capital del Estado. Cuenta con una población de 3.701 habitantes, repartidos en casas construidas con materiales duraderos y perecederos, como piedra, cartón, lámina, madera y paja. El clima de la región es cálido subhúmedo, con una temperatura media anual de 26,3 °C. La precipitación promedio anual es de 1.200 mm, y las lluvias se presentan generalmente en los meses de mayo y julio 10.
El suelo es principalmente para uso agropecuario (agricultura y ganadería) y, menos frecuentemente, para asentamientos urbanos. La vegetación predominante en las zonas aledañas a la localidad es de selva baja caducifolia, con pequeñas extensiones de selva mediana subperennifolia en la que se observan parches de pasto forrajero. La fauna endémica está constituida por pequeños mamíferos como roedores, ardillas, mapaches, coatíes y tejones, así como diversas clases de reptiles y aves 10.
En la comunidad de estudio se pudieron observar numerosos perros y gatos deambulando en los predios y las calles, así como grandes cantidades de desechos orgánicos e inorgánicos.
Captura de roedores
Los roedores fueron capturados entre julio y noviembre de 2016 en viviendas de la localidad de estudio (sinantrópicos) y en extensiones de los parches de selva sin intervención antropogénica (silvestres) ubicadas a 9 km del sitio de estudio. El muestreo se hizo siguiendo los lineamientos de la American Society of Mammalogists (ASM) 11 y otras especificaciones nacionales 12.
Para la captura de los roedores sinantrópicos, el asentamiento urbano se dividió en cuatro cuadrantes trazando dos ejes perpendiculares en el centro de la población. En cada cuadrante se seleccionaron por conveniencia diez casas (40 en total) y, allí, se recogieron las muestras en dos noches consecutivas durante dos semanas de cada mes. En cada vivienda se colocaron doce trampas Sherman (8 x 9 x 23 cm; H.B. Sherman Traps Inc.™; Tallahassee, Florida, Estados Unidos), distribuidas en el interior y en el patio, ubicadas cerca de lugares con evidencia de actividad o presencia de roedores y de potenciales fuentes de alimentación o alojamiento, previo consentimiento de los dueños u ocupantes.
Para el muestreo de las extensiones de selva, se distribuyeron 100 trampas Sherman a lo largo de diez transectos lineales, poniendo una trampa cada 8 a 9 metros. La captura se hizo en los mismos días y semanas que en los cuadrantes urbanos. Todas las trampas empleadas se colocaron en la mañana y se revisaron 24 horas después. El cebo utilizado fue una mezcla de hojuelas de avena y saborizante artificial de vainilla.
El presente estudio contó con la aprobación del Comité de Bioética del Campus de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad Autónoma de Yucatán (clave de registro: CBCCBA-M-2016-004) y de la Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales (registro N°SGPA/DGVS/00867/17) de México.
Toma de muestras biológicas
Todos los roedores capturados fueron trasladados a una estación de campo habilitada para su procesamiento. Los animales fueron anestesiados con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (130 mg/kg) y se les practicó la eutanasia por dislocación cervical, según los lineamientos de la American Veterinary Medical Association13.
Después de la eutanasia, se registraron los datos somáticos, la especie, el sexo, la edad (en ratones subadultos: ≤8 g, en adultos: >8 g; en ratas subadultas: ≤66 g, en adultas: >66 g) y el estado reproductivo de todos los individuos, el cual se consideró como “maduro” en hembras gestantes (embriones visibles), lactantes, o en las que tenían el orificio vaginal abierto, y como “inmaduro” cuando el orificio vaginal estaba cerrado. En machos, el estado “maduro” se determinó por la presencia de testículos no descendidos.
La identificación de las especies estuvo a cargo de médicos veterinarios con experiencia en muestreos y estudios poblacionales de roedores en la península de Yucatán. Además, se hicieron necropsias para recolectar las muestras biológicas (riñones), las cuales se depositaron en tubos para microcentrífuga de 1,5 ml (Eppendorf™; Hamburgo, Alemania) embebidos en alcohol al 96 % y conservados a -70 °C, hasta su empleo en la extracción del ADN total (hebra molde). Para evitar contaminaciones cruzadas, todo el instrumental empleado en la toma de muestras fue previamente desinfectado con alcohol y cloruro de benzalconio al 10 %.
Extracción del ADN total e identificaciónmolecular de Leptospira spp.
Antes de la extracción de los ácidos nucleicos, los riñones se lavaron con agua bidestilada durante cinco minutos, aproximadamente, para retirar el exceso de alcohol. El ADN total se extrajo directamente del tejido renal con ayuda del estuche QIAamp DNA Mini Kit™ (QIAGEN; Hilden, Alemania), siguiendo el protocolo DNA Purification from Tissues y según las especificaciones del fabricante.
Todas las extracciones se hicieron en una campana de flujo laminar (Labconco™; Kansas City, Estados Unidos). Para la cuantificación y la evaluación del ADN total extraído, se empleó un espectrofotómetro (NanoDrop 2000TM, ThermoScientific, Wilmington, Estados Unidos). La hebra molde de ADN se conservó a -70 °C hasta su empleo en la reacción molecular.
La detección molecular de Leptospira spp. se hizo mediante dos PCR de punto final, según la metodología de Torres-Castro, et al. 5,6. En la primera reacción, la cual se utilizó en todas las extracciones de ADN, se usaron los oligonucleótidos 16S3 (sentido) 14 y 16SR (antisentido) 15, que amplifican un fragmento esperado de 150 pb perteneciente al gen 16S ribosómico de Leptospira spp. (16S rRNA).
Con el objetivo de corroborar los resultados positivos de la reacción anterior, se hizo una segunda PCR en la cual se sustituyó el oligonucleótido 16S3 con el 16S5 (sentido) 14 y se conservó el oligonucleótido 16SR (antisentido) 15, los cuales amplifican un tamaño aproximado de 1.004 pb perteneciente también al gen 16SrRNA. Este gen es el más empleado y aceptado para el estudio y la identificación molecular de leptospiras patógenas y se encuentra muy conservado en todas las especies (patógenas, intermedias y saprófitas) 16.
Los reactivos utilizados en ambas reacciones tuvieron las siguientes concentraciones finales: solución tampón de PCR 5X; 2,5mM de MgCl2; 0,2 mM de deoxinucleósido trifosfato (dNTP); 0,2 mM de cada cebador; 1U de Taq polimerasa (ThermoScientific Inc.; Massachusetts, Estados Unidos) y agua bidestilada cbp. Se emplearon 4 ml de hebra molde de ADN para un volumen final de 25 ml.
Las condiciones en el termociclador para ambas reacciones fueron las siguientes: un ciclo de desnaturalización inicial a 95 °C durante cinco minutos, seguido de 34 ciclos a 94 °C durante 45 segundos, 94 °C durante un minuto y 72 °C durante dos minutos; la extensión final fue a 72 °C durante cinco minutos.
Para todas las reacciones, se incluyeron un control positivo (extracción de ADN de un cultivo de Leptospira patógena donado por el Laboratorio de Enfermedades Infecciosas y Parasitarias de la Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Yucatán) y un control negativo (agua estéril).
La electroforesis de los productos de la PCR se hicieron en geles de agarosa al 1 % teñidos con bromuro de etidio, y se visualizaron en un fotodocumentador (Bio-Rad; California, Estados Unidos).
Purificación y análisis del alineamiento
Los productos amplificados de 150 pb (correspondientes a la primera reacción) se retiraron del gel de agarosa al 1 % con ayuda de un bisturí estéril y, posteriormente, se purificaron con el estuche comercial Zymoclean Gel DNA Recovery™ (Zymo-Research; California, Estados Unidos), según las especificaciones del fabricante. Los cinco productos purificados fueron enviados para su secuenciación al laboratorio DIMYGEN™ (Mérida, Yucatán, México; http://www.dimygen.com/). Las secuencias obtenidas se compararon con otras previamente depositadas en el GenBank, empleando la herramienta Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) del National Institutes of Heatlh (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), con el fin de determinar y comparar su identidad y similitud.
Resultados
Captura de roedores
Se capturaron 92 individuos pertenecientes a siete especies distintas: 25 (27,2 %) Rattus rattus, 25 (27,2 %) Mus musculus, 22 (23,9 %) H. gaumeri, 10 (10,9 %) Ototylomys phyllotis, 8 (8,8 %) Peromyscus yucatanicus, 1 (1,0 %) Peromyscus leucopus y 1 (1,0 %) Sigmodon hispidus. En el medio urbano se capturaron 48 (52,2 %) roedores: 24 (50 %) M. musculus y 24 (50 %) R. rattus, en tanto que, en el medio silvestre, se capturaron 44 (47,8 %): 22 (50 %) H. gaumeri, 10 (22,7 %) O. phyllotis, 8 (18,1 %) P. yucatanicus, 1 (2,3 %) P. leucopus, 1 (2,3 %) S. hispidus, 1 (2,3 %) R. rattus y 1 (2,3 %) M. musculus. Las frecuencias de las edades, sexos y estados reproductivos de los individuos pertenecientes a cada especie, se presentan en el cuadro 1.
Cuadro 1 Número y frecuencias correspondientes a sexo, edad y estado reproductivo de los roedores sinantrópicos y silvestres capturados en la comunidad rural de Cenotillo, Yucatán, México
Identificación molecular de Leptospira spp.
La prueba molecular arrojó una frecuencia positiva global de 5,4 % (5/92). De este porcentaje, 2 de 5 correspondió a R. rattus, otros 2 de 5 a M. musculus y 1 de 5 a H. gaumeri. Cuatro de 5 de los individuos positivos eran hembras y 1 de 5 era macho. Todos los roedores positivos eran adultos. En la figura 1 se muestra el gel representativo con algunos de los productos de PCR positivos. La frecuencia de infección por especie fue de 8 % (2/25) para R. rattus, 8 % (2/25) para M. musculus y 4,5 % (1/22) para H. gaumeri.
Figura 1 Gel de agarosa al 1 % teñido con bromuro de etidio. Se observan algunas amplificaciones de 150 pb positivas para el gen 16S rRNA de Leptospira interrogans en roedores sinantrópicos y silvestres de Yucatán, México. 1: marcador de peso molecular de 100 pb; 2: muestra positiva de H. gaumeri; 3: muestra positiva de R. rattus; 4: muestra positiva de M. musculus; 5: control positivo; 6: control negativo; 7 y 8: vacíos.
Discusión
En años recientes, se ha presentado en Yucatán un incremento significativo en el número de investigaciones epidemiológicas sobre agentes infecciosos con importancia en salud pública y veterinaria, en las que se ha establecido que los roedores sinantrópicos y silvestres son reservorios o portadores asintomáticos 17. Asimismo, en estudios poblacionales y ecológicos se ha comprobado que las especies sinantrópicas M. musculus y R. rattus son las más importantes y abundantes en ambientes urbanos y periurbanos de Yucatán, lo cual se debe a factores como la presencia de numerosas fuentes de alimento y de amplios sitios de resguardo y reproducción, así como al escaso número de depredadores 18,19.
La circulación de Leptospira spp. se ha evidenciado en humanos 20-22 y en animales de Yucatán 8,9,21,23, lo cual indica la importancia de esta bacteria en la región. De igual forma, Torres-Castro, et al.5,6, y Vado-Solís, et al.21, demostraron la infección en M. musculus y R. rattus con especies y serovares patógenos de Leptospira spp. mediante pruebas moleculares, histopatológicas y serológicas. No obstante, Reyes-Novelo, et al. 24, han señalado la necesidad de incrementar el número de investigaciones en poblaciones de animales silvestres que pudieran estar involucrados en el ciclo infeccioso de la leptospirosis en el sureste de México.
El presente es el primer estudio realizado en siete especies de roedores silvestres y sinantrópicos de Yucatán. Actualmente, se reconoce que la fauna silvestre, particularmente los pequeños mamíferos, pueden considerarse reservorios de Leptospira spp. de origen silvestre, constituir una fuente de mantenimiento y potencial foco de infección interespecífica, asegurando la circulación de ciertos serovares entre las mismas especies de animales, y ser huéspedes sensibles a la infección cuando entran en contacto por primera vez con serovares de circulación doméstica con los cuales no habían tenido contacto en su ambiente silvestre natural. Asimismo, se ha descrito que los animales silvestres pueden convertirse en huéspedes de mantenimiento, dependiendo de elementos como el serovar infeccioso y los factores ambientales 25,26, y representar un riesgo potencial para la diseminación de la enfermedad en las poblaciones humanas 2.
Heteromys gaumeri es un roedor endémico de la península de Yucatán, y ya se ha identificado en estudios en ambientes periurbanos y urbanos de la región 18,27. Espinosa-Martínez, et al. 28, demostraron la circulación de L. interrogans en un individuo capturado en la reserva ecológica de Calakmul, Campeche, México, hallazgo similar al reportado en la presente investigación. Ambos hallazgos aportan nueva evidencia sobre la probable participación de este roedor en el ciclo infeccioso de la leptospirosis; además, los presentes resultados los sitúan como nuevos reservorios de Leptospira spp. en Yucatán. En un estudio previo, Panti-May, et al.27, reportaron individuos de H. gaumeri positivos para Rickettsia felis, otro patógeno zoonótico endémico en la región 29.
En numerosos estudios moleculares alrededor del mundo, se ha documentado la circulación de Leptospira spp. en roedores sinantrópicos, principalmente R. rattus y M. musculus, lo cual los convierte en los reservorios más relevantes de dicha bacteria 30. En algunos de estos estudios se han registrado frecuencias de infección superiores a la reportada en el presente trabajo; por ejemplo, Guernier, et al.31, evidenciaron prevalencias de 38,5 y 9 % para R. rattus y M. musculus, respectivamente, en la Isla Reunión. Asimismo, Halliday, et al.32, encontraron 20 % de infección en ejemplares de M. musculus y 9 % en los de R. rattus capturados en un asentamiento urbano de Nairobi, Kenia.
En otros estudios se presentan porcentajes similares al descrito en el presente, por ejemplo, Mayer- Scholl, et al.33, encontraron 6 % en individuos M. musculus capturados en 11 regiones de Alemania. En Tanzania, Mgode, et al.34, no reportaron individuos R. rattus o M. musculus positivos, aunque debe señalarse que trabajaron con un ejemplar de cada especie.
Por otra parte, los productos aislados en las tres especies de roedores positivos en el presente estudio correspondieron a la especie patógena L. interrogans, previamente identificada en estos mismos animales en Yucatán 5. Asimismo, Foronda, et al.35, reportaron la circulación de L. interrogans en M. musculus y R. rattus capturados en las Islas Canarias, España, y Tucunduva de Faria, et al.36, en individuos Rattus spp., capturados en Salvador, Brasil.
En el presente estudio se registró una mayor frecuencia de infección en los roedores capturados en el ambiente urbano en comparación con los obtenidos en el medio silvestre, lo cual sugeriría que las leptospiras no se estarían propagando entre las poblaciones de roedores de ambos sitios de captura; sin embargo, se requieren nuevos estudios epidemiológicos para corroborar esta hipótesis.
Después de la confirmación de la presencia de Leptospira patógena en tejido renal de roedores sinantrópicos y silvestres de Yucatán, es necesario hacer muestreos más extensos y numerosos que ayuden a identificar otras especies, así como los serovares de Leptospira circulantes que eventualmente puedan infectar a animales y humanos de la región, pues la presencia de fauna silvestre o doméstica en las viviendas se ha asociado con la presentación de casos de leptospirosis humana de curso moderado a grave 37,38.
Asimismo, deben hacerse capturas en diferentes estaciones y temporadas (de lluvia y secas), ya que el factor ambiental también puede influir en los porcentajes de positividad encontrados en las diferentes especies 2,37, pues el contacto con fuentes de agua contaminada es un elemento fundamental para la transmisión de Leptospira spp. 39-42. Además, un estudio de casos y controles ayudaría a determinar el riesgo real asociado con la incidencia de leptospirosis en la población humana del sitio de estudio 43.
Resulta necesario aclarar las limitaciones del presente trabajo: aunque fue posible determinar que los roedores capturados eran portadores de Leptospira spp., y habían excretado bacterias viables, la técnica utilizada no permitió identificar los serovares involucrados en la infección, por lo que es necesario utilizar otras herramientas diagnósticas de identificación, como la microaglutinación (MAT), que permitan, además, saber si las posibles serovares son atípicos para los roedores de Yucatán 44,45. La identificación de serovares de Leptospira spp. en ambientes endémicos permite un mejor conocimiento de la epidemiología de la enfermedad, así como la implementación de medidas de control durante posibles brotes 46.
En conclusión, los roedores capturados en el sitio de estudio (Yucatán, México) eran reservorios de Leptospira spp. y podrían ser parte del ciclo de infección de la leptospirosis en la región. Se presenta la primera evidencia molecular de la circulación de Leptospira spp. en H. gaumeri en Yucatán, México.
