2 Métodos

Se colectaron sedimentos marinos provenientes de la Playa la Azufrada en la Isla Gorgona a una profundidad entre 40-50 cm. Utilizando recipientes previamente esterilizados se colectaron las muestras de sedimentos. Los recipientes se abrieron al momento de la colecta y fueron cerrados antes de ser retirados del agua, posteriormente fueron sellados y almacenados para su transporte al laboratorio de Investigaciones Microbiológicas de la Universidad del Valle.

2.1 Evaluación de la actividad electrogénica de los sustratos ambientales

Se construyeron MFC de una cámara con un volumen de 500 mL. Los electrodos se construyeron utilizando piezas cilíndricas de grafito con un área superficial de 11.31 cm². El ánodo se construyó con tres piezas de grafito. Para el caso del cátodo, se utilizó una pieza de grafito recubierta con catalizador de platino-carbono con una carga de 0.1mg/cm² preparada en una solución de Nafion al 5 %. El monitoreo de los parámetros electroquímicos se llevó a cabo mediante colecta de voltaje y corriente a través del tiempo y curvas de potencial de celda Vs. densidad de corriente. Los valores de potencial y corriente se registraron usando multímetros digitales (EXTECH modelo EX542). La densidad de potencia fue normalizada con respecto al área geométrica del ánodo.

2.2 Aislamiento de los microorganismos cultivables

Finalizadas las mediciones de potencial electroquímico, se realizó el cultivo y aislamiento de bacterias provenientes de la biopelícula formada sobre el ánodo de las MFC que fueron alimentadas con sedimentos marinos. Los ánodos fueron lavados con agua destilada estéril y se raspó la superficie de éstos con un escarpelo estéril, el raspado se utilizó para inocular medio líquido que contenía peptona 0.5 % (p/v) y extracto de levadura 0.1 % (p/v). Para la preparación de este medio se utilizó agua de mar sintética fabricada con base en las siguientes sales: NaCl (24.54 g/L), Na₂SO₄(4.09 g/L), KCl (0.7 g/L), NaHCO₃ (0.2 g/L), KBr (0.1 g/L), H₃BO₃ (0.003 g/L), NaF (0.003 g/L), MgCl₂.6H₂O (11.1 g/L) CaCl₂.2H₂O) (1.5 g/L) y SrCl₂.6H₂O (0.017 g/L); la salinidad del medio fue ajustada a 26 ppt (partes por mil). La muestra de la biopelícula fue incubado a 30º C durante 24 horas, posteriormente se realizaron diluciones y siembras en superficie en placas solidificadas con agar-agar, conservando los componentes del medio líquido. Se seleccionaron los microorganismos con características distintivas, los cuales fueron caracterizados mediante observaciones macroscópicas y por microscopia óptica.

2.3 Observación de las biopelículas anódicas mediante microscopia electrónica de barrido

Se retiró un fragmento de cada electrodo, los cuales fueron sumergidos en una solución de glutaraldehído al 2.5 % en amortiguador fosfato 0.1 M pH 7.2 durante 12h a 4º C, con el objetivo de fijar la biopelícula. Las muestras fijadas fueron lavadas dos veces en amortiguador fosfato. Posteriormente, fueron deshidratadas, sumergiendo e incubando la muestra a 4º C durante 10 min en concentraciones crecientes de etanol entre 30 % y 99.8 %. Las muestras deshidratadas se secaron inmediatamente, agregando hexametildisiloxano (HMDS) y se recubrieron con una fina película de oro, para su inmediata observación.

3.1 Desempeño electroquímico de los sustratos ambientales

En la Figura 1 se muestran las densidades de potencia generadas por las MFC en función del tiempo. En el caso de la MFC alimentadas con aguas y sedimentos de lago, se registró el mayor valor de densidad de potencia el día 19 con un valor de 3.1 mW/m²; en el caso de la MFC alimentada con sedimentos marinos, registró un valor máximo de 0.67 mW/m² en el día15. Posterior a estos, los valores tendieron a estabilizarse en ambos dispositivos. Los dispositivos pudieron mostrar una actividad electrogénica utilizando la muestra ambiental como único sustrato energético.

Figura 1 Densidad de potencia de los sustratos ambientales 

Los valores de densidad de potencia de la MFC alimentada con sustratos provenientes del lago mostraron valores 4.6 veces más elevados que la MFC alimentada con sustratos marinos. Esta diferencia en la densidad de potencia coincide con lo registrado por otros autores, donde los valores de densidad de potencia máximos para sedimentos marinos oscilan entre 28 mW/m²¹¹ y 32 mW/m²⁴. En contraste, los sedimentos y aguas continentales como lagos muestran valores muy superiores, como 294 mW/m²¹⁶, y aguas residuales con 210 mW/m²¹⁷, los cuales son bastante elevados en comparación con las densidades de potencia encontradas en los sedimentos marinos. Quan et al.¹⁸, consiguieron incrementar la densidad de potencia generada por MFC alimentadas con sedimento marinos a 180 mW/m² al enriquecer el dispositivo con sustratos energéticos con fuentes de carbono, indicando que la disponibilidad de sustratos energéticos en los sedimentos marinos representa un factor que limita el desempeño electroquímico del dispositivo.

Aunque los valores registrados en este estudio son bajos, se puede identificar que los sustratos colectados en la Playa La Azufrada de la Isla Gorgona presentan actividad electrogénica. Los bajos valores de densidad de potencia pueden corresponder al diseño de la MFC que solo contaba con una área anódica de 33.93 cm², que a su vez limita el área de la biopelícula y por ende la cantidad de electrones involucrados en la producción de energía ³.

3.2 Biopelículas anódicas

La Figura 2 muestra las diferencias en la estructura y composición de las biopelículas formadas sobre los electrodos. La MFC alimentada con sustratos provenientes del lago muestra la formación de una compleja biopelícula sobre el electrodo. En contraste, la biopelícula formada sobre el ánodo de la MCF alimentada con sedimentos marinos muestra un desarrollo significativamente menor.

Figura 2 Microscopía electrónica a los ánodos de las MFC. A) Biopelícula anódica formada sobre los ánodos de MFC alimentada con sedimentos marinos. B) Biopelícula anódica formada sobre los ánodos de MFC alimentada con sedimentos del lago de la microestación de la Universidad del Valle. 

La estabilización de los valores de desempeño electroquímico registrados en las MFC puede ser un indicativo de la conformación de la biopelícula anódica ¹⁹; sin embargo, en la Figura 2 se observa una diferencia notoria en la composición de las biopelículas, donde el desarrollo de la biopelícula anódica de la MFC alimentada con sedimentos marinos muestra un crecimiento y desarrollo menor que la alimentada con sedimentos del lago. Erable et al.²⁰, indican que biopelículas anódicas formadas con sedimentos marinos, en los primeros 20 días de operación muestran células o grupos de células aislados sobre los electrodos y después de 35 días de operación se puede observar una biopelícula compleja.

Biopelículas asociadas a los electrodos de las MFC pueden limitar la producción de energía ³ o actuar como agentes catalizadores en la producción de energía y en la biodegradación de compuestos ⁽²¹⁾. Conocer las dinámicas de las biopelícula así como la búsqueda de microorganismos eficientes son aspectos clave sobre la biología de las MFC; aspectos que contribuirían a mejorar el desempeño de los dispositivos.

3.3 Microorganismos aislados

Se aislaron 4 microrganismos provenientes de la biopelícula anódica de la MFC alimentada con sedimentos marinos que presentaban características morfológicas distintivas. En la Tabla 1 se muestra la caracterización morfológica realizada a los microorganismos, incluyendo la descripción del microorganismo, su crecimiento en 48 horas en placas sólidas y observaciones mediante microscopia óptica. La valoración de la ultra estructura química de la pared celular se realizó mediante tinción de GRAM y prueba de KOH.

Tabla 1 Caracterización morfológica de los microorganismos aislados de la biopelícula formada sobre los ánodos de las MFC alimentados con sedimentos marinos. 

Microorganismos pertenecientes a los grupos de Alphaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Actinobacteria, Bacilli y Chroobacteria, entre otros, han sido encontrados en biopelículas formadas sobre los electrodos de MFC alimentadas con sedimentos marinos ^19,22, indicando que en ambientes marinos existe una amplia diversidad de microorganismos capaces de formar biopelículas sobre los electrodos de las MFC ²³.

3.4 Perspectivas sobre esta biotecnología

Se ha demostrado que las MFC operadas en ambientes naturales tienen la capacidad de proveer energía de forma constante durante largos periodos de tiempo, como lo demuestran Reimers et al.¹⁰, quienes construyeron un dispositivo que mostró una densidad de potencia de 10 mW/m² durante 240 días y, más adelante, lograron obtener un dispositivo que operó a 34 mW/m² durante 125 días ²⁴. Las celdas de combustible microbianas operadas de forma in-situ son consideradas como una alternativa de energía renovable; aunque a la fecha no proveen la energía suficiente para operar grandes dispositivos, sin embargo, se considera promisoria para el monitoreo ambiental en lugares apartados, al utilizar el dispositivo para proveer de energía a sensores y dispositivos de medición ²⁵.

Tender et al.¹³, construyeron una MFC acoplada a un sistema de almacenamiento de energía y éste a su vez a una boya meteorológica, la cual es un dispositivo que incorpora sistemas de adquisición de datos meteorológicos y oceanográficos. El sistema operó con una MFC con densidad de potencia entre 9-20 mW/m², la cual permitió el funcionamiento del sensor incorporado, demostrando que incluso a las bajas potencias generadas es posible acoplar sistemas funcionales a las MFC. Las MFC se consideran como una tecnología emergente, con la capacidad de proveer energía de baja potencia por largos periodos de operación ininterrumpidamente, con costos bajos ¹³. El potencial de esta tecnología está en crecimiento, su potencial de aplicación y complejidad dependerá del desempeño electroquímico logrado por las MFC, aun así esta biotecnología se muestra como promisoria para la construcción de sensores en lugares remotos ²⁵.

Independiente del desempeño electroquímico que muestren las MFC, se consideran una herramienta valiosa como apoyo a estudios de diversidad microbiana y sistemas con complejas agrupaciones microbianas útiles en procesos de biorremediación.