Colección de formas infectivas de actinobacterias

Se seleccionaron larvas de A. aegypti infectadas por estructuras análogas a micelios fúngicos. Las larvas infectadas se mantuvieron aisladas en un bioterio de corredor único, anexo al Laboratorio de Microscopía de la Universidad Nacional Agraria de la Selva, Tingo María, Perú. Se distinguieron dos tipos de infección de acuerdo con la distribución de los elementos infectivos en el cuerpo de la larva y al estadio al cual infectaba. En base a estos criterios, las larvas se separaron en recipientes estériles para el traslado al laboratorio.

Aislamiento y cultivo

Los procedimientos de aislamiento, cultivo y caracterización microbiana se efectuaron en el Laboratorio de Calidad Ambiental de la Facultad de Ciencias del Ambiente de la Universidad Nacional Santiago Antúnez de Mayolo, Huaraz, Perú. La extracción de las estructuras por escisión del tejido cuticular larvario se realizó en una cabina de flujo laminar horizontal, etiquetándolas por PsAITA y CoA2CA. Luego de lavar por tres minutos con hipoclorito de sodio al 1 % y agua salina isotónica estéril, se procedió a agitación y homogenización en sistema vórtex en modo continuo por cinco minutos. Posterior al calentamiento a 70 °C por 15 minutos, se tomó 1 mL del homogenizado y se inocularon alícuotas de 100 μL a partir de diluciones seriadas al décimo hasta 10^-4. Por diseminación, se añadió cada alícuota en placas Petri con Agar Dextrosa Sabouraud Modificado Difco™ con cloranfenicol, medio de cultivo específico para hongos y Agar Nutritivo Merck para el crecimiento no selectivo de bacterias (^{Whitman et al., 2012}). Se realizó luego una resiembra en Agar Almidón Caseína (AAC) suplementado con ácido nalidíxico (10 μg. mL^-1), nistatina (50 μg. mL^-1) y cicloheximida (10 g. mL^-1) como medio no selectivo de actinobacterias (^{Küster y Williams, 1964}; ^{Ay et al., 2017}; ^{Parada et al., 2017}). Los inóculos incubados a 26 °C entre 15 a 20 días respondieron adecuadamente a los medios. La selección de dos morfotipos entre cuatro se basó en la visualización de cepas con mayores respuestas competitivas por asimilación de nutrientes, rápida aparición del micelio y mayor cobertura superficial de crecimiento en el cultivo (^{Hibbing et al., 2010}; ^{Lloyd y Allen, 2015}). Los cultivos se prepararon según las instrucciones del fabricante: autoclavado por diez minutos a una atmósfera de presión a 121 °C ajustado a pH 7,0 ± 0,2 para agar Sabouraud Modificado Difco ™ y autoclavado a 121°C por 20 minutos y pH 7,3 ± 0,2 para Agar Nutritivo Merck.

Caracterización de colonias y biopelículas

La determinación taxonómica de bacterias coloniales y en biopelículas se llevó a cabo por fotomicrografías, reacciones por tinción Gram y Ziehl-Neelsen, presencia o ausencia de micelio, tipología de elementos reproductivos e hifas, color de la colonia, forma del borde, aspecto y presencia de pigmentos difusibles (^{Whitman et al., 2012}; ^{León et al., 2016}). Además, la biopelícula se caracterizó por su morfología, dimensiones, disposición y extensión corporal superficial en larvas y pupas.

Análisis de progresión de biopelículas

La medicion del crecimiento de biopelículas se realizó por captura de individuos visiblemente infectados por el micelio. El montaje en fresco de 30 individuos infectados limitó el uso de cubreobjetos para evitar el daño de la estructura micelar, previo al secuenciado de imágenes por microscopía de luz (Obert et al., 1990; ^{Wilson et al., 2017}). El secuenciado de imágenes permitió cuantificar diariamente el crecimiento por extensión superficial epicuticular de las biopelículas en cada estadio larval. Se realizó una captura fotográfica por reemplazo de individuos infectados lo que permitió ampliar la representatividad muestral (n=30) y promediar el crecimiento de la biopelícula por momento de evaluación (24, 48, 72 y 96 horas). La irregular distribución en el sustrato biótico y dispareja ganancia en masa de la biopelícula PsA1TA (patrón de agregado fractal), dificultó situar un punto preciso de continuidad de la medicion del crecimiento desde la interfase biopelícula-epicutícula. El crecimiento de la biopelícula, por lo tanto, se estimó indirectamente por cobertura superficial del órgano afectado expresado en porcentaje. En contraste, el crecimiento radialmente fijo de la biopelícula de CoA2CA en la estructura consistió en la medición desde un punto definido y central de la superficie de la estructura infectada, la cual se expresó en micras y complementariamente en porcentaje. El incremento diario radial de la biopelicula permitió continuar acertadamente la medición del crecimiento en los tiempos establecidos. El crecimiento de ambas biopelículas se visualizó con capturas fotográficas de un microscopio binocular BX50 Olympus®, Japan, equipado con cámara digital SC30 Olympus (3,3 mp), además del uso del método de calibración espacial de fotomicrografías a escala conocida del software de dominio público ImageJ 1.52a (NIH, USA) (^{Schneider et al., 2012}). Se utilizó, también, un estereomicroscopio Olympus® SZX7.

Crianza de A. aegypti

El sistema de crianza larval procedió de un lote generacional F5 de adultos. La alimentación larvaria consistió en un balance nutricional en polvo para peces ornamentales, previamente esterilizado en estufa a 160 °C por dos horas. La crianza aséptica del vector en todas sus fases para el establecimiento del bioensayo se llevó a cabo conforme a protocolos estándar (^{Gerberg et al., 1994}; ^{Imam et al., 2014}) en el Laboratorio de Microscopía de la Universidad Nacional Agraria de la Selva entre los meses de enero a abril de 2018.

Bioensayos larvicidas

Las unidades experimentales se constituyeron por vasos con solución de prueba e individuos larvales del I al IV estadio y pupas. Cada unidad integrada por 20 individuos se sometió por triplicado al estímulo microbiano, más el respectivo grupo control con agua potable declorinada. Se tomó como concentración única 3x10⁸ UFC/mL de suspensión de actinobacterias en 199 mL de agua (200 mL de solución de prueba). La mortalidad se registró a intervalos de 24 horas hasta las 96 horas. Todos los grupos se mantuvieron bajo condiciones controladas de temperatura (26,0 ± 0,5 °C) y humedad relativa (75 a 80 %). La nula reacción ante la suave punción con estilete en el tórax de larvas y cefalotórax en pupas indicó la mortalidad de los individuos, la que fue corregida por la fórmula de Abbott cuando en el grupo control se situó entre 5 a 10 % (Abbott, 1925; ^{World Health Organization, 2005}):

Efectos subletales y saprotrofía

Los efectos subletales expresados en porcentaje se extendieron por tres días desde el término del bioensayo larvicida, en el que se incluían descripciones morfológicas de signos atípicos de locomoción, malformaciones en la preemergencia y emergencia de los individuos (WHO, 2005; ^{Amarasekare y Shearer, 2013}). La extensión de la respuesta infectiva posmortem de larvas, permitió determinar preliminarmente cual de los morfotipos es potencial saprófito degradador de quitina.

Análisis estadístico

Se empleó el ANOVA de un factor con medidas repetidas con diferencias significativas (p < 0,05) y no significativas (p > 0,05) entre la mortalidad larval y tiempos de exposición a las 24, 48, 72 y 96 horas (^{Hothorn, 2014}). Los supuestos del ANOVA se comprobaron al verificar la normalidad con la prueba de Shapiro-Wilks (menor a 50 sujetos por unidad experimental) y esfericidad al emplear la prueba de Mauchly (p<0,05 existen diferencias estadísticamente significativas en la igualdad de varianzas y p> 0,05 no existen diferencias estadísticamente significativas en la igualdad de varianzas). Las comparaciones post-hoc se estimaron con la prueba Fisher LSD (p=0,05). Los Tiempos Letales medios±Desviación Estándar (TL₅₀±DE) se calcularon por análisis Probit. Además, se estableció la prueba de bondad de ajuste Chi-cuadrado (X²) y valor de probabilidad p < 0,05, con diferencias significativas en el efecto infectivo de las cepas, o p > 0,05 con ninguna diferencia significativa en dicha acción, bajo un nivel de confianza del 95 %. Así también, se determinó el Coeficiente de Determinación (R²) como ajuste del modelo entre variables. Todo el análisis estadístico se procesó con el software libre R ver. 3.5.2 for Windows (R Project for Statistical Computing) (^{Crawley, 2015}).

Morfología de colonias y biopelículas

El estudio abordó la identificación de patógenos a nivel de familia, caracterización de la morfología colonial y biopelículas de actinobacterias. Se seleccionaron dos morfotipos entre cuatro, en razón a la viabilidad de crecimiento en placas y rápido desarrollo micelial.

Los morfotipos emergieron dentro de las 36 horas, mientras los restantes superaron las 72 horas. Luego de diez días de desarrollo de los cultivos, se definieron dos morfotipos muy consistentes. El primero, rotulado PsA1TA, son formas Gram (+) no ácido alcohol resistente, con micelio aéreo y del sustrato constituyéndose a menudo por cadenas bacilares [Diam.: 0,9-1,2 μm ( = 1,0 ±2,71), n = 50]. El micelio aéreo de color cremoso y del sustrato amarillo-claro, no produce pigmento difusible, esporangio o pseudoesporangio. En ocasiones los segmentos de las hifas del sustrato con ligero abultamiento, pero en conjunto, forman cadenas cortas con angulaciones en zig-zag (Fig. 1a). El micelio aéreo relativamente ramificado con extremos terminales en "Y", crece fragmentándose en formas abastonadas y cocoides no flageladas, forma brotes laterales y apicales (Fig. 1b-c) para luego alargarse y constituir nuevos segmentos. La colonia muestra elevación convexa, margen de entero a lobulado, borde liso-redondeado con aspecto pulverulento cerebriforme [(Diam.: 3,2-6,1 mm ( =4,8±1,1), n = 50] (Fig. 1d). Todas las características revelaron corresponder a representante Pseudonocardiaceae. Bajo estereofotografías, las biopelículas PsA1TA son blanquecinas, verrugosas, esferoidales [Diam.: 182,9-215,1 μm (X= 201,6±2,3), n = 25)] y elipsoidales [Diam. 479,3-522,8 μm ( =504,1±5,5), n = 25) (Fig. 1e). La biopelicula destaca por su ordenamiento microlobular surcado (Fig. 1f, punta de flechas) de superficie relativamente envainada y lisa (Fig. 1g), en cuyo neblinoso lumen crecen dos tipos bacterianos no flagelados: bacilar [Long. 0,6-0,8 μm (X=0,7±0,9); diam. 0,3-0,4 μm ( =0,37±1), n = 50] y cocoide [Diam.: 0,40,6 μm (X = 0,5), n = 50] (flecha negra y amarilla, Fig. 1h) densamente distribuidos en la matriz ininterrumpida.

Figura 1 Caracterización de colonias bacterianas y biopelículas. Morfotipo PsA1TA (Fig. a-h): Las cadenas bacterianas forman angulaciones en zig-zag (a) y la organización de las hifas aéreas en cadenas bacilares crecen con abultamientos apicales o laterales (b y c) (flechas). En agar, la bacteria desarrolla a colonias pulverulentas de color blanco cremoso (d), mientras que la biopelícula infectiva muestra forma verrucoide (e). La ampliación secuencial de la biopelícula muestra superficies con bordes lobulados (f, punta de flechas) y ligeros halos de EPS en el lumen (g, punta de flechas), en el que albergan formas bacterianas bacilares y cocoides (h, flechas negra y amarilla). Morfotipo CoA2CA (Fig. i-t): Las células en cultivo se disponen en "V", "Y" y en paralelo (i, flechas). La colonia de superficie pulida exhibe un color blanco-rosáceo (j), cuya biopelícula emite un patrón morfológico algodonoso (k). La imagen en negativo (izquierda) con la imagen coloreada de azul (derecha) de la figura compuesta (l) contrasta la alta densidad bacteriana del estrato apical de las hifas superficiales de la biopelícula radial. A mayor escala, las hifas digitiformes proyectan conspicuos elementos filiforme similares a espinas (pe) (m) que rodean al conjunto bacteriano bacilar unido polo a polo por un tenue mucilago entre dos o tres integrantes bacterianos (n, flechas). CoA2CA induce la formación de bioaglomerados suspendidos (ñ, círculo rojo), adosados al sustrato de borosilicato (o, interlineado amarillo) e infectando el sustrato biótico del vector (p, flechas verdes). El morfotipo se organiza jerárquicamente en micelios dispersos (q), grumos (r) a gránulos esféricos (s) o arrosetados (t). La ampliación de las hifas radiales (l), refleja la similitud morfológica entre biopelículas infectivas sésiles (k) y gránulos esféricos flotantes (s), superficies resaltadas por subrecuadros rojos. zp: zona pilosa, nu: núcleo. 

El segundo morfotipo asignado CoA2CA, son bacilos Gram (+) [Long.: 2,1-4,9 um (XX =3,6 ±0,31); diam.: 0,61,4 μm ( = 1,2 ±0,12), n = 50] rectos a ligeramente curvos y evidente pleomorfismo caracterizados por ser células individuales, en pares, paralelas, adjuntas en pequeños agregados y conectadas en el extremo polar por una delgada franja transparente que divergen en formas "V" e "Y" (Fig. 1i, flechas rojas). El morfotipo no es ácido alcohol resistente, no forma micelios, esporas, flagelos y gránulos policromáticos. La colonia es blanco-rosácea, redondeada, elevación convexa y borde entero, liso no pulverulento [Diam.: 1,8-5,5 mm ( = 3,9±2,7), n = 50] (Fig. 1j) y ausente de pigmento difusible Las características pertenecerían a representante Corynebacteriaceae. Al estereoscopio la biopelícula CoA2CA es blanca, esferoidal y apariencia algodonosa [diam. 0,91,5 mm ( = 1,27±0,4), n = 25, Fig. 1k). Hifas entrecruzadas de diversos tamaños conforman el interior y exterior de la biopelícula. Desde un plano longitudinal, el estrato apical de las hifas superficiales exhibió densos agregados bacterianos, contrariamente al estrato inferior, con menor densidad y mayor interseparación celular (Fig. 1l, imagen izquierda). El interior de la biopelícula se estructuró de compactas y entretejidas capas de hifas, contrariamente a las laxas proyecciones superficiales filamentosas de las hifas (Fig. 1l, imagen derecha con tinción azul), ornamentadas de procesos espinosos filiformes (Fig. 1m). Al igual que su forma colonial, las bacterias no forman flagelos, son abastonadas [Long.: 2,5-4,4 Mm ( = 3,2 ±0,54); diam.: 0,81,2 Mm ( = 1,0±0,1), n = 50], con disposición individual, par o triple y ligeros quiebres angulares en "V" e "Y", polarmente adheridas por un mucílago semitransparente (Fig. 1n, flechas), que en conjunto se insertan en la matriz homogénea, traslúcida y no septada de las hifas envainadas.

El morfotipo exhibió agregados microbianos flotantes y sésiles. Las formas flotantes se dispersan por la columna de agua (Fig. 1ñ, círculo rojo), mientras las sésiles, se adhieren a sustratos bióticos de larvas (Fig. 1p, flechas verdes) y abióticos de vidrio de borosilicato (Fig. 1o, interlineado amarillo). Las formas dispersivas adquieren complejos entramados de hifas y crecen similarmente al modelo no coagulativo de gránulos (Fig. 1q-1t). Las hifas incrementan en densidad al formar micelios filamentosos (Fig. 1q) y aglomerados (Fig. 1r), previos a la síntesis de gránulos esféricos (Fig. 1s) y arrosetados (Fig. 1t) de alta organización. La disposición central (o nuclear, nu) de los gránulos arrosetados es de apariencia polinuclear con hifas sin células, en tanto la periférica, similar a la zona pilosa (zp), corresponde a la superficie radial de alta densidad celular. Los gránulos esféricos flotantes (Fig. 1s) y biopelículas infectivas (Fig. 1k) denotan similitud estructural superficial al ser ampliadas por la Fig. 1l.

Dinámica infectiva de biopelículas y efecto posmortem

En esta etapa se determinó la dinámica de crecimiento infectivo de biopelículas y los efectos físicos inmediatos o mediatos de control en inmaduros. A diferencia de los estadios larvales I (L-I) y III (L-III), las etapas II (L-II) y IV (L-IV) se seleccionaron como modelos representativos de análisis por la mayor sensibilidad infectiva y marcados cambios morfológicos. Los exámenes microscópicos revelaron que las bacterias evolucionan a biopelículas según el tipo de revestimiento cuticular del órgano y estadio larval. La ausencia de conductos tróficos de soporte de los patógenos facilitó el directo anclaje epicuticular de microcolonias en etapas tempranas de la infección para impulsar la extensión superficial de biopelículas sobre el sustrato quitínico membranoso o esclereotizado del vector. En L-II, PsA1TA induce la acción infectiva de biopelículas en tórax y abdomen (Fig. 2a-2e) al experimentar las etapas de desarrollo (Fig. 2b) que incluyeron: adherencia de individuos microbianos al sustrato (1), formación de microcolonias (2), elongación (3) y maduración (4). En general, la colonización inicia al conformarse microagregados exactamente en la placa basal setal del abdomen que es el punto de emergencia de las cerdas laterales (Fig. 2c). Estados avanzados de la infección, las biopelículas originadas en la papila anal compenetran el segmento anal y cerdas caudales congregándose una integrada biopelícula biestratificada (Fig. 2d). La evolutiva formación de dos conspicuas biopelículas sobrepuestas, una esferoidal proximal (bpr) a la epicutícula y otras elipsoidal distal (bds) a la superficie cuticular, determinaron la grosera extensión lateral del tórax y abdomen de la larva (Fig. 2e). La expresión dual de biopelículas fue indetectable en la cutícula de pupas.

Figura 2 Crecimiento infectivo de biopelículas en A. aegypti. Panel PsA1TA/larvas II (Fig. a-e). Las flechas apuntan el afloramiento de biopelículas en segmentos torácicos (st) (a) y proliferan conforme la secuencia del ciclo de colonización: 1, adhesión monoestratificada de células en la epicutícula (ep); 2, microcolonias; 3, elongación; 4, maduración (b). Numerosas microcolonias emanan desde las placas basales de setas abdominales (c, fechas negras) hasta alcanzar prominentes biopelículas en el segmento anal (sa), papila anal (pa) y cerdas caudales (cc) (d). Estados avanzados de colonización del morfotipo incluye la formación de bicapa de biopelículas proximal (bpr), distal (bds) y las recientemente emergentes (be) a lo largo del abdomen (e). Panel CoA2CA/larvas IV (Fig. f-j). El morfotipo compenetra radialmente la zona cefálo-caudal y superficialmente el tórax y abdomen del vector (f), impulsado por el ciclo de crecimiento en cuatro etapas (1 a 4), tan igual como PsA1TA (g). Aquí, la biopelícula se acompaña de halos de EPS similarmente a como infecta las mandíbulas (man) y maxilares (max) (h), sifón respiratorio (sr) (i) y silla anal (j) donde se señala el punto de origen de la biopelícula (flecha negra). El panel entre las figuras k a ñ muestra la infectividad de CoA2CA en pupas, mientras que las figuras o ar, los efectos subletales en adultos. La biopelícula cubre homogéneamente la superficie de pupas al observarlas en vista dorsal (VD) y ventral (VV) cuando se compara con el control (C) (k). La extracción de la exuvia (l) se amplía para indicar que en el cefalotórax el clípeo alberga agregados emergentes de biopeliculas (be) (m), capaz de producir agrietamiento epicuticular (aep) (n) e invasividad entre la inserción de la seta (se) con la nervadura (ne) de la paleta natatoria, así como en zonas circundantes al IX segmento abdominal (ñ). La respuesta subletal produce individuos farados que emergen erróneamente al adherirse las alas (o), abdomen (p) y región cefálica (q) al interior de la exuvia y, cuando emergen totalmente, dificultan su equilibrio al formar tarsos curvos (r). La figura s, evidencia los restos larvarios profusamente cubiertos con biopelículas. tt: troncos traqueales, ct: cerdas torácicas, ca: cerdas abdominales. 

CoA2CA envuelve con densos micelios radiales las regiones altamente esclerotizadas cefálica y anal en L-IV (Fig. 2f). No obstante, a escala microscópica, los elementos conjuntos de infección lo constituyen bacterias simples, microcolonias y biopelículas maduras acompañadas por halos blanquecinos de sustancias poliméricas extracelulares (EPSs) (Fig. 2g, 1-4), tan igual como en PsA1TA. La disposición radial reviste varios artejos esclerotizados de la cabeza que incluyen penachos bucales, mandíbulas, maxilas (Fig. 2h) y partes caudales como sifón respiratorio (Fig. 2i) y silla anal (2j), a diferencia del tórax y abdomen cuyo crecimiento es ligeramente delgado y superficial en sincronía con el aspecto vermiforme de la larva. Como mecanismo de reacción, ambos estadios expresaron arrítmicos y contráctiles movimientos pulsátiles que llevaron a las larvas a golpear la región cefálica contra la anal (material suplementario s1 y s2). En contraste al modo infectivo en larvas, la vista dorsal (VD) y ventral (VV) en pupas no evidenciaron crecimiento radial de COA2CA, sino tenue y homogeneamente superficial (Fig. 2k) comparado al control. Según el análisis morfológico de la exuvia (Fig. 2l), el crecimiento de microcolonias desde el clípeo (Fig. 2m) hasta rodear el cefalotórax reveló formar fisuraciones epicuticulares (Fig. 2n) acopladas a EPSs. La infección también remontó en la inserción de la nervadura con la seta de la paleta natatoria, IX segmento abdominal (Fig. 2ñ) con extensión a todo el cuerpo.

El efecto subletal de CoA2CA indujo en individuos no sensibles a la acción larvicida desarrollar a adultos farados, término empleado a adultos casi maduros, formados y ocultos en la exuvia de la pupa (Frantsevich et al., 2017). En ellos, las limitaciones físicas incluyeron la interrupción del despliegue de las alas e impedimento de salida del abdomen o tagma cefálico desde la exuvia (Fig. 2o-2q) (material suplementario s3). En algunos casos la completa emergencia a adultos se expresaba por el despliegue de tarsos curvos en todas las extremidades (Fig. 2r, flechas rojas). Además, el morfotipo prolongó su crecimiento a la etapa de degradación de los restos de larvas muertas mediante el recubrimiento (embalming) total del cadáver larvario similar a una "momificación micelar" (Fig. 2s). PsA1TA no produjo acción saprofítica.

Crecimiento de biopelículas dependiente de sustrato

El desarrollo de biopelículas se planteó en el supuesto de que la adherencia diferencial a la superficie del vector dependa del tipo de revestimiento epicuticular y promueva la detención del crecimiento larvario. Nuestros resultados determinaron que ambas biopelículas afectaron selectivamente el exoesqueleto rígido y blando con preponderancia a estadios específicos del vector. Los signos de degradación se evidenciaron no solo en artejos aislados (partes bucales, antena, cerdas y penachos), sino a extensiones de órganos (ojos compuestos, silla y papilas anales, sifón respiratorio) y regiones cefálica, torácica, abdominal y caudal. Al respecto, la Tabla 1 compara la evolución de biopelículas PsAITA en zonas con revestimientos no esclerotizados de larvas, con CoA2CA en estructuras no esclerotizadas de larvas y pupas.

Tabla 1 Evolución del crecimiento de biopelículas en estadios inmaduros de A. aegypti. 

A: Ausencia de biopelícula, NM: No medible por emergencia a adulto, NC: No calculado, AIT: Amplitud infectiva total en 96 horas (μm)

PsAITA coloniza el abdomen de L-I y L-II (7 % y 16 %) desde las 24 horas. A excepción de microcolonias observadas en el abdomen, la extensión de biopelículas continuó marcadamente en tórax y papilas anales desde las 48 horas. En L-I, las biopelículas se acentúan prolíficamente (91-98 %) e impactan íntegramente en L-II (98-100 %) a las 96 horas. Por el contrario, L-III y L-IV no evidencian invasividad a las 24 horas, aunque ligeros indicios en el tórax (3 %), abdomen (2 %) y papilas anales (17 %) con formaciones aisladas de biopelículas que no sobrepasan el 24 %, aparecen entre 48 a 96 horas. L-IV es la etapa de menor proliferación del patógeno y mínimamente alcanzan el 11 % del tórax y 5 % del abdomen. La intensa multiplicación de estratos de biopelículas PsA1TA, llegaron a cuadriplicar el ancho del tórax (450 μm - 486 μm, n =10), abdomen (275 μm - 318 um n =10) y dimensión de papilas anales (22 um x 140 um n =10) de L-II. La amplitud total del ancho del tórax y abdomen más las biopelículas abarcó entre 1010 μm a 1036 μm de envergadura total infectiva, mientras que la integridad dimensional de la biopelícula que engloba las papilas anales comprendió entre 380 μm a 550 μm a las 96 horas.

CoA2CA es casi ausente en L-I, L-II y L-III, pero se forma en la región cefálica (cabeza y artejos) y caudal (sifón respiratorio y silla anal) de L-IV a partir de las 24 horas. La biopelícula crece en la cabeza 23 % (270 μm), sifón respiratorio 28 % (250 μm) y silla anal 26 % (228 μm). El crecimiento radial de la biopelícula es proporcional a la estructura que coloniza, por lo que se adjuntan para fines comparativos las dimensiones del órgano afectado. Así, en el sustrato esclerotizado de la cabeza de L-IV (895-929 μm de largo y 965-992 μm de ancho, n = 10), la biopelícula incrementa entre 23 % a 100 % desde 24 horas (270 μm) a 96 horas (967 μm), lo cual suma una envergadura diametral total de 1820 a 2030 μm (n = 10) equivalente al doble de la región cefálica. En el sifón respiratorio (867-923 μm de largo y 359-375 μm de ancho, n = 10) y silla anal (292-305 μm de largo y 247-263 μm de ancho, n = 10), la biopelícula alcanza a las 24 horas entre el 28 % (250 μm) y 26 % (228 μm), respectivamente, y aumenta a las 96 horas de tres a cuatro veces (974 μm en sifón y 952 μm en silla anal) el tamaño de los órganos al totalizar un diámetro infectivo entre 16501860 μm (n = 10). El incremento diario de la biopelicula se estimó entre 220 a 260 μm.dia^-1 (n = 20), es decir, se duplica cada 24 horas con relación al órgano afectado.

Es de resaltar que la biopelícula también invade estructuras esclerotizadas de L-I y L-II, aunque es ausente dentro de las 48 horas. En L-II, los rangos de crecimiento mínimamente abarcaron entre 75 μm a 139 μm (6 % a 18 %) en la cabeza, en tanto fue ligeramente superior en estructuras de la región anal entre 59 μm a 146 μm (4 % a 21%), hasta el término del bioensayo (96 horas) y sin presentar profundas deformaciones corporales. El corto tiempo de duración de la conversión de pupa a adulto, medido entre 51 a 54 horas, solo permitió observar el crecimiento de diminutas microcolonias entre 20 μm a 48 μm (26 % del clípeo cefalotorácico, 39 % del abdomen y 15 % de paleta natatoria) hasta las 48 horas, procediendo luego a la emergencia a adultos.

Mortalidad larvicida y efecto subletal

El planteamiento por biocontrol de actinobacterias no Streptomyces formadoras de biopelículas, pretendió ser validado por la acción larvicida y efecto subletal en A. aegypti. En ese sentido, los hallazgos larvicidas reflejan dos reacciones específicas al vector: La respuesta orientada a fases tempranas de L-I y L-II ejercida por PsAITA y aquella susceptible a fases media y tardía de L-III y L-IV producida por CoA2CA, lo que condujo al análisis independiente de la mortalidad por morfotipo. En el bioensayo, la mortalidad no excedió el 3 % respecto al grupo control por lo que evitó corregirse con la fórmula de Abbott. El efecto larvicida por PsAITA empezó a las 24 horas con 15 % en L-IV, no obstante, a las 72 horas se estabiliza a 23 %. En contraste, L-II demostró tener mayor resistencia al estímulo microbiano con 5 % de mortalidad, pero despunta significativamente (p < 0,05) a 58 % frente a los demás estadios, los cuales no superaron el 40 % hasta las 96 horas (Fig. 3a). La acción deformadora de la biopelícula sobre L-II es muy evidente a las 72 horas con 30 % de mortalidad y coincide con los visibles signos de continua y agresiva tumefacción que distorsionan el tórax y abdomen al alcanzar cerca del 60 % a las 96 horas (panel fotográfico Larvas II, Fig. 3a). De otro lado, L-I y L-II mostraron ser menos sensibles a CoA2CA con 10 % y 5 % de mortalidad a las 24 horas, respectivamente, y sin mostrar diferencias significativas (p > 0,05) con relación a L-III y L-IV (15 % y 25 %). Desde ese momento, el estímulo microbiano confiere respuestas mortales relativamente escalonadas hasta las 72 horas, momento en que L-I y L-II muestran mortalidad significativamente diferente e inferior (45 % a 48 %, p < 0,05), respecto a L-III y L-IV (60 % a 63 %, p < 0,05). A las 96 horas, y en contra de lo morfológicamente esperado, las biopelículas no revelaron crecer en la región cefálica y caudal de L-I y L-II, por lo que, a pesar de carecerlas, la mortalidad se situó entre 59 %y55 %, sin mostrar diferencias significativas (p > 0,05). Sin embargo, la evidencia radial es clara en L-III y L-IV, que reaccionan negativamente al severo desarrollo de la biopelícula y, al igual que el morfotipo anterior, demostraría directa correspondencia con la progresiva mortalidad larval. Es decir que mientras los porcentajes de biocontrol se incrementan continuamente entre las 24 y 96 horas (10 % a 70 %, L-III y 15 % a 85 %, L-IV), dicho efecto podría correlacionarse positivamente con el paulatino desarrollo de las biopelículas (panel fotográfico Larvas IV, Fig. 3b).

Los individuos sobrevivientes a la acción larvicida son impedidos de emerger o emergen defectuosamente a adultos lo que evidenció respuestas subletales. El mecanismo de biocontrol sucede al adherirse determinadas regiones del cuerpo adulto al interior de la exuvia. Es decir que del 100 % de pupas sobrevivientes, el 65 % de individuos incluyó farados muertos por emergencia incompleta. De este total, 42 % mostró defecto en el despliegue total del ala derecha o izquierda, 33 % de separación errática de la región abdominal y 25 % por defecto de salida por adherencia de la región cefálica. Asimismo, el 32,2 % de individuos que emergen a adultos alados correspondió a aquellos estructuralmente íntegros y voladores, mientras que el 2,8 % fueron alados, pero morfológicamente limitados a formar tarsos curvos que impidieron el equilibrio corporal y desencadenó en muerte (Fig. 3c-3d).

Figura 3 Comparación de la mortalidad larvicida y respuesta subletal efectuada por actinobacterias. Los gráficos en barras representan el porcentaje de mortalidad larvicida ejercida por PsA1TA (a) y CoA2CA (b) con fotomicrografías adjuntas que reflejan los cambios morfológicos en larvas II y IV hasta las 96 horas. Los porcentajes de mortalidad de individuos sobrevivientes al efecto larvicida son proclives a formar imagos con tarsos curvos, sobrevivientes voladores no deformes y farados muertos (c). Estos últimos, son agrupados por el tipo de anormalidad que impide su emergencia (d). En los gráficos a y b, las barras verticales indican el promedio y límites de confianza (X±LC, n= 60 individuos por grupo) al 95 %. Letras diferentes sobre las columnas representan diferencias significativas (p < 0,05) de la acción del patógeno por estadio larval, según la prueba de comparaciones múltiples de Fisher LSD. Barras de escala del panel fotográfico de larvas II: 100 μm y de larvas IV: 1 mm. cb: cabeza; pa: papila anal. 

Virulencia

La virulencia asociada a actinobacterias tuvo como propósito inocular una cantidad conocida de patógenos y cuantificar el tiempo medio de efecto adverso al vector. De esta forma, demostramos que todas las etapas larvarias reaccionan a los morfotipos a diferentes niveles de tiempo. No obstante, priorizamos la interpretación de la virulencia a L-II y L-IV, por ser los estadios de referencia de mayor invasividad por biopelículas y susceptibilidad larvicida. La aplicación de 3x10⁸ UFC/mL de inóculo bacteriano produjo diferentes tiempos de control calculados por TL₅₀. A PsA1TA le tomará 3,4 (±0,5) días (81,6 horas) en controlar al 50 % de L-II, mientras que CoA2CA empleará 3,8 (±0,4) días (91,2 horas), sin evidentes diferencias estadísticamente significativas (p = 0,08). Es decir, ambos morfotipos pueden cuantificar la misma virulencia bacteriana, lo que implicaría en el uso indistinto de cualquier morfotipo para biocontrolar L-II. Aunque L-IV es la etapa de menor sensibilidad a PsA1TA capaz de prolongar el TL₅₀ a 5,3 días (127,2 horas), CoA2CA mostró mayor severidad al emplear 2,5 días (60 horas) comparativamente la mitad del tiempo de virulencia de PsA1TA (p = 0,03). De manera semejante responde L-III con TL₅₀ muy próximos a L-IV, establecidos entre 5,8 días (139,2 horas) en PsA1TA y 2,9 días (69,6 horas) en CoA2CA, con diferencias significativas (p = 0,02). La homogeneidad de las respuestas patógenas a todas las larvas fue respaldada por la relación-asociación de las variables (r², 72 % a 94 %) que indican la efectiva letalidad bacteriana con alta confiabilidad y ajuste estadístico (X ² , 1,3 a 8,2). Por lo tanto, los agentes infecciosos mostraron ser patógenos en distintos tiempos de control en dependencia al estado de desarrollo larval.