INTRODUCCIÓN

Los metales pesados (MPs) pueden estar presentes en diversos suelos alrededor del mundo (^{Mahar et al., 2016}) y son considerados como uno de los mayores estreses abióticos que pueden afectar y modificar las poblaciones microbianas del suelo, incluidos los hongos formadores de micorrizas arbusculares (HFMA) (^{Krishnamoorthy et al., 2015}). Dentro de los MPs se encuentra el cadmio (Cd) que está presente naturalmente en el suelo como resultado de la meteorización de su material parental (^{Gramlich et al., 2018}) o producto de actividades antropogénicas como la aplicación de fertilizantes, riego con aguas contaminadas o vertimiento de residuos industriales (^{Lora y Bonilla, 2010}; ^{Schneider et al., 2016}).

El cacao es una planta que tiene alta capacidad para extraer, transportar y acumular Cd en sus frutos (^{Gramlich et al., 2018}), por lo cual la probabilidad de encontrar trazas de este metal en el grano aumenta con el establecimiento de cultivos en suelos con disponibilidad de Cd. La presencia de Cd en suelos cacaoteros se ha reportado en diferentes países productores de América como: Venezuela (^{Lanza et al., 2016}), Perú (^{Arévalo-gardini et al., 2017}), Ecuador (^{Chavez et al., 2015}), Colombia (^{Bravo et al., 2018}), Bolivia (Gramlich et al., 2017) y Honduras (Gramlich et al., 2018). Por esta razón, la búsqueda de alternativas que mitiguen la toma de Cd por parte de la planta son necesarias para evitar efectos negativos no solo en el mercado de los productos derivados del cultivo (Jiménez, 2015) sino también en la seguridad alimentaria descartando problemas nocivos en la dieta del consumidor que afecten su salud (FAO y OMS, 2014; ^{Meter et al., 2019}).

Los HFMA son biótrofos obligados que se asocian aproximadamente al 71 % de las plantas terrestres (^{Brundrett y Tedersoo, 2018}) y su asociación es ampliamente conocida por ser una de las estrategias más antiguas y extendidas para aumentar la tolerancia a estreses bióticos y abióticos de las plantas (^{Hildebrandt et al., 2007}). No obstante, la contribución de los HFMA a su planta hospedero depende de la diversidad, abundancia y eficiencia de sus comunidades (^{Schneider et al., 2016}), las cuales varían en función de diversos factores como altitud (^{Oehl et al., 2017}), régimen de humedad, fertilidad del suelo (Hazard et al., 2007), contenido y tipo de MPs (^{Xu et al., 2017}), composición de la microbiota del suelo (^{Svenningsen et al., 2018}) y manejo agronómico (^{Pontes et al., 2017}), entre otros factores.

La determinación de la composición de las comunidades HFMA locales, presentes en suelos enriquecidos con metales como el Cd, es la base para desarrollar estrategias de mitigación que amortigüen el impacto de estos suelos en un agroecosistema (^{Schneider et al., 2016}), ya que estas comunidades pueden haber desarrollado tolerancia al metal y jugar un papel importante en la fitoremediación en sitios contaminados (^{Khan et al., 2000}). De esta manera reducen la acumulación de Cd y la fitotoxicidad en sus plantas hospedero (^{Hildebrandt et al., 2007}; ^{Millar y Bennett, 2016}). Esta respuesta benéfica para las plantas hospedero no está asociada exclusivamente a una única especie de HFMA sino a la función que cumple la comunidad (^{Rodriguez y Sanders, 2015}), ya que se han detectado diferencias en la retención y secuestro de MPs entre especies de HFMA (^{Pagano et al., 2010}). No obstante, las respuestas desfavorables, como incrementos en la toma de MPs por las plantas, sugieren la necesidad de contar con un mejor entendimiento de esta simbiosis, ya que otros factores como la genética de la planta hospedero y el tipo y concentración de MPs en el suelo, pueden afectar este proceso (^{Audet y Charest, 2007}).

La dinámica de las comunidades de HFMA en presencia de un estrés ambiental ha sido descrita mediante el uso de los modelos de exclusión y adaptación propuestos por ^{Millar y Bennett (2016)}, los cuales proponen modificaciones en la estructura de la comunidad de HFMA dependiendo de la intensidad y duración del tipo de estrés. En general, los estudios de diversidad de HFMA realizados en suelos contaminados con MPs se enfocan en el análisis de áreas expuestas a algún tipo de contaminación antropogénica, como el vertimiento de residuos industriales (^{Krishnamoorthy et al., 2015}; ^{Schneider et al., 2016}), de alcantarillado (^{Del Val et al., 1999}) y de minería (^{Vogel-Mikus et al., 2005}). Estos estudios únicamente corroboran la hipótesis de exclusión de Millar y Bennet, en la que la diversidad de HFMA se reduce y se modifica a corto plazo tras la aplicación del estrés en el suelo. En la actualidad no se han reportado estudios de diversidad de HFMA en suelos enriquecidos naturalmente con MPs, en los que la intensidad del estrés ha sido constante y continúa y podrían encontrarse comunidades de HFMA locales que tengan un efecto benéfico para sus plantas hospedero (Millar y Bennett, 2016). La hipótesis de esta investigación se basa en que la presencia natural de altas concentraciones de Cd en suelos cacaoteros afectaran la estructura de la comunidad de HFMA.

Este estudio busca caracterizar la diversidad de la comunidad de HFMA presente en suelos cacaoteros con niveles contrastantes y naturales de Cd para determinar el efecto que tiene este metal en la estructura de estas comunidades. Para ello, se realizó: (i) la determinación de las propiedades físicoquímicas de los suelos, (ii) la identificación y multiplicación de las morfoespecies presentes usando plantas trampa, (iii) la cuantificación de las abundancias relativas de morfoespecies y (iv) la comparación de las comunidades mediante la determinación de índices de diversidad alfa y beta así como por medio de un análisis de componentes principales (ACP). Los resultados de esta investigación permitieron identificar morfoespecies de HFMA que podrían tener potencial para el desarrollo de programas de mitigación en suelos contaminados con Cd.

MATERIALES Y MÉTODOS

RESULTADOS

Estructura de la comunidad de HFMA

Con base en el análisis taxonómico de las esporas presentes en B-Cd y A-Cd, en muestras originales y multiplicadas en plantas trampa, se identificaron en total 23 morfoespecies diferentes (Fig. 1) pertenecientes a un total de siete géneros (Fig. 2a), de los cuales Glomus (Tul y Tul), Claroideoglomus (Walker y Schüssler, emend. Oehl, Silva y Sieverding (Glomus group B1)), Rhizoglomus (Sieverding, Silva y Oehl, gen. nov.), Acaulospora (Gerdemann y Trappe) y Funneliformis (Walker y Schüssler, emend. Oehl, Silva y Sieverding (Glomus group Aa1)) estuvieron presentes en ambos suelos. Los géneros Ambispora (Walker, Vestberg y Schuessler) y Diversispora (Walker y Schüssler, emend. Silva, Oehl y Sieverding (Glomus group Ca)) solamente se detectaron en B-Cd y A-Cd, respectivamente. Al comparar la riqueza de morfoespecies presente en las muestras originales, se encontró una mayor riqueza de morfoespecies en B-Cd (15), destacándose Glomus y Acaulospora, mientras que en A-Cd (12) se encontró un mayor número de morfoespecies de Claroeidoglomus (Fig. 2a). Por otro lado, después del proceso de multiplicación de esporas en plantas trampa, se detectó que tanto en B-Cd como en A-Cd la riqueza disminuyó en una morfoespecie con respecto a la encontrada en sus muestras originales (Fig. 2a).

Figura 1 Morfoespecies de HFMA encontradas en muestras de suelo con alta (A-Cd) y baja (B-Cd) concentración de Cd. Glomus atrouva (a), Claroideoglomus sp.1 (b), Rhizoglomus sp. (c), Claroideoglomus etunicatum (d), Funneliformis mosseae (e), Diversispora spurca (f), Acaulospora sp.1 (g), Glomus sinuosum (h), Glomus microcarpum (i), Rhizoglomus fasciculatum (j), Rhizoglomus microaggregatum (k), Acaulospora sp.2 (l), Glomus aureum (m), Acaulospora foveata (n), Glomus sp.1 (o), Glomus sp.3 (p), Acaulospora colombiana (q), Claroideoglomus drummondii (r), Glomus sp.2 (s), Claroideoglomus sp.2 (t), Funneliformis verruculosus (u), Acaulospora mellea (v), Ambispora sp. (w). 

La abundancia de esporas de HFMA en las muestras originales fue significativamente menor en A-Cd (21 %) con respecto a B-Cd (Fig. 2b); posterior al proceso de multiplicación la abundancia se incrementó significativamente en B-Cd (62 %) y A-Cd (208 %) con respecto a su abundancia en las muestras originales. Finalmente, la diversidad medida mediante el índice de Shannon fue significativamente menor en A-Cd con respecto a B-Cd (11 %) y no se encontraron diferencias significativas entre las muestras originales y multiplicadas (Fig. 2c).

Tabla 1 Análisis físico-químico de las muestras de suelo con baja (B-Cd) y alta (A-Cd) concentración de Cd. 

Suelo	CO	NT	K	Ca	Mg	Na	Al	CICE	P	S	Cu	Fe	Mn	Zn	B	Cd-t	Cd-d	pH	Textura	Taxonomía
	%			meq / 100 g				mg / kg					1:1
B-Cd	7,29	0,63	0,29	1,1	0,3	0,04	5,38	7,11	21	22	0,48	310	1,9	1,83	0,44	1,5b	0,10b	4,2	FAr	Typic dytrudepts
A-Cd	5,75	0,5	0,18	23,7	1,02	0,07	0	25	30	13,5	4,24	175	15	64,6	0,41	27,3a	20,9ª	5,9	FAr	udorthents
p-valor																***	***

CO: Carbono orgánico; NT: Nitrógeno total; CICE: Capacidad de intercambio catiónico efectiva; Al: Acidez intercambiable; Cd-t: Cadmio total; Cd-d: Cadmio disponible; FAr: Franco-arcillosa. Asteriscos indican p-valor (***, <0.001) del análisis de variancia correspondientes a las diferen cias entre tipos de suelo. Valores con la misma letra en sentido vertical no son estadísticamente diferentes según pruebas de Tukey (a<0,05; n=4, CV: 20,6%).

Figura 2 Riqueza (a), abundancia (b) y diversidad (c) de hongos formadores de micorrizas arbusculares (HFMA) encontrados en suelos con baja (B-Cd) y alta (A-Cd) concentración de Cd, en muestras del suelo original (Original) y después de multiplicar sus esporas mediante plantas trampa durante seis meses (Multiplicado). Valores con la misma letra no son estadísticamente diferentes según las pruebas de Tukey (a < 0,05; n = 12). Las diferentes texturas en la figura (a) corresponden a los géneros de las morfoespecies encontradas. 

La abundancia relativa de morfoespecies de HFMA en muestras originales de ambos suelos presentó diferencias (Fig. 3a). En B-Cd predominaron R. fasciculatum ((Thaxt) Sieverding, Silva y Oehl comb. nov.) (17 %), Claroeideoglomus sp.2 (15 %), Acaulospora mellea (Spain y Schenk) (13 %) y Glomus sp.1 (13 %), mientras que en A-Cd predominaron Diversispora spurca ((Pfeiff, Walker y Bloss) Walker y Schüssler) (22 %), Rhizoglomus sp. (20 %), Claroideoglomus etunicatum ((Becker y Gerdemann) Walker y Schüssler) (16 %), Acaulospora sp.1 (10 %) y Rhizoglomus microaggregatum ((Koske, Gemma y Olexia) Sieverding, Silva y Oehl comb. nov.) (9 %). Únicamente cuatro morfoespecies de las 23 descritas se presentaron en ambas muestras (Fig. 3a); estas fueron Glomus microcarpum (Tul y Tul) (Fig. Rhizoglomus fasciculatum (Fig. Rhizoglomus microaggregatum (Fig. 1k) y Acaulospora sp.1 (Fig. 1l).

Posterior al proceso de multiplicación con plantas trampa, se observó que las morfoespecies Acaulospora sp.1, Ambispora sp., Claroideoglomus drumondi ((Btaszkowski y Renker) Walker y Schüssler), Funneliformis verruculosus ((Blaszkowski) Walker y Schüssler) y Glomus microcarpum en B-Cd fueron, respectivamente, 4,1; 4,2; 3,2; 2,9 y 2,1 veces, más frecuentes que en sus muestras originales (Fig. 3). En A-Cd Claroideoglomus etunicatum, Rhizoglomus fasciculatum y Funneliformis mosseae ((Nicolson y Gerdenmann) Walker y Schüssler) fueron, correspondientemente, 2,5; 2,4 y 2,1 veces más frecuentes que en sus muestras originales. No se detectó Rhizoglomus microaggregatum (Fig. 1k) en ninguna de las muestras de suelo estudiadas (Fig. 3b).

Figura 3 Abundancias relativas de morfoespecies de HFMA encontradas en suelos con baja (B-Cd) y alta (A-Cd) concentración de Cd, en muestras de suelo originales (a) y posterior a su multiplicación en plantas trampa de cebolla durante seis meses (b). 

DISCUSIÓN

La alta concentración de Cd total presente en las muestras A-Cd (27,3 mg kg^-1) puede estar relacionada con el material parental sedimentario presente en esta zona de Yacopí, en donde se han reportado cherts, calizas, areniscas y shales negros (IGAC, 2000). En este último tipo de roca encontrada en otros suelos, se han reportado concentraciones hasta 200 mg kg^-1 de Cd (^{He et al., 2005}), por lo que los suelos desarrollados a partir de estas rocas pueden reflejar este tipo de composición química. Por otra parte, la alta concentración de Cd disponible en A-Cd (20,9 mg kg^-1) puede estar relacionada con la moderada acidez del suelo (5,9) y la presencia de carbonatos en la zona (Rodríguez et al., 2019), ya que el Cd puede encontrarse disponible en las fracciones acida soluble (^{Chavez et al., 2016}) y las dependientes de carbonatos (Rodríguez et al., 2019). Otros elementos además del Cd, como Zn, Cu y Mn, se encontraron en mayor concentración en A-Cd, pero dentro del rango normal para suelos (^{Kabata-Pendias y Barbara, 2015}).

La alta concentración y disponibilidad de Cd asociada al material parental sedimentario de la región impone una condición de estrés continua y constante que modifica la estructura de la comunidad de HFMA (^{Millar y Bennett, 2016}). En las muestras de suelo rizosférico de cacao que poseían una alta concentración de Cd se encontró menor riqueza, abundancia y diversidad de morfoespecies de HFMA, con respecto a las encontradas en la localidad cercana con una baja concentración de Cd (Fig. 2), siendo estas dos últimas significativamente diferentes. Resultados similares se encontraron en suelos contaminados por actividades antropogénicas con concentraciones superiores a 2,8 mg kg^-1 Cd, los cuales presentaron menor riqueza (^{Vogel-Mikus et al., 2005}), abundancia y diversidad de HFMA (^{Del Val et al., 1999}; Hassan et al., 2011). El Cd es un elemento que, en condiciones in vitro, ha mostrado inhibir la germinación de las esporas, restringir el desarrollo de las hifas e interferir con su ciclo de vida (^{Weissenhorn et al., 1993}), por lo que su presencia puede alterar la estructura de la comunidad al remover las especies más sensibles y favorecer aquellas con mayor adaptación (^{Schneider et al., 2016}).

Los HFMA han demostrado adaptabilidad para estar presentes en diversos ambientes extremos (^{Weissenhorn et al., 1993}). En este caso, un suelo enriquecido naturalmente con altas concentraciones de Cd proporciona una condición de estrés constante y continua que selecciona a las especies, no solo por su funcionalidad ecosistémica, sino por su capacidad de adaptación al estrés (^{Millar y Bennett, 2016}). Se sugiere que la persistencia de algunos HFMA en estos ambientes está asociada a diferentes mecanismos de tolerancia a la presencia de MPs, como secreción de quelatinas, síntesis de glicoproteínas como la glomalina (^{Leal et al., 2016}) y retención en su pared celular por grupos carboxilo e hidroxilo (^{Khan, 2006}), así como la detoxificación y acumulación de iones metálicos en vacuolas mediante metalotioneinas (^{Meier et al., 2012}).

Los géneros detectados en A-Cd (Fig. 2a), como Glomus, Acaulospora, Claroideoglomus y Funneliformis, se han reportado en suelos contaminados con 3,1 mg kg^-1 Cd (^{Krishnamoorthy et al., 2015}) y 3,12 mg kg^-1 Cd (^{Xu et al., 2017}). Interesantemente, aunque A-Cd y B-Cd presentaron similaridad en su composición por géneros (cinco de siete en común, Fig. 2a), fueron diferentes en términos de morfoespecies (cuatro de 23 en común, Fig. 3a). Esto podría indicar que las morfoespecies presentes en A-Cd cuentan con una alta capacidad de adaptación y mecanismos de tolerancia que les permite persistir en un ambiente limitante (^{Weissenhorn et al., 1993}; ^{Millar y Bennett, 2016}), como altas concentraciones de Cd. Ejemplo de ello es la presencia de C. etunicatum, F. mosseae y G. sinuosum ((Gerdenmann y Bakshi) Almeida y Schenck) en A-Cd, que ya han sido reportados en suelos contaminados con Cd (Weissenhorn et al., 1993; ^{Del Val et al., 1999}; Krishnamoorthy et al., 2015) y otro tipo de MPs como Cu y As (Hassan et al., 2011) o Pb y Zn (^{Zarei et al., 2008}).

La alta capacidad de producción de esporas de las morfoespecies C. etunicatum y R. fasciculatum en A-Cd posterior al proceso de multiplicación en cultivos trampa (Fig. 3b) puede estar asociada a una estrategia de reproducción tipo -r (^{Chagnon et al., 2013}) o de colonización (^{Hart et al., 2001}), caracterizadas por una alta producción de esporas y mayores tasas de crecimiento que les confieren ventajas en la colonización del hospedero. Notablemente, R. microagregatum fue la única morfoespecie que no se detectó posterior a los seis meses de cultivo trampa (Fig. 3b). Esto podría deberse a que existen diferencias en el tiempo de esporulación entre las especies de HFMA (^{Antoniolli et al., 2002}; ^{Souza et al., 2005}) y en la capacidad de multiplicación de las especies hospedero (^{Del Val et al., 1999}). Por estas razones, futuros estudios deberían contemplar el uso de más de una especie de planta trampa, diferentes tiempos de muestreo y otros aspectos que permitan multiplicar la totalidad de la diversidad de esporas presentes en los suelos. Adicionalmente, el uso de otros enfoques moleculares como metagenómica y análisis de polimorfismos alélicos (^{Sanders y Rodriguez, 2016}) pueden brindar una mejor resolución y entendimiento de la diversidad de HFMA presentes en los suelos estudiados.

Los índices de diversidad alfa y beta permitieron contrastar las diferencias entre las comunidades de HFMA presentes en ambos suelos (Tabla 2). El índice de uniformidad, que oscila entre cero (heterogéneo) a uno (uniforme), permitió identificar que las comunidades de HFMA en B-Cd son más uniformes con respecto a las encontradas en A-Cd; esto fue confirmado por el índice de Simpson que presentó valores significativamente mayores en A-Cd con respecto a B-Cd, lo que indicaría que existe mayor dominancia por algunas morfoespecies como Diversispora spurca (24 %), Rhizoglomus sp. (20 %) y Claroideoglomus etunicatum (16 %), las cuales reunieron más del 50 % de la comunidad de HFMA presente en A-Cd (Fig. 3a). Los índices de diversidad beta indicaron bajas similaridad y tasa de recambio entre las comunidades de HFMA provenientes de B-Cd y A-Cd (Tabla 2), encontrando en común únicamente las morfoespecies G. microcarpum, Acaulospora sp., R. microaggregatum y R. fasciculatum (Fig. 3b). Esto sugiere que estas morfoespecies poseen una alta capacidad para tolerar ambientes con un amplio espectro de concentraciones de Cd.

La baja similaridad encontrada entre las comunidades de HFMA puede deberse a diferencias ecológicas en las estrategias de las historias de vida para maximizar su supervivencia en diferentes ambientes (^{Millar y Bennett, 2016}). Las altas concentraciones de Cd pueden generar cambios en la proporción de tipos funcionales de HFMA a favor de especies estrés-tolerantes y limitar aquellas ruderales o competidoras. Las especies estrés-tolerantes de HFMA se caracterizan por tener mecanismos de tolerancia al estrés, bajas tasas de crecimiento y poca, pero longeva biomasa extraradical (^{Chagnon et al., 2013}), por lo que plantas perennes y con una tasa lenta de crecimiento, como el cacao, tienen una mayor probabilidad de verse beneficiadas por estas especies de HFMA. Adicionalmente, cualquier condición adversa que limite la fijación de carbono por las plantas, en este caso una alta concentración de Cd, es probable que afecte el flujo de carbono hacia los HFMA, por lo que las especies con un uso más eficiente del carbono, como las HFMA estrés-tolerantes, pueden ser las más beneficiadas a largo plazo (Chagnon et al., 2013).

CONCLUSIONES

La alta concentración y disponibilidad de Cd generan una condición de estrés continua y constante a la comunidad de HFMA afectando su estructura. En suelos cacaoteros enriquecidos naturalmente con Cd se encontró menor abundancia, riqueza y diversidad de morfoespecies de HFMA, así como comunidades de HFMA menos uniformes y con dominancia, con respecto a lo detectado en suelos con baja concentración de Cd. Las bajas similaridad y tasa de recambio entre las comunidades estudiadas pueden estar relacionadas con las diferencias en las estrategias de las historias de vida, encontrando mayor proporción de HFMA estrés-tolerantes en A-Cd, con una mayor abundancia a D. spurca, Rhizoglomus sp. y C. etunicatum. La identificación de estas morfoespecies constituye el primer paso para el desarrollo de estrategias de mitigación de plantas crecidas en suelos con este tipo de estrés; sin embargo, su efecto en plantas de cacao debe ser evaluado y validado en experimentos de campo, ya que existe gran variabilidad en el tipo de respuesta de las plantas dependiendo de varios factores como la especie vegetal o de HFMA, la concentraciones de Cd y las propiedades físico-químicas del suelo, entre otras.

Figura 4 Análisis de componentes principales (a) y clúster jerárquico basada en la disimilaridad de Bray-Curtis (b) de las morfoespecies de HFMA encontradas en muestreos de dos suelos con bajo (B-Cd, verde) y alto (A-Cd, rojo) concentración de Cd o ambos (negro) (n=12). Los recuadros azules indican probabilidad (>95%) de la existencia de un clúster usando valor aproximado sin sesgo. Los nombres de las morfoespecies se encuentran abreviados de la siguiente manera: Glomus microcarpum (Glmic), Rhizoglomus fasciculatum (Rhifas), Glomus atrouva (Glatr), Claroideoglomus sp. 1 (Clasp1), Rhizhoglomus sp. (Rhisp), Claroideoglomus etunicatum (Claetu), Funneliformis mosseae (Funmos), Diversispora spurca (Divspu), Acaulospora sp. 1 (Acasp1), Acaulospora sp.2 (Acasp2), Glomus microaggregatum (Glmic), Glomus Sinuosum (Glsin), Glomus aureum (Glaur), Rhizoglomus fasciculatum (Rhifas), Acaulospora foveata (Acafov), Glomus sp.1 (Glsp1), Acaulospora colombiana (Acacol), Glomus microcarpum (Glmic), Glomus sp.2 (Glsp2), Claroideoglomus sp.2 (Clasp2), Glomus sp.3 (Glsp3), Funneliformis verruculosus (Funver), Acaulospora mellea (Acamel), Ambispora sp. (Ambsp), Claroideoglomus drummondii (Cladru).