Norma Cecilia Serrano¹, Luis Alfonso Díaz¹, María Carolina Páez¹, Juan Pablo Casas², Juan Pablo Casas³

1. Centro de Investigaciones Biomédicas, Universidad Autónoma de Bucaramanga, Bucaramanga, Colombia.
2. Department of Epidemiology and Public Health, University College London, London, WC1E 6BT, United Kingdom.
3. Department of Epidemilogy and Population Health, London School of Hygiene and Tropical Mediane (LSHTM), London,
WC1E 7HT, United Kingdom.
Correspondencia: Norma Cecilia Serrano Díaz, MD MSc. Centro de Investigaciones Biomédicas, Universidad Autónoma de
Bucaramanga, Bucaramanga, Colombia. Campus el Bosque, Calle 157 N° 19-55 Cañaveral Parque, Bucaramanga - Colombia.
E-mail: nserrano@unab.edu.co. Fax: 577-6399147. Teléfono: 577-6399152, Ext. 139.
Recibido: 12 de octubre de 2009 - Aceptado: 14 de diciembre de 2009

RESUMEN

El óxido nítrico (NO) juega un papel importante en la regulación de la homeostasis vascular. La producción endotelial de NO está regulada por la óxido nítrico sintasa endotelial (NOSe), por lo tanto variaciones genéticas en el gen NOS3 podrían influir en la producción de NO. Tres polimorfismos (Glu298Asp, intrón-4 y -786T>C) en el gen NOS3, han sido asociados de forma inconsistente con enfermedades cardiovasculares (ECV). Estas variantes genéticas se han asociado con disminución de RNAm, concentración séricas bajas de nitritos/nitratos y disminución de la reactividad endotelial. A pesar de la amplia investigación de estos polimorfismos en ECV y de las aproximaciones para evaluar el papel funcional, no existe evidencia suficiente que permita esclarecer el papel causal y funcional de dichos polimorfismos sobre la enfermedad. Se requiere de nuevas estrategias que permitan seleccionar polimorfismos funcionales para determinar el riesgo atribuido al genotipo sobre la enfermedad. En la presente revisión se discute el posible efecto sobre la expresión de la actividad de la NOSe de esto tres polimorfismos genéticos descritos como de alta relevancia clínica en enfermedades cardiovasculares. Salud UIS 2010; 42: 66-77

Palabras Claves: Óxido nítrico, óxido nítrico sintasa, Polimorfismos Genéticos, polimorfismo de nucleótido simple, enfermedad cardiovascular

Functional relevance of polymorphisms of
endothelial nitric oxide synthase gene

ABSTRACT

Nitric oxide (NO) plays an important role on vascular homeostasis regulation. NO endothelial production is regulated by endothelial nitric-oxide synthase (eNOS), reason for which genetic variations in NOS3 gene could influence NO production. Three polymorphisms (Glu298Asp, intron-4, and -786T>C) in NOS3 gene have been inconsistently associated with cardiovascular diseases (CVD). These genetic variables have been linked to diminishment mRNA, nitrites/nitrate low serum levels, and low endothelial reactivity. Despite wide research on these polymorphisms in CVD and several approaches to evaluate their functional role, not enough evidence is available to clarify their functional and causal participation over the disease. New strategies are required to select functional polymorphisms and to determine genotype-attributable risk over disease. In this paper, we review and discuss the possible effect on NOSe activity expression of these genetic polymorphisms with high clinical relevance in CVD diseases. Salud UIS 2010; 42: 66-77.

Keywords: Nitric oxide, nitric oxide synthase, Genetic Polymorphisms, single nucleotide polymorphism, cardiovascular disease

INTRODUCCIÓN

El óxido nítrico (NO) juega un papel importante en la regulación de la homeostasis vascular¹, siendo un potente vasodilatador endógeno; además, inhibe la agregación plaquetaria², atenúa la adhesión de leucocitos al endotelio³, modula la proliferación del músculo liso^{4, 5} e inhibe la oxidación del colesterol de baja densidad (LDL)^{6, 7}. El NO es producido en el endotelio vascular por medio de la óxido nítrico sintasa endotelial (NOSe), por acción calcio-calmodulina dependiente, a partir de la conversión de L-arginina a L-citrulina y NO⁸.

El óxido nítrico es un gas simple que no se almacena, y se libera una vez se sintetiza. La regulación en la generación de NO puede ocurrir por alteraciones en la expresión o actividad de la NOSe, por cambios en la disponibilidad de cofactores activadores o por la producción de moléculas endógenas inhibitorias^9-12. El papel protagónico que juega el NO sobre el endotelio vascular ha llevado a proponer que una deficiencia vascular de NO, ya sea hereditaria o adquirida, podría contribuir fuertemente a disfunción endotelial y, en consecuencia, al desarrollo de enfermedades cardiovasculares.

La enzima NOSe es codificada por el gen NOS3, localizado en el cromosoma 7q35-36, el cual fue clonado y secuenciado en 1993. Está conformado por 26 exones que codifican para una proteína de 135 kD con 1203 aminoácidos. Una secuencia de aproximadamente 1500 bp corriente arriba de la región promotora del gen contiene sitios de unión a factores de transcripción que median la regulación por estrés de fricción y estrógenos entre otros¹³.

Dado que la regulación en la disponibilidad del NO en el endotelio está determinada en gran medida por la síntesis de la NOSe; variaciones genéticas (polimorfismos) en NOS3 son potenciales candidatos para ser estudiados como determinantes de la biodisponiblidad de NO y por ende, relacionados con disfunción endotelial. Por lo tanto, polimorfismos en NOS3 podrían explicar deficiencias funcionales, cuantitativas (alteraciones de la transcripción, estabilidad del RNAm, formación de una proteína con defectos catalíticos) o incremento en la degradación de la enzima¹⁴. Dichos polimorfismos podrían encontrarse con una frecuencia significativamente mayor en individuos con patologías que cursan con disfunción endotelial tales como, aterosclerosis¹⁴, enfermedad arterial coronaria^{15, 16}, hipertensión arterial¹⁷ o preeclampsia¹⁸, entre otras.

En la presente revisión se discute, a la luz del conocimiento actual, el posible efecto sobre la expresión, actividad de enzima y niveles de NO, de tres polimorfismos genéticos de la NOSe, que han sido descritos como de alta relevancia clínica en enfermedades cardiovasculares.

Polimorfismos Genéticos
Desde la terminación del secuenciamiento del genoma humano^{19, 20}, se han dado grandes pasos en la descripción y clasificación de las variaciones en los genes. La variación genética más común en los humanos es el polimorfismo de nucleótido simple (SNP, por su nombre en inglés, single nucleotide polymorphism). La aparición de un SNP dentro del genoma humano es bastante común, aproximadamente uno cada 180 pb²¹. Actualmente hay más de 10 millones de SNP documentados y almacenados para uso público en bases de datos libres, tales como www.hapmap.org. Aunque la aparición de SNPs dentro del genoma humano es bastante frecuente, la mayoría de ellos tienen una distribuciòn de alelos poco informativa (64% de todos los SNP), con una frecuencia del alelo menor (MAF) de menos del 5%. Además pocos SNP se ubican en las regiones codificantes del gen [(cSNP) 4%], comparado con los ubicados en las regiones no codificantes que corresponden al 96%. Para un gen promedio, se calcula que pueden existir cerca de 126 SNP, de los cuales el 35% corresponden a SNP comunes (MAF≥5%) y tan solo el 4% serían cSNP²¹. Estas observaciones son importantes al momento de escoger los SNP de los genes candidatos involucrados en los estudios de asociación. Con la disponibilidad actual de un catálogo de SNP comunes, los investigadores han desarrollado métodos para aplicar los SNP a los estudios de asociación con el objetivo de identificar variaciones del DNA que contribuyan a incrementar la susceptibilidad para enfermedades humanas.

Para NOS3 se han descrito más de 160 SNP, 8% de ellos ubicados en regiones codificantes, un poco mayor a lo reportado para el genoma en general, y un 92% localizado en regiones no codificantes (Figura 1). Cada uno de ellos con frecuencias alélicas que difieren entre los grupos étnicos (GE) y poblaciones (P) en las cuales son captados los individuos para la genotipificación y definición de las frecuencias alélicas. Por ejemplo, para el GE: Caucásicos, P: residentes de Utah con ascendencia del norte y occidente de Europa; GE: Asiáticos, P: Chinos y Japoneses; GE: Africanos, P: Sub-Sahariano, Nigeria, etc. Para fines de este articulo, utilizamos como referencia frecuencias que han sido publicadas en el GE de caucásicos.

Utilizando bases de datos electrónicas disponibles para la identificación de SNP, realizamos una búsqueda sistemática para NOS3 con base en la localización e implicación molecular del SNP, estado de validación, MAF y heterocigocidad.

Localización e implicaciones moleculares
Se identifica los SNP al interior de las diferentes regiones del gen y con base en su rol funcional se seleccionan los de interés, principalmente los no sinónimos ubicados en regiones codificantes y promotora, y algunos en la unidad terminal de la región UTR, (Tabla 1).²².

Estado de validación
Hace alusión a los diferentes análisis realizados para validar una variante genética recientemente reportada, que incluye el ser sometido de manera independiente por más de un grupo, ser validado por frecuencia con la respectiva identificación del alelo menor en diferentes poblaciones y ser evaluado por el Proyecto Internacional HapMap²³. Para el caso particular de NOS3 el porcentaje de SNP validados por este consorcio no supera el 7% (Tabla 2).

Frecuencia del alelo menor (MAF)
Valor que describe la frecuencia del alelo no común en la población de referencia, que en el caso de estudios de asociación seria el "alelo de riesgo", y cuyo porcentaje nos permite predecir el tamaño de muestra necesario para evaluar el alelo en determinado grupo poblacional. En la (Tabla 3), se identifica el total de SNP de NOS3 con un valor MAF ≥10% en población caucásica.

Heterocigocidad
Reporte del genotipo en su versión heterocigoto para el SNP de interés, en más del 30% de la población de referencia. A pesar de ser un gen con un número alto de polimorfismos, solo tres de ellos se han evaluado rutinariamente en estudios de asociación genética y se han considerado de relevancia clínica, especialmente en enfermedades cardiovasculares. Un SNP ubicado en la región promotora del gen, a -786 pb del sitio de inicio de la transcripción (-786C>T), un VNTR al interior del intrón-4 y un SNP no sinónimo ubicado en el exón 7 (Figura 2). Sin embargo la variación funcional que genera cada uno estos polimorfismos no está aún completamente caracterizada, por lo tanto los estudios de asociación están basados más en "polimorfismos candidatos", que en "genes candidatos" ²⁴.

Función de los Polimorfismos
Glu298Asp. Este polimorfismo se ubica en el exón 7 del gen, cuya variante 894 G>T, da como resultado un cambio del aminoácido glutamato por ácido aspártico en la posición 298 (Glu298Asp) de la proteína. Estudios de asociación genética han mostrado que individuos portadores del alelo Asp298 tienen una probabilidad mayor de desarrollar enfermedad arterial coronaria^{15, 16}, preeclampsia¹⁸, espasmo de la arteria coronaria²⁵ e hipertensión arterial^{17, 26}; sin embargo, los resultados de asociación han sido inconsistentes cuando se replican en diferentes poblaciones.

Dado que los cambios de glutamato por ácido aspártico son sustituciones conservativas, inicialmente se consideró que el polimorfismo Glu298Asp estaba en desequilibrio de ligamiento con otro polimorfismo funcional no identificado. Sin embargo, resultados in vitro recientes indican que el polimorfismo Glu298Asp por sí mismo da como resultado una alteración en la función de la enzima. Es así, como Tesauro et al²⁷ demostraron in vitro que las isoformas de la NOSe son procesadas de manera diferente dependiendo de la presencia de ácido aspártico o glutamato en la posición 298. Cuando la NOSe tiene en la posición 298 ácido aspártico, ésta es clivada en la vecindad del aminoácido 298, lo cual no sucede en presencia del aminoácido glutamato, indicando un cambio potencial en la estructura secundaria de la proteína determinado por un reemplazo conservativo; por lo tanto, el polimorfismo Glu298Asp podría ser no silente y, posiblemente, ser reconocido por proteasas endógenas como un blanco de clivaje, lo que genera disminución en la biodisponibilidad de NOSe y como consecuencia de NO. Sin embargo, un estudio posterior mostró que posiblemente este clivaje (ex vivo) en presencia de Asp298, podría ser debido a condiciones de incremento de temperatura y pH bajo, dado que éste fue eliminado al usar el mismo sistema de buffer pero limitando la hidrólisis ácida de los enlaces Asp; estos resultados estarían en contra de un procesamiento intracelular diferencial en presencia de Asp o Glu²⁸.

Un estudio posterior, Dosenko²⁹ trató de determinar las manifestaciones funcionales de este polimorfismo, encontró que los niveles de RNAm y la actividad de la enzima en plaquetas dependen del genotipo. Plaquetas procedentes de individuos homocigotos para Asp298 presentan niveles más bajos de RNAm que los homocigotos para el alelo silvestre Glu298, pero los valores no muestran diferencia entre los individuos heterocigotos. La actividad de la enzima medida por un sistema de detección fluorimétrico (FCANOS 1, Sigma), mostró que los homocigotos para Asp298 tenían una menor actividad de NOSe que los individuos homocigotos para el alelo silvestre, pero esta diferencia no fue estadísticamente significativa²⁹. Otros ensayos realizados en plaquetas procedentes de pacientes homocigotos pora el alelo Asp298 mostraron que éstos producen una cantidad mayor de superóxido y menor de NO ex vivo que individuos homocigotos para la variante silvestre Glu298³⁰. A pesar de estos resultados, el efecto in vivo que produce este polimorfismo sobre la producción de NO, estrés oxidativo y la respuesta vascular aún no es claro.

Estudios en muestras pequeñas en las que se utilizó vasodilatación mediada por flujo (VMF), una prueba no invasiva que permite medir la respuesta endotelial dependiente de NO in vivo, utilizando ultrasonido del alta resolución³¹, han mostrado resultados contradictorios^32-36. Un ensayo adicional pero con un tamaño de muestra mayor, conducido por Leeson et al ³⁷, en 248 individuos (131 mujeres y 117 hombres) con edad entre 20 y 28 años, encontró que el polimorfismo Glu298Asp no influye sobre la reactividad endotelial medida por VMF. Sin embargo, varones portadores del alelo Asp298 presentaban una reducción en la reactividad endotelial asociada al estado de tabaquismo, comparado con los individuos fumadores y portadores del alelo Glu298. Estos hallazgos sugieren una modulación determinada genéticamente sobre fenotipo analizado y una clara interacción entre genotipo (Asp298) y factores de riesgo convencionales (tabaquismo)³⁷. Estos hallazgos abren la posibilidad de entrar a realizar intervenciones dirigidas (no fumar), sobre poblaciones específicas a riesgo seleccionadas por marcadores genéticos (portadores del alelo Asp298). Posteriormente, un estudio con un tamaño de muestra significativamente mayor, el cual incluyó 2883 participantes del estudio Framinghan, confirmó la no relación entre el genotipo Glu298Asp y la VMF ³⁸.

Polimorfismo –786T>C. Este polimorfismo se ubica en la región promotora del gen. Fue descrito inicialmente en 1999 por Nakayama et al, quienes encontraron que el alelo mutado, -786C, se asociaba con una marcada reducción en la actividad promotora del gen, 52 ± 11%. Hallazgos que sugerían compromiso en la síntesis endotelial de NO y predisponían a espasmo coronario en población japonesa³⁹. Estudios posteriores confirmaron que en homocigotos para el alelo mutado, C/C, se reducía significativamente la actividad promotora del gen y, por ende, los niveles de RNAm de la NOSe^40-42. Sin embargo, otros estudios realizados en población australiana⁴¹ y francesa⁴⁴ encontraron que este polimorfismo no se asocia con la actividad promotora del gen ni con enfermedad arterial coronaria.

Los resultados positivos entre este genotipo y reducción en el RNAm de la NOSe, condujeron a plantear la posible asociación de este polimorfismo con bajos niveles de NO endotelial. Sin embargo, la cuantificación directa de los niveles de NO es difícil, dado su corta vida media; por lo tanto, se ha utilizado como medida indirecta la cuantificación en plasma de nitritos y nitratos (NOx), productos de la rápida oxidación del NO. La medición de NOx en plasma a partir de sangre recolectada posterior a 12 horas de ayuno reduce en cerca de un 50% los niveles de NOx y refleja en gran medida la producción endógena de NO^{45, 46}.

Los resultados con respecto a la correlación entre fenotipo (niveles de NOx) y genotipo (polimorfismo –786T>C) han sido contradictorios. Se ha reportado bajos niveles en las concentraciones del NOx plasmáticas en individuos portadores del alelo "C"⁴⁷, mientras que otros estudios no muestran diferencias significativas^48-50. Aunque este polimorfismo puede reducir la expresión del gen que codifica para la NOSe, aparentemente no afecta las concentraciones plasmáticas de NOx; por lo tanto, parece no tener efecto sobre la producción endógena de NO.

El efecto in vivo de este polimorfismo también ha mostrado resultados contradictorios. Un estudio encontró una relación entre el polimorfismo –786T>C y la VMF durante la infusión de acetilcolina en pacientes hipertensos³³; sin embargo otros dos estudios no encontraron dicha correlación^{34, 35, 38}.

VNTR intrón-4. Este polimorfismo corresponde a la una repetición de 27 pb localizado en el intrón 4. El alelo silvestre (4b) está conformado por la repetición de 5 veces consecutivas de la secuencia de 27 pb, mientras que el alelo mutado (4a) presenta 4 veces la secuencia repetida. Aunque este polimorfismo se ubica en un intrón, esto no necesariamente excluye la posibilidad de tener un papel funcional de relevancia en la regulación trans y postranscripcional del gen.

Algunos reportes indican que esta variante podría tener efecto funcional. Wang et al⁵¹ presentan en un estudio con individuos japoneses sanos y no fumadores, que las personas homocigotas para el alelo mutado (4a/4a) presentaban un incremento en los niveles plasmáticos de NOx. Esto contrasta con otro estudio, realizado también en población japonesa, donde encuentra niveles disminuidos de NOx en individuos portadores del alelo mutado, pero en este estudio no se documenta el antecedente de tabaquismo⁵².

Dado que el genotipo 4a/4a ha sido asociado con incremento del riesgo para enfermedad arterial coronaria⁵³, este genotipo debería estar relacionado más con niveles bajos de NOx que con niveles elevados. Una explicación a esta aparente incongruencia está dada por la posible interacción significativa entre tabaquismo y este polimorfismo en enfermedad arterial coronaria. En fumadores, pero no en individuos no fumadores, los autores encuentran un exceso de homocigotos para el alelo mutado (4a/4a) en pacientes con arterias severamente estenosadas, comparado con aquellos sin o con estenosis moderada. Sin embargo, paradójicamente estos individuos (4a/4a) también tenían significativamente niveles más altos de NO que individuos sanos, no fumadores, portadores de uno o dos alelos silvestres (4a/4b, 4b/4b) ⁵³.

Un estudio posterior⁵⁴, realizado en placentas, encontró que los niveles de RNAm y de la proteína fueron significativamente más bajos en heterocigotas (4a/4b), que en homocigotas para el alelo silvestre. En contraste, la actividad de la enzima fue cerca de 5 veces más alta en las heterocigotas que en las homocigotas (4b/4b), lo cual es consistente con el hallazgo anterior donde asocian el alelo mutado con alta producción de NO⁵³. Sin embargo, en placentas procedentes de fumadoras, se encontró disminución en los niveles de la proteína NOSe, tanto para portadoras del alelo silvestre como del mutado, pero solo para el genotipo 4a/4b, la actividad de la enzima estaba reducida a la mitad de las no fumadoras. Por lo tanto, aunque portadores del alelo mutado producen más cantidad de NO, la capacidad generadora de NO por la NOSe está seriamente comprometida en fumadores portadores del alelo mutado más no en aquellos portadores del alelo silvestre⁵⁴. Entonces, parece factible hipotetizar que el tabaquismo regula la actividad de la enzima NOSe dependiendo de la variante ubicada en el intrón 4, ejerciendo un efecto negativo en presencia del alelo mutado.

El efecto in vivo de este polimorfismo ha sido documentado en un estudio conducido en pacientes con diabetes 2, en el cual se encontró que los pacientes diabéticos y fumadores portadores del alelo 4a presentaban una reducción en la VMF en fumadores pero no en los pacientes no fumadores⁵⁵.

Por otro lado, un estudio realizado in vitro, para evaluar la relación entre genotipo-fenotipo, en el que se utilizó cultivo de células endoteliales procedente de vena de cordón umbilical expuestas a extracto de cigarrillo, mostró que para ninguno de los tres polimorfismos de la NOSe (Glu298Asp, –786T>C, VNTR intron-4) existe una correlación entre el genotipo y la exposición a extracto de cigarrillo. Estos hallazgos podrían indicar que la aparente asociación entre tabaquismo y genotipo NOSe, podría darse a nivel de interacción biológica funcional más que en la expresión de NOSe o en la actividad de la enzima. Una posibilidad es que los radicales libres producidos por el fumar cigarrillo pudiesen interferir con la producción biológica de NO por la NOSe⁵⁶.

CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES PARA
FUTURAS INVESTIGACIONES

Sin duda la NOSe es una enzima importante para la integridad fisiológica de la pared arterial y se encuentra involucrada en el desarrollo de disfunción endotelial. También parece claro que las variaciones genéticas de NOSe pueden llevar a cambios en la expresión y actividad de la enzima, los cuales podrían ser modificados por factores ambientales; sin embargo, los estudios funcionales tanto in vitro como in vivo han generado datos contradictorios. Las asociaciones aparentemente inconsistentes entre genotipos de la NOSe y fenotipos clínicos (hipertensión, espasmo coronario, preeclampsia o enfermedad arterial coronaria entre otros), o con fenotipos bioquímicos (expresión y actividad de NOSe, niveles séricos de NOx y VMF), es un fenómeno observado en muchos otros genes y fenotipos clínicos, fenómeno que no solo ocurre en enfermedades complejas sino también en enfermedades Mendelianas aparentemente "simples" (monogénicas).

La asociación entre polimorfismos genéticos y fenotipos clínicos varían cuantitativa y cualitativamente para la misma mutación, así como también entre la misma familia, la misma población o poblaciones. Aunque el mecanismo para explicar dicha variación entre la asociación genotipo-fenotipo no es clara aún, Dipple and McCabe⁵⁷, han presentado un modelo de umbral para tratar de explicar dicha inconsistencia. Factores tales como los ambientales, alelos independientes, interacción gen-gen y variabilidad en la severidad del fenotipo clínico, pueden todos ellos potencialmente modificar o cambiar la relación genotipo-fenotipo a otro tipo de relación, particularmente la severidad de la enfermedad.

Hasta el momento, se ha acumulado una cantidad considerable de evidencia que evalúa el papel del gen del la NOSe y sus variables genéticas tanto en enfermedades cardiovasculares como en otros desórdenes complejos. No obstante, el papel funcional de los diferentes polimorfismos de la NOSe, no es aún claro, en parte debido a la complejidad técnica en la cuantificación de la producción de NO en humanos, pero más aún, en la ausencia de estrategias claras que permitan definir "polimorfismos funcionales".

A la fecha se acepta que la evaluación de genes candidatos como el de la NOSe, requiere una estrategia integral que involucre la evaluación de todas las variantes presentes en el gen, teniendo en cuenta el grado de vínculo [desequilibrio de ligamiento (DL)] presente entre ellas. Es así, como gracias a la rápida evolución del Proyecto Genoma Humano^19,20 y otras estrategias como el Proyecto HapMap⁵⁸, es ahora posible realizar este tipo de evaluaciones, seleccionando dentro de las regiones del alto DL los SNP blanco a evaluar (tSNP), en cuya selección se recomienda incluir solo variantes con una frecuencia del alelo menor >5%^59-62. Finalmente los tSNP seleccionados y los haplotipos generados por los tSNP, serán genotipificados en la población a estudio, en un tamaño de muestra adecuado que permita determinar la fuerza de asociación con el fenotipo clínico (enfermedad) o bioquímico (expresión, actividad, niveles de la proteína)³⁸.

A pesar de la amplia investigación en torno al gen la NOSe en enfermedades cardiovasculares y otros desórdenes complejos, y de las aproximaciones para evaluar el papel funcional de los polimorfismos estudiados, no existe evidencia suficiente que permita esclarecer el papel causal de dichos polimorfismos sobre la enfermedad, ni entender la naturaleza de la relación genotipo-fenotipo y la interacción entre genotipo y medio ambiente. Por lo tanto se requiere aún de nuevos estudios, utilizando nuevas estrategias que permitan determinar el riesgo atribuido al genotipo para construir estrategias de intervención dependientes del genotipo y dependientes de la interacción genotipo-ambiente.

AGRADECIMIENTOS

La presente revisión fue realizada con patrocinio de Colciencias (proyecto 1241-04-13030) y de la Universidad Autónoma de Bucaramanga (proyecto EGEN07).

CONFLICTO DE INTERÉS

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses en la realización del presente trabajo.

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