INTRODUCCIÓN

En la última década se ha documentado el declive acelerado de muchas poblaciones de anuros a nivel mundial (^{De Sá, 2005}; ^{Hussain, 2012}; ^{Catenazzi, 2015}). Factores como el aumento de la radiación ultravioleta, la minería, la introducción de especies invasoras y las enfermedades emergentes, se consideran como posibles causas de este declive (^{Mattoon, 2000}; ^{Collins y Storfer, 2003}; ^{Beebee y Griffiths, 2005}), así como el incremento en la temperatura ambiental (^{Beebee y Griffiths, 2005}; ^{Catenazzi, 2015}) y la contaminación por agroquímicos (^{Collins y Storfer, 2003}; ^{Hayes etal., 2006}; ^{Ortiz-Santaliestra y Egea-Serrano, 2013}).

Los anuros son organismos particularmente sensibles a la aplicación de productos de uso agrícola, lo cual se atribuye a su piel altamente permeable que facilita la difusión del contaminante al interior de los organismos, haciéndolos más vulnerable en comparación con otros vertebrados. Además, durante sus primeros estadios de desarrollo como embriones y renacuajos, muchas especies se desarrollan en cuerpos de agua contaminados por agroquímicos, de los cuales no pueden escapar (^{Plõtner y Matschke, 2012}; ^{Ortiz-Santaliestra y Egea-Serrano, 2013}). Entre los contaminantes químicos más usados en la agricultura se encuentran los insecticidas organofosforados, los cuales se consideran compuestos altamente tóxicos para numerosos organismos (^{Gallo-Delgado et al., 2006}), incluyendo animales acuáticos, aves y mamíferos. Especialmente en anuros generan altos porcentajes de mortalidad (^{Snawder y Chambers, 1989}; ^{Sparling y Fellers, 2007}; ²⁰⁰⁹; ^{Wijesinghe et al., 2011}; ^{Ortiz-Santaliestra et al., 2017}). Su mecanismo de acción se debe particularmente a la inhibición de la enzima acetilcolinesterasa, una molécula común en los organismos con un sistema nervioso desarrollado (^{Richards y Kendall, 2002}; ^{Kavitha y Rao, 2007}; ^{Robles-Mendoza et al., 2011}). Como resultado de esa inhibición, la acetilcolina acumulada en la sinapsis provoca una estimulación repetida e incontrolada en las neuronas, lo que causa la muerte del animal (^{Giesy y Solomon, 2014}).

Por su parte, la temperatura es uno de los factores abióticos que más influye en los procesos fisiológicos de los organismos, debido a los efectos termodinámicos sobre las reacciones bioquímicas (^{Randall et al., 2002}). En ectotermos, como los anuros, la temperatura corporal está determinada por la temperatura ambiental (^{Randall et al., 2002}), de manera que los cambios en la temperatura del ambiente afectan directamente su fisiología y alteran aspectos tan importantes como la supervivencia, el crecimiento, el rendimiento y el desarrollo (^{Angilletta y Angilletta, 2009}). Varias investigaciones indican que la temperatura juega un rol importante en la toxicidad de muchos contaminantes químicos presentes en el medio acuático (^{Ferrando et al., 1987}; ^{Harwood et al., 2009}; ^{Rumschlag et al., 2014}; ^{Alza et al., 2016}; ^{Baier et al., 2016}), ya sea aumentando o disminuyendo su toxicidad. Para el caso de los insecticidas organofosforados, se ha encontrado que la toxicidad en algunas especies de dípteros (Clase: Insecta) se correlaciona positivamente con la temperatura (^{Lydy et al., 1999}; ^{Harwood et al., 2009}); no obstante, factores como la sensibilidad térmica del organismo y la estabilidad térmica de la presentación comercial influyen de manera directa en el riesgo de exposición. En anuros, la toxicidad de los insecticidas organofosforados y la sensibilidad a las temperaturas altas se han estudiado individualmente, sin considerar que en el ambiente pueden ejercer un efecto interactivo sobre las especies.

Debido a que los insecticidas organofosforados son los agroquímicos más usados en Colombia (^{Instituto Colombiano Agropecuario, 2017}), y que además se pronostica un aumento de la temperatura de hasta 2,14 °C en las próximas décadas en este territorio (^{IDEAM, 2017}), resulta importante evaluar su efecto interactivo sobre la fauna anura, especialmente en aquellos estadíos como los embriones, que están sometidos a cuerpos de agua contaminados. Por lo anterior, el presente estudio evaluó la toxicidad de los insecticidas organofosforados clorpirifos, diazinón y monocrotofos, los cuales son ampliamente comercializados en el país, bajo tres regímenes térmicos, en embriones de tres especies de anuros comúnmente asociados a agroecosistemas. En este sentido, se espera que a mayor temperatura los agroquímicos aumenten su efecto letal en los embriones.

MATERIALES Y MÉTODOS

Determinación de la toxicidad de los insecticidas organofosforados bajo tres regímenes térmicos

El desarrollo de las pruebas de toxicidad aguda realizadas en este trabajo siguió las recomendaciones propuestas por la US Environmental Protection Agency (^{US EPA, 2002}). Para esto, en peceras de vidrio de 2 L de capacidad se agregó un litro de la solución experimental de cada insecticida organofosforado con cinco diferentes concentraciones (clorpirifos: 0,9; 1,8; 3,6; 7,2 y 14,4 mg/L; diazinón: 1,8; 3,6; 7,2; 14,4 y 28,8 mg/L; y monocrotofos: 131,25; 262,5; 525; 1050 y 2100 mg/L) y un control negativo (agua declorada). El agua utilizada para preparar las soluciones se decloró previamente por aireación. Durante 96 horas se expuso aleatoriamente un total de 25 embriones por especie a cada una de las concentraciones experimentales y el control, más su respectiva réplica (total: 50 embriones por tratamiento). Los embriones se expusieron tal y como se encontraban dentro de su postura en campo, así: los embriones de E. pustulosus dentro de un halo de su nido de espuma, los de R. horribilis dentro de la membrana elongada, tipo cadena, que los recubre, y los de B. xerophylla dentro de su gel hialino sobre el agua. Adicionalmente, estos mismos embriones se sometieron a tres regímenes térmicos constantes (23, 28 y 33 ± 1 °C) ajustados con termostatos graduados mediante baños de agua y monitoreados continuamente con termómetros digitales (HTC-2, ± 1 °C). Estas temperaturas se seleccionaron porque no resultan letales para las especies de estudio y se pueden encontrar frecuentemente en su hábitat (^{Turriago et al., 2015}).

Las soluciones experimentales se renovaron cada 24 horas, pero previo y posterior al recambio se registraron los parámetros fisicoquímicos de pH, oxígeno disuelto y conductividad (pHmetro Hanna Ref. HI 9126, Oxímetro Hanna Ref. HI 9146 y Multiparámetros Consort Ref. C 5020, respectivamente). En la Tabla 1 se muestra la media y la desviación estándar de los parámetros tomados antes y después del recambio para cada insecticida. El montaje experimental se ubicó en un estante metálico iluminado con lámparas de luz blanca (Phillips TLT 20W/54RS) conectadas a un temporizador digital (General Electric PM621), que permitió mantener un fotoperiodo de 12 horas luz - 12 horas oscuridad.

Tabla 1 Media y desviación estándar de los parámetros fisicoquímicos registrados antes y después del recambio de las soluciones en las pruebas de toxicidad de los tres insecticidas organofosforados de estudio. 

Con la mortalidad acumulada a las 96 horas se calculó la concentración letal media (CL₅₀) y sus intervalos de confianza al 95 %, a través del método TSK Trimmed Spearman-Karber (Versión 1.5) (^{Hamilton et al., 1977}), para cada insecticida y régimen térmico. Además, con el fin de comparar el efecto letal entre los tres regímenes térmicos se realizó una regresión logística por insecticida, empleando la prueba de Wald para el contraste de hipótesis debido al tamaño de la muestra y el tipo de datos de supervivencia obtenidos (1= muerto, 0= vivo). Este análisis se realizó en el programa estadístico Statistica (Versión 13.3).

Esta investigación fue avalada por el Comité de Bioética de la Universidad del Tolima (acta 2 del 2017) y contó con el Permiso Marco de Recolección otorgado por la Corporación Autónoma Regional del Tolima, CORTOLIMA, mediante la Resolución 3758 del 16 de Noviembre de 2016.

RESULTADOS

El clorpirifos fue el insecticida organofosforado más tóxico para las tres especies de estudio, con los valores de CL₅₀ notablemente más bajos (rango CL₅₀ para las tres especies a las tres temperaturas: 0,97 - 6,19 mg/L), seguido del diazinón (rango: 6,41 - 16,35 mg/L), y del monocrotofos (rango: 313,27 - 666,37 mg/L) (Tabla 2).

Tabla 2 Valores de CL50 e intervalos de confianza al 95 % (mg/L) en los embriones de tres especies de anuros expuestos al clorpirifos, diazinón y monocrotofos bajo tres regímenes térmicos. 

La mortalidad generada por los tres insecticidas varió de manera positiva y significativa en función de la temperatura (clorpirifos: Wald X²= 214,183, p= 0,000; diazinón: Wald X²= 24,297, p= 0,000; monocrotofos: Wald X²= 13,260, p= 0,001), y de la concentración de exposición (clorpirifos: Wald X²= 2021,069, p= 0,000; diazinón: Wald X²= 2021,193, p= 0,000; monocrotofos: Wald X²= 2453,208, p= 0,000), pero no entre las especies (clorpirifos: Wald X²= 4,827, p= 0,089; diazinón: Wald X²= 3,503, p= 0,173), con excepción del monocrotofos (Wald X²= 34,425, p= 0,000), ante el cual B. xerophylla fue más sensible (Tabla 2 y Fig. 1). También se encontró una interacción significativa entre la temperatura y la concentración (clorpirifos: Wald X²= 63,018, p= 0,000; diazinón: Wald X²= 77,449, p= 0,000; monocrotofos: Wald X²= 26,341, p= 0,000), en la cual la temperatura y las concentraciones más altas generaron las mortalidades mayores y los menores valores CL₅₀ (Tabla 2).

Figura 1 Comparación de la Concentración Letal Media (CL₅₀) de los embriones de anuros expuestos al clorpirifos, diazinón y monocrotofos bajo tres regímenes térmicos. Las barras de error representan los intervalos de confianza al 95 %. 

DISCUSIÓN

Los efectos tóxicos de los contaminantes químicos presentes en el medio acuático pueden ser influenciados por factores fisicoquímicos como la temperatura (^{Ferrando et al., 1987}; ^{Lydy et al., 1999}; ^{Osterauer y Kohler, 2008}). En este sentido, la toxicidad puede disminuir al aumentar la temperatura, como en el caso de algunos organoclorados y piretroides (^{Ferrando et al., 1987}; ^{Harwood et al., 2009}; ^{Weston et al., 2009}; ^{Alza et al., 2016}), o puede aumentar al incrementarse la temperatura, como en los organofosforados y carbamatos (^{Lydy et al., 1990}; ¹⁹⁹⁹; ^{Howe et al., 1994}; ^{Boone y Bridges, 1999}; ^{Osterauer y Kohler, 2008}; ^{Harwood et al., 2009}; ^{Patra et al., 2015}).

La relación directa entre los efectos generados por los contaminantes químicos y la temperatura coincide con los resultados del presente estudio, especialmente para el clorpirifos y el diazinón, puesto que los promedios de los valores CL₅₀ se incrementaron cuatro y 1,6 veces, respectivamente, por un aumento de 10 °C. En el caso del clorpirifos, estudios como el de ^{Lydy et al. (1999)} y ^{Harwood et al. (2009)} muestran la misma tendencia, aunque la toxicidad del insecticida en las especies Chironomus tentans y C. dilutus (Clase: Insecta) se incrementó sólo 1,7 veces frente a un aumento de 10 °C. También, ^{Patra et al. (2015)} encontraron que el clorpirifos genera mayor letalidad en los peces Bidyanus bidyanus (Mitchell, 1838) y Onchorynchus mykiss (Walbaum, 1792) a las temperaturas más altas de exposición, con valores de Concentración Media Efectiva (EC₅₀) significativamente más altos a 15 °C que a 20 y 35 °C. Además, ellos establecieron que las concentraciones subletales de clorpirifos generan la reducción de la tolerancia térmica de los peces en 2,5 y 5,8 °C. Para el Diazinón se encontró sólo un estudio, en el que a concentraciones de 2000 y 3000 Mg/L la mortalidad embrionaria del pez cebra (Danio rerio) aumentó cerca al 100 % a una temperatura de 33,5 °C, en comparación con la registrada a 28 y 30 °C (^{Osterauer y Kohler, 2008}). Finalmente, para el insecticida monocrotofos no se tiene conocimiento de estudios que relacionen su toxicidad con la temperatura.

Los valores CL₅₀ para el clorpirifos y el diazinón se incrementaron hasta cuatro veces por una diferencia en la temperatura de diez grados centígrados, lo cual concuerda con el trabajo de ^{Mayer y Ellersiek (1988)}, quienes mencionan que muchos químicos inorgánicos u orgánicos (^{Lydy et al., 1999}) presentan un coeficiente de temperatura Q₁₀ entre dos y cuatro, lo que indica un incremento en la toxicidad entre dos a cuatro veces por un cambio de 10 °C en la temperatura del agua. La mayor toxicidad de los insecticidas evaluados (especialmente del clorpirifos y diazinón) a la temperatura experimental más alta se podría atribuir al aumento de la tasa metabólica, de absorción y posiblemente de biotransformación de los insecticidas por parte de los organismos (^{Lydy et al., 1999}; ^{Harwood et al., 2009}), lo cual puede aumentar la permeabilidad cutánea a los insecticidas (^{Restrepo y Guerrero, 1979}; Harwood et al., 2009) e incrementar el riesgo de los organismos expuestos. También, puede acelerar la degradación de los contaminantes químicos (^{Weston et al., 2009}), de manera que sus productos pueden llegar a ser más tóxicos que sus formas iniciales, como en el caso del clorpirifos y del diazinón (^{Restrepo y Guerrero, 1979}; ^{Snawder y Chambers, 1989}; ^{Sparling y Fellers, 2007}). Esto explicaría el notable aumento de la mortalidad encontrado para estos dos insecticidas a 33 °C. No obstante, la degradación del monocrotofos no genera compuestos de alta toxicidad (^{Guth, 1994}), lo que también explicaría porque no fue tan tóxico como el clorpirifos y diazinón.

CONCLUSIONES

El presente estudio encontró que el clorpirifos fue el insecticida más tóxico para los embriones de las tres especies de anuros evaluadas, seguido del diazinón y el monocrotofos. También, que la toxicidad de los insecticidas organofosforados es afectada por la temperatura, con un efecto más evidente en el clorpirifos, ya que un aumento de 10 °C, que ambientalmente puede registrarse en un mismo día, hace que la mortalidad en los embriones de los anuros estudiados se incremente hasta cuatro veces. Teniendo en cuenta que la temperatura es una variable que afecta la toxicidad de estos compuestos, se recomienda tenerla en cuenta cuando se estudien dichas sustancias, ya sea para mantener un ambiente térmico controlado durante las pruebas de toxicidad en laboratorio o para hacer evaluaciones más realistas en condiciones de campo.