Amner Muñoz-Acevedo¹, Vladimir V. Kouznetsov², Elena E. Stashenko¹

1. Laboratorio de Cromatografía, Centro de Investigación en Biomoléculas, Centro de Investigación de Excelencia CENIVAM,
Universidad Industrial de Santander
2. Laboratorio de Química Orgánica y Biomolecular, Centro de Investigación en Biomoléculas, Centro de Investigación de
Excelencia CENIVAM, Universidad Industrial de Santander,
Correspondencia: Elena E. Stashenko, PhD. Laboratorio de Cromatografía, Centro de Investigación en Biomoléculas, Centro de
Investigación de Excelencia CENIVAM, Universidad Industrial de Santander, Carrera 27 calle 9. Bucaramanga, Colombia. Tel:
6456737, Fax: 6358210.
E-mail: elena@tucan.uis.edu.co
Recibido: 13 de Noviembre de 2009 - Aceptado: 20 de diciembre de 2009

RESUMEN

Se determinó por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) la composición química de aceites esenciales (AE), aislados por hidrodestilación asistida por la radiación de microondas (MWHD), de las especies vegetales aromáticas Artemisia dracunculus, Foeniculum vulgare, Illicium verum, Lippia micromera, Lippia origanoides, Ocimum spp., Plectranthus amboinicus, Tagetes filifolia, Tagetes lucida y Thymus vulgaris. Los valores de capacidades antioxidantes in vitro de estos aceites esenciales, se obtuvieron usando los ensayos de decoloración del catión-radical ABTS^+• (metodologías convencional y con dilución en microplacas) y la oxidación del ácido linoleico, inducida por O₂ y Fe⁺². El potencial inhibitorio de ABTS^+• fue más alto para los aceites esenciales que contienen fenoles (carvacrol y timol), que para los aceites esenciales ricos en éteres (trans-anetol y estragol). La actividad antioxidante mediante el ensayo ABTS^+• modificado en orden decreciente fue: AE Plectranthus amboinicus ≥ AE Lippia origanoides >> AE Thymus vulgaris > AE Lippia micromera >>> AE Tagetes lucida (flores) > AE Ocimum sp. > AE Tagetes lucida (hojas) > AE Illicium verum > AE Tagetes filifolia (Cenivam) > AE Foeniculum vulgare. Salud UIS 2009; 41: 287-294

Palabras Claves: GC-MS, MWHD, fenoles, éteres, aceites esenciales, ácido linoleico, ABTS^+•

Composition and in-vitro antioxidant capacity of essential
oils rich in Thymol, Carvacrol, trans-Anethole or Estragole

ABSTRACT

Gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) was used to determine the chemical composition of essential oils (EO) isolated by microwave-radiation-assisted hydrodistillation (MWHD) of Artemisia dracunculus, Foeniculum vulgare, Illicium verum, Lippia micromera, Lippia origanoides, Ocimum sp., Plectranthus amboinicus, Tagetes filifolia, Tagetes lucida and Thymus vulgaris. in vitro antioxidant capacity values using ABTS^+• discoloration assays (traditional and microplate methods) and the linoleic acid oxidation (with O₂ and Fe⁺²) of these essential oils were obtained. Essential oils with phenols (carvacrol and thymol) high content showed higher total antioxidant capacity values than the essential oils rich in ether compounds (estragole and trans-anethole). The antioxidant capacity using by modified ABTS^+• assay in decreasing order was as follows: EO Plectranthus amboinicus ≥ EO Lippia origanoides >> EO Thymus vulgaris > EO Lippia micromera >>> EO Tagetes lucida (flowers) > EO Ocimum sp. > EO Tagetes lucida (leaf) > EO Illicium verum > EO Tagetes filifolia (Cenivam) > EO Foeniculum vulgare. Salud UIS 2009; 41: 287-294.

Keywords: GC-MS, MWHD, phenols, ethers, essential oils, linoleic acid, ABTS^+•

INTRODUCCIÓN

El trans-anetol, carvacrol, estragol y timol son componentes típicos de aceites esenciales aislados de muchas especies vegetales aromáticas^1-3. Estas sustancias se usan principalmente como saborizantes, aromatizantes y conservantes en nutrición, medicina y en las industrias de alimentos, bebidas alcohólicas, farmacéutica^4,5; además, se emplean para la elaboración de perfumes, jabones y detergentes⁶. Estos compuestos y los aceites que los contienen presentan una variedad de actividades biológicas, desde anti-inflamatoria, anti-bacteriana, anti-fúngica, insecticida, anestésica, hasta antioxidante^7-10.

Actualmente, se ha incrementado considerablemente el interés en encontrar antioxidantes provenientes de fuentes naturales, para uso en alimentos o en fármacos, para reemplazar antioxidantes sintéticos, los cuales están cada vez más restringidos por sus posibles efectos cancerígenos¹¹.

En este trabajo, se aislaron por MWHD e identificaron por GC-MS, los metabolitos secundarios de 10 especies vegetales, de las cuales 8, fueron sembradas en el cultivo experimental del Complejo Agroindustrial Piloto del Centro de Investigación de Excelencia CENIVAM. Además, se evaluó la capacidad antioxidante in vitro de los aceites esenciales usando dos métodos: el ensayo de decoloración del catión-radical ABTS^+• (metodologías convencional y con dilución en microplacas) y la oxidación del ácido linoleico, por medio de la cuantificación del hexanal, producto secundario final de su degradación oxidativa. El empleo de la metodología con dilución en microplacas permitió obtener valores no subestimados de las capacidades antioxidantes totales de los aceites evaluados; mientras que los valores del efecto protector de los aceites sobre el ácido linoleico mostraron que los aceites esenciales presentan, posiblemente, otros mecanismo de acción diferentes y/o complementarios al de transferencia de electrones/protones.

METODOLOGÍA

Reactivos
El carvacrol (>98%), timol (>99%), trans-anetol (>98%), estragol (>98%), ABTS (>99%), α-tocoferol (97%), BHA (99%), BHT (99%), pentaflúorfenilhidracina (97%), hexanal (98%) y ácido linoleico (97%) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, EE.UU); persulfato de potasio (97%), sulfato de hierro (98%), dodecilsulfato de sodio (98 %), Tris y cloruro de potasio fueron comprados a Merck (Darmstadt, Alemania). Todos los solventes (metanol, etanol, hexano, agua) fueron grado HPLC de Mallinckrodt Baker Inc. (J.T. Baker, Phillipsburg, EE.UU).

Aislamiento de los AE
Los aceites esenciales de las 10 especies fueron obtenidos por MWHD (hidrodestilación asistida por la radiación deicroondas) de las hojas de T. vulgaris, P. amboinicus, L. origanoides, L. micromera, T. lucia, T. filifolia, Ocimum spp., cultivadas en el Complejo Agroindustrial Piloto de CENIVAM en la UIS. La especie Foeniculum vulgare y los frutos de I. verum fueron adquiridos del mercado local. La identificación taxonómica de muestras botánicas se llevó a cabo en el Instituto de Ciencias Naturales, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia (Bogotá).

Composición química
Se emplearon 2 sistemas GC-MS para el análisis de los aceites esenciales: un cromatógrafo de gases Agilent Technologies 6890 Plus (Palo Alto, CA, EE. UU.), equipado con un detector selectivo de masas Agilent Technologies 5973N (EI, 70 eV, m/z 40-350) y un cromatógrafo de gases Agilent Technologies 6890 acoplado a un detector selectivo de masas Agilent Technologies 5975 (EI, 70 eV, m/z 40-350). Ambos sistemas estuvieron equipados con inyector con/sin división de flujo (división de flujo 1:30), una torre de inyección automática HP 7863 y un sistema de datos MSChemStation G1701-DA, que incluía las bases espectrales Wiley 138K, NIST 2005 y QuadLib 2004. Se emplearon una columna capilar de sílice fundida con recubrimiento de 5%-fenil-poli(dimetilsiloxano) (DB-5MS, J&W Scientific, Folsom, CA, EE.UU.) de 60m, 0,25 mm d.i., 0,25 μm df y una columna capilar de sílice fundida con recubrimiento interno de poli(etilenglicol) enlazado (DB-WAX, J&W Scientific, Folsom, CA, EE.UU.) de 60 m, 0,25 mm d.i., 0,25 μm d_f. El programa de temperatura del horno para la columna DB-5MS fue de 45°C (2 min) hasta 150°C (5 min) @ 6°C/min, luego hasta 275°C (10 min) @ 8°C/min. Para la columna DB-WAX, la temperatura del horno se programó desde 45°C (5 min) hasta 150°C (3 min) @ 3°C/min, luego hasta 220°C (5 min) @ 4°C/min. Las temperaturas de la cámara de ionización y de la línea de transferencia se mantuvieron a 230 y 285°C, respectivamente.

Ensayo in vitro de decoloración del catión-radical
ABTS^+•
Para determinar la capacidad de atrapamiento del catión-radical ABTS^+• se empleó la metodología descrita por Re et al.¹² en los espectrofotómetros Genesys 20 (Thermospectronic – método convencional) y lector de microplacas Versamax (Molecular Devices – método modificado) mediante espectroscopía VIS a 734 nm. Los ensayos se realizaron por quintuplicado.

Ensayo in vitro de la oxidación del ácido linoleico
Para el ensayo in vitro de la oxidación del ácido linoleico se siguió la metodología descrita por Tamura y Yamagami¹³. La peroxidación lipídica se indujo por iones Fe⁺² (sulfato de hierro en presencia de oxígeno) y su incubación con el antioxidante se efectuó a 37°C durante 16 h en un cuarto oscuro. El hexanal, producto secundario mayoritario de la degradación oxidativa del ácido, se derivó con pentaflúorfenilhidracina (PFPH) en hexano, según la metodología descrita por Stashenko et al.¹⁴. Cada solución se inyectó luego al GC-ECD (detector con captura de electrones), para su análisis cromatográfico.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Composición química de los aceites esenciales
estudiados
Los nombres científico y común, número de voucher, rendimientos de los AE, índices de retención (columna apolar y polar) y cantidades relativas (%) de los componentes mayoritarios, identificados en las especies vegetales estudiadas se registran en la Tabla 1. En el AE de A. dracunculus no se encontraron estragol y trans-anetol; sin embargo, se detectaron elemicina y cis-asarona, que son compuestos metoxi-derivados del estragol y el trans-anetol, respectivamente, y han sido encontrados como constituyentes principales del estragón ruso¹⁵.

El alto contenido de estragol en los AE de las flores (93%) y hojas (93%) de T. lucida fue cercano al reportado por Cicció¹⁶ (95 y 97%, respectivamente) pero, las eficiencias de aislamiento fueron superiores (0,5% - flores y 0,9% - hojas) para los AE bajo estudio. Además, dentro de los aceites no se detectaron tagetona y dihidrotagetona^6,17, que son compuestos característicos de las especies Tagetes.

Por otra parte, el contenido total de trans-anetol y estragol en los AE de T. filifolia fue de 97% (Municipio de Bolivar, Departamento de Santander) y 98% (Complejo piloto CENIVAM). No obstante, T. filifolia cultivado en el Municipio de Bolivar presentó mayor contenido de trans-anetol (73%) y menor contenido de estragol (24%), que el cultivado en CENIVAM. Estas diferencias posiblemente se debieron a factores geo-ambientales. La composición determinada para los AE de T. filifolia fue semejante a la reportada por Zigadlo et al.¹⁸, pero discrepó de las reportadas por De Feo et al.¹⁹, donde los componentes principales fueron el cis-anetol (68%) y el estragol (14%); y por Marotti et al.²⁰, cuyo constituyente mayoritario fue el estragol (78%).

La eficiencia de extracción del AE del fruto seco de I. verum (2%) y el contenido de trans-anetol (83%), junto con sus demás constituyentes, concuerdan con los reportes de la literatura sobre esta especie^17,21. La composición establecida para el AE de F. vulgare fue parecida a la reportada por Yamini et al.²², siendo el trans-anetol (70%), el limoneno (10%) y el estragol (4%) los componentes más abundantes, pero difiriendo en el contenido de la fenchona (11%).

La composición obtenida del AE de P. amboinicus presentó diferencias con las mencionadas por Pino et al.²³ quienes identificaron carvacrol (51,0%) y α-terpineno + ρ-cimeno (10,3%); con Murthy et al.²⁴, con un 70,0% de contenido de carvacrol y con Singh et al.²⁵ quienes mostraron a P amboinicus como una fuente casi pura de timol (94,3%).

La composición química del AE de T. vulgaris determinada en este trabajo y la descrita por Golmakani y Rezaei²⁶ fue muy similar. No obstante, en la mayoría de reportes encontrados (Rota et al.²⁷, Jordan et al.²⁸ y Razzaghi-Abyaneh et al.²⁹) los constituyentes principales y sus cantidades difirieron. Chizzola et al.³⁰ reportaron otros quimiotipos de T. vulgaris ricos en carvacrol (26-38%), linalol (22-67%), trans-4-tujanol (16-33%), geraniol (32%) y ρ-cimeno (28%).

Los constituyentes volátiles identificados en el AE de L. origanoides fueron los mismos citados por Oliveira et al.³¹, aunque con diferencias en sus cantidades relativas: carvacrol (38,6%) y timol (18,5%).

Finalmente, la composición encontrada para el AE de L. micromera difirió de las reportadas por Pino et al.³² y Tucker et al.³³, las cuales se caracterizaron por tener 42 y 26,5% de carvacrol, respectivamente.

Valoración de la capacidad antioxidante in vitro
de los aceites esenciales
La exactitud del método ABTS^+• fue estimada usando α-tocoferol, BHT y BHA, empleando concentraciones entre 5x10^-6 y 4x10^-5 M. La capacidad antioxidante estimada por el método convencional espectroscópico de decoloración del ABTS^+• arrojó valores de TAA (mmol de Trolox^®/kg de AE) altos para los AE con alto contenido de fenoles; mientras que, para los AE con alto contenido de éteres aromáticos, estos valores fueron relativamente bajos (Tabla 2).

La comparación de los valores TAA de las sustancias "control" con los AE evaluados reveló que ninguno de los AE superó a los valores de actividad antioxidante de BHA y α-tocoferol. Sin embargo, los AE de P. amboinicus, T. vulgaris y L. origanoides presentaron capacidad anti-radicalaria cercana o superior a la de BHT. Los valores de capacidad antioxidante relativamente bajos para los AE constituidos por éteres aromáticos, pueden ser atribuidos a la ausencia de fenoles o sustancias capaces de donar electrones o hidrógenos³⁴.

Al evaluar el método microescalado se encontró que todos los AE ricos en estragol y trans-anetol presentaron una menor capacidad anti-radicalaria comparada con los tres antioxidantes de control; mientras que, los AE ricos en timol y carvarol presentaron una menor actividad comparada con los antioxidantes BHT y BHA. Sin embargo, Thymus vulgaris presentó capacidad anti-radicalaria cercana a la del α-tocoferol, Plectranthus amboinicus, junto con Lippia origanoides, superaron el valor de TAA del α-tocoferol.

Las diferencias encontradas entre los valores TAA de los antioxidantes control y los aceites evaluados, por los métodos convencional y modificado, se basaron en que el tiempo empleado (6 min) para el ensayo convencional no fue suficiente para completar la reacción entre el catión-radical ABTS^+• y la sustancia evaluada, trayendo como consecuencia diferencias significativas en los valores de TAA³⁵. Mientras que, el ensayo a microescala (a 30 min), permitió que la reacción entre el antioxidante y el catión-radical alcanzara condiciones cercanas al equilibrio y así no subestimar la capacidad antioxidante total.

La capacidad antioxidante de los AE se atribuye a los compuestos activos presentes en ellos; es decir, que se debe a los componentes principales, pero además a la presencia de aquellos constituyentes en pequeñas cantidades o la sinergia entre ellos³⁶.

Finalmente, los ensayos de inhibición del ácido linoleico fueron realizados utilizando 5 mg de las sustancias. Los AE de P. amboinicus, L. origanoides, T. lucida (hojas y flores), L. micromera, T. vulgaris, I. verum y T. filifolia (Municipio de Bolívar y CENIVAM) mostraron un efecto protector mayor que la α-tocoferol y Trolox^®. Mientras que, los AE de F. vulgare y A. dracunculus fueron los que menor efecto protector presentaron en la inhibición de la oxidación del ácido linoleico, comparados con todos los antioxidantes de referencia evaluados. Estos resultados confirman el uso potencial de los AE de plantas en la industria farmacéutica y/o de alimentos^37,38.

Los resultados de la inhibición de la peroxidación lipídica indicarían que el efecto protector de los aceites esenciales sobre el sistema modelo, para el caso de los aceites evaluados, transcurre tanto por medio de transferencia de electrones o hidrógenos, como por otro mecanismo de protección, e.g., a través de "sacrificio" de terpenos que se oxidan más rápidamente, que el ácido linoleico^39,40.

La capacidad antioxidante para la mayoría de los aceites esenciales evaluados no ha sido determinada por los métodos ABTS^+• modificado y la oxidación del ácido linoleico. Sin embargo, valores de capacidad antioxidante para los aceites de T. vulgaris^30,37, A. dracunculus³⁴, F. vulgare³⁶ y I. verum⁴¹ han sido reportadas, en algunos casos por los métodos empleados (ABTS^+• convencional y oxidación del ácido linoleico) como por otros ensayos (e.g., DPPH). Al comparar los resultados reportados con los obtenidos (método convencional y ácido linoleico) se encuentra similitud entre ellos: los aceites constituidos por derivados de éteres aromáticos mostraron menor inhibición que los aceites compuestos por timol y carvacrol, en el caso del ensayo DPPH (ensayo con un mecanismo similar al ABTS^+•)⁴² y ácido linoleico.

CONCLUSIONES

La capacidad anti radicalaria de los AE evaluados estuvo directamente relacionada con la composición química, poniéndose de manifiesto los efectos antagonistas y sinergistas entre los constituyentes de los AE con alto contenido de fenoles y en los AE con alto contenido de éteres aromáticos, respectivamente. Los AE ricos en estragol y trans-anetol, mostraron mejores resultados que sus constituyentes principales individuales; mientras que, timol y carvacrol fueron más activos que los AE que los contuvieron.

La comparación de la capacidad antioxidante entre los ensayos ABTS^+• e inhibición del ácido linoleico mostró tendencias similares tanto para compuestos puros como para los AE. El secuestramiento de radicales, que puede obstruir la propagación de la reacción en cadena de la peroxidación lipídica, es un mecanismo importante para la actividad inhibitoria. Por ende, su determinación (atrapamiento de radicales) es un buen marcador de la capacidad antioxidante.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen la financiación del trabajo a través del Contrato RC-432-2004 Colciencias-CENIVAM. A.M.-A. a Colciencias, por su apoyo económico a través de beca doctoral.

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