2.1 Materiales

El pipilongo se adquirió en cultivos orgánicos del corregimiento La Buitrera del municipio de Cali, Colombia. La Buitrera se extiende desde 1000 hasta 2000 metros sobre el nivel del mar con latitud (ϕ): N 3? 23´ 38,4770² y longitud (λ): W 76? 34´ 47,23608² La muestra de pipilongo se secó al horno a una temperatura no mayor a 60°C. El contenido de humedad de la materia prima aproximado fue de 7%. La piperina estándar Sigma Aldrich 97%, el etanol absoluto y hexano grado analítico fueron adquiridos de Scientific Products, Cali. Agua desionizada y Metanol grado HPLC (Scientific Products, Cali) se utilizaron como disolvente para cromatografía liquida de alta resolución (HPLC).

2.2 Equipos

La extracción asistida por ultrasonido se realizó en una sonda de ultrasonido (Sonic Dismembrator modelo 505 Fisher Scientific™ con una frecuencia de 20 KHz y potencia máxima de 500 W.

Para la medida del espectro UV-Vis se utilizó el espectrofotómetro UV-1700 marca SHIMADZU, que trabaja con un ancho de banda de 1 nm en la región de 190 a 1100 nm.

El Zetasizer S90 (Instrumentos Malvern), instrumento utilizado para la determinación del tamaño de partícula y tamaño molecular, posee un rango de medición de 0.3 nm-5 micras (diámetro). La principal forma de mediciones es a través de dispersión de luz dinámica (DLS) en un ángulo de dispersión dinámica de 90 grados.

2.3 Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

La piperina se analizó utilizando cromatografía líquida de alta resolución. Se utilizó el instrumento de HPLC marca SHIMADZU el cual posee un sistema LCSolutions 2010, que es un tipo de bomba del sistema en serie de doble émbolo y como detector de UV. La columna utilizada fue C₁₈ (fase reversa), la columna vértice de la sección transversal de 150 x 3.9 mm empacada con sílica. La longitud de onda se fijó en 340 nm, la fase móvil utilizada fue MetOH:H2O (70:30), el volumen de inyección fue 20 μL y la tasa de flujo fue de 0.7 mL/min. El tiempo de retención estuvo en un rango de 2.7 - 2.8 min.

2.4 Extracción Soxhlet

La extracción fue llevada a cabo partiendo de 5 g de Piper tuberculatum seco y molido en un aparato convencional Soxhlet. Una vez finalizó el tiempo de extracción, se recuperó, por destilación, parte disolvente del balón. Se utilizaron 200 mL de disolvente en cada ensayo. 5 mL de los extractos resultantes se tomaron para ser analizados mediante HPLC. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 1.

2.5 Extracción asistida por ultrasonido

La extracción se realizó en un recipiente de vidrio con fondo plano mantenido en un baño maría durante 10 minutos antes de ser sometidos a la sonda de ultrasonido. 5 g de Piper tuberculatum se mezclaron con 50 mL de disolvente en el recipiente de vidrio. El Piper tuberculatum se irradió por ultrasonido durante el tiempo establecido con un pulso de 10 segundos de sonicación y 5 segundos de espera. Se tomaron 5 mL de los extractos resultantes para ser analizados mediante HPLC. Los resultados se presentan en la Tabla 2.

2.7 Preparación de liposomas vesículas multilamelares tipo cebolla (MLV)

Inicialmente se preparó un buffer fosfato (PBS) 0.1 M a pH 7.4 con y en agua desionizada. Se prepararon soluciones del extracto de pipilongo y piperina a 20, 200 y 2000 ppm en cloroformo. Se tomó 0.3 g de lecitina y 0.1 g de colesterol ¹⁶, se adicionó individualmente cada solución preparada y mediante un baño maría a ~70º C, se eliminó por evaporación el disolvente agitando suavemente, promoviendo la formación de la bicapa lipídica. Se realizaron varios ciclos de secado en el baño, asegurando la evaporación total del cloroformo. 10 mL del buffer PBS fueron calentados en el mismo baño y se adicionaron a la bicapa lipídica. Para evitar la formación de sólidos y la hidratación completa de la bicapa, se sometió la emulsión a sonificación en un baño de ultrasonido y posteriormente a agitación magnética. La purificación de los liposomas se realizó, centrifugando a 3500 rpm.

2.8 Actividad antioxidante

Las actividades antioxidantes de las muestras fueron determinadas, usando el radical libre 2,2-difenil-1-picrilhirazil (DPPH). Clásicamente, el DPPH es disuelto en metanol y su ensayo se realiza en un rango entre 517y 520 nm. En este caso, una solución a 0.2 Mm de DPPH fue preparada en MetOH:H O (75:25) ⁹. Las muestras de extracto de pipilongo y piperina se disolvieron en metanol solamente, garantizando la completa dilución, ya que la piperina es insoluble en agua y la formación de partículas generaría interferencias en el espectrofotómetro UV. Concentraciones de 20, 200, 2000 ppm fueron preparadas tanto para el extracto aceitoso, la piperina y el estándar de referencia, quercetina. Para los estudios en el extracto, piperina y quercetina, 1.5 mL de DPPH (0.2 mM) se mezclaron con 1.5 mL de la muestra seleccionada. En las vesículas MLV se realizó una dilución de 50 µL en 10 mL con agua desionizada. La misma proporción muestra:DPPH (1:1) fue utilizada.

El extracto de la especie Piper tuberculatum utilizado para la preparación de vesículas y extracto libre para los análisis, fue aquel que contenía mayor cantidad de piperina.

La absorbancia a 520 nm se determinó después de 60 min de incubación a temperatura ambiente en la oscuridad. La actividad de inhibición fue calculada de la siguiente forma:

donde A₀ es la absorbancia de control (DPPH sin adición de muestra), A₁ es la absorbancia de la muestra. Los resultados se presentan como el promedio de análisis por triplicado.

2.9 Análisis de tamaño de partícula

Las vesículas fueron medidas utilizando un Zetasizer Nano S90 (Instrumentos Malvern), con una escala de medida de 0.1 a 10,000 nm (diámetro). Las soluciones se prepararon tomando 500 µL de liposomas MLV en 50 mL de agua desionizada.

3.1 Validación de metodología de extracción

La preparación de las muestras se realizó tomando alícuotas de 500 μL de extracto llevados a aforo con etanol absoluto en un balón aforado de 5 mL. Las soluciones estándar fueron de igual forma preparadas en balones de 5 mL con etanol absoluto. Todas las muestras fueron filtradas en membranas 0.47 μm antes de ser inyectadas en el HPLC. La Figura 2a muestra el análisis HPLC de la piperina estándar y la Figura 2b, el extracto etanólico, en un tiempo de retención cercano a 2.7 min.

Figura 2 Análisis por cromatografía HPLC. 

Inicialmente, se preparó una curva de calibración a 1, 170, 350, 500 y 1000 ppm de piperina estándar. Con concentraciones superiores a 350 ppm se saturó el detector. Por tal, la linealidad se estudió en un rango de concentración 1 ppm-300 ppm. Se prepararon tres curvas de calibración de 1-100 ppm, 120-200 ppm y 220-300 pm. Mediante una prueba t-student se determinó que las pendientes de las tres curvas no diferían significativamente. Por tal motivo, se trabajó como una sola curva de 1 a 300 ppm. El coeficiente de determinación R2 para esta curva fue 0.995 que responde a la ecuación de regresión lineal como lo muestra la Figura 3.

Figura 3 Curva de calibración de rango lineal y linealidad de 1 a 300 ppm. 

En la precisión del método, la reproducibilidad se obtuvo inyectando 7 extractos aleatorios de ambos diseños experimentales y para la repetitividad se inyectó uno de los extractos escogidos 7 veces, independientemente, en el equipo de HPLC, todas por triplicado. Se realizó la comparación de la desviación estándar de la precisión con el valor hallado en la ecuación de Horwitz () para verificar la precisión del método. Se encontró que éste es preciso. Los resultados están expresados como desviación estándar relativa (RSD).

La sensibilidad del método, límite de detección (LDD) y límite de cuantificación (LDC), fue determinada realizando una pequeña curva de calibración de tres puntos 0.01, 1 y 5 ppm con piperina estándar. Los valores de los parámetros se muestran en la Tabla 3.

La exactitud del método se determinó dopando uno de los extractos con una cantidad conocida de piperina estándar (50%, 100% y 150%). El porcentaje de recuperación se calcula dividiendo el valor medio entre el valor real. Se realizó la prueba de t-student para determinar si había diferencias significativas entre la recuperación media y el 100%. Se encontró que el método es exacto. Cada muestra dopada se inyectó por triplicado. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

3.2 Efecto de dos diferentes disolventes

La selección del disolvente más adecuado para la extracción de los compuestos de interés de la muestra es un paso crucial para cualquier método de extracción, particularmente para extracción asistida por ultrasonido (UAE). Se evaluaron dos disolventes diferentes (etanol y hexano) para la extracción de piperina de la especie Piper tuberculatum por el método Soxhlet. La Tabla 5 muestra varias propiedades de los disolventes seleccionados (17).

Los parámetros de la extracción por Soxhlet se mantuvieron constantes. Tales como: 5 g de la muestra seca molida, temperatura alrededor de 100° C y proporción de sólido a disolvente de 1:40. El tiempo de extracción depende del diseño experimental.

Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 4. La máxima concentración de piperina se obtuvo en 1S (222.76 ppm - etanol) seguida por 2S (209.46 ppm - etanol) en comparación con 3S (66.62 ppm - hexano) y 4S (49.73 ppm - hexano). El rendimiento de la extracción se ve afectada por la polaridad y viscosidad del disolvente (17), como se observa en la Tabla 5. El índice de polaridad del etanol es mayor, por tal razón, reacciona con más afinidad con la piperina presente en la especie Piper tuberculatum en comparación con el hexano que es un disolvente apolar.

Figura 4 Efecto de diferentes disolventes en la concentración del extracto de Piper tuberculatum (Método Soxhlet proporción solido/disolvente 1:40, temperatura ~100°C). 

3.3 Efecto de potencia en ultrasonido

El efecto de dos diferentes potencias, i.e. 125 W y 175 W sobre la cantidad de piperina extraída de Piper tuberculatum asistida por ultrasonido a 20kHz están reportados en la Figura 5. Los resultados obtenidos a 175 W (3US - 216.59 ppm y 4US - 246.50 ppm) son mayores que a 125 W (1US - 210.11 ppm y 2US - 201.74 ppm). Con el aumento de la potencia de ultrasonido, existe mayor amplitud de las ondas que viajan a través del medio líquido y las burbujas colapsan de forma más violenta ¹⁸, lo cual conlleva a una mayor extracción. De igual forma, el aumento de tiempo en la zonificación también promueve mayor extracción en la muestra.

Figura. 5 Efecto de potencia de ultrasonido sobre la concentración de extracto etanólico de Piper tuberculatum (Método US proporción solido/disolvente 1:10, frecuencia 20kHz). 

En presencia de ultrasonido, la variación en el rendimiento de la piperina también se atribuye a su diferente solubilidad y las propiedades físico-químicas, es decir, la tensión superficial, la viscosidad y presión de vapor. Generalmente, la presión de vapor de los disolventes juega un papel importante en la generación de la cavitación y se ha encontrado que el disolvente de presión de vapor más baja genera pocas burbujas que implosionan, pero con una fuerza superior. De esta manera, el disolvente que tiene menor presión de vapor ayuda a extraer más soluto ¹⁷.

La cuantificación de la piperina por el método HPLC, mostró que la mayor concentración de piperina en los extractos se obtuvo vía ultrasonido (246.50 ppm 4US) y corresponde a un rendimiento de 24.65 mg/g.

3.4 Caracterización de la piperina aislada

En la Figura 6 se muestra el espectro IR, identificando las bandas más importantes de la piperina aislada de la extracción de pipilongo y en la Figura 7, se muestra el espectro RMN protónico de la piperina.

Figura 6 Espectro IR de la piperina. 

Figura 7 Espectro de la piperina (RMN 1H, 400 MHz, EtOD). 

Sólido amarillo. P.f 131-133°C. IR ν(cm-1): 3009.0 (=C-H, tensión), 1610.6-1581.6- 1491.0 (-C=C- Ar, tensión), 1631.8 (-CO-N, tensión). Grupo metileniendoxi: 2918.8- 2862.4 (-CH2 as,sim, tensión), 1435.0 (-CH2 flexión), 1249.9-1193.9 (=C-O-C as, tensión), 1030.0 (=C-O-C sim, tensión), 925.8 (C-O, tensión), 1134.1 (C-H, flexión), 995.3 (-CH=CH- trans, flexión), 846.8-829.4-804.3 (C-H 1-2-4-trisust, flexión). RMN 1H (400 MHz, EtOD) δ 1.63 (s, 4H). 1.71-1.74 (m, 2H), 3.69-3.64 (m, 4H), 6.01 (s, 2H), 6.67 (d, J = 14.6 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.11 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 7.39 (dd, J = 14.6, 10.4 Hz, 1H).

El espectro de Masas de la piperina se muestra en la Figura 8. La molécula de la piperina (Figura 1) tiene un peso molecular de 285 que corresponde al primer ion formado. La fragmentación molecular de los iones más representativos de la piperina se muestra en la Figura 9.

Figura 8 Espectro MS de la piperina (70 eV). 

Figura 9 Fragmentación molecular de la piperina. 

3.5 Caracterización de las vesículas

Los resultados del tamaño del diámetro hidrodinámico (nm) se muestran en la Figura 10. En la Tabla 6 se encuentran los valores del promedio Z, definido como la intensidad ponderada tamaño hidrodinámico medio de la colección de conjunto de partículas medido por difusión dinámica de luz (DLS) y los valores del índice de polidispersión (PDI), los cuales dan indicio sobre la diversidad de moléculas dentro de la emulsión. El PDI igual a 1 indica que las moléculas son del mismo tamaño (monodispersa) y éste se asocia a una distribución de tamaño de vesícula diferente ¹⁹.

Figura 10 Determinación de tamaño de partícula de vesículas MLV. 

El valor promedio Z del blanco es el menor, ya que son los liposomas preparados sin ninguna molécula dentro de su estructura coloidal. Por ello, el aumento de este promedio indica el encapsulamiento de material en su estructura.

El promedio de diámetro en los liposomas con extracto varía alrededor de 35 nm. Mientras mayor sea la concentración de piperina en los liposomas, menor es el promedio de diámetro hidrodinámico y menor PDI.

Se observó buen resultado en los liposomas preparados con 20 ppm de piperina. El valor promedio Z y el PDI son mayores, es decir que mostraron una mejor tendencia a encapsular todo el material de muestra y estar compuestos por liposomas de un solo tamaño ¹⁹, por lo cual, su curva en la Figura 10 es más ancha.

3.6 Actividad antioxidante: Ensayo con radical libre DPPH

El 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) es un radical libre estable con absorbancia característica entre 517-520 nm. Es uno de los sustratos comúnmente utilizados para evaluar la actividad antioxidante. Este ensayo se basa en la capacidad del DPPH de aceptar un radical de hidrógeno o de algún grupo R, resultando en la reducción de DPPH˙ (violeta) a DPPHH (amarillo). La disminución de la absorbancia, evidencia de la reducción del DPPH, se utiliza para evaluar el potencial de barrido del radical de las muestras ²⁰.

La capacidad de reducir radicales DPPH de la piperina presente en el extracto (4US) fue determinado mediante la absorción UV a 520 nm. La Figura 11 muestra el porcentaje de actividad inhibido en las diferentes concentraciones preparadas de extracto, piperina y sus respectivas vesículas MLV cargadas.

Figura 11 Determinación del porcentaje de actividad inhibitoria en el extracto, piperina, respectivas vesículas LV y quercetina frente al radical DPPH 0.2 mM 

En el extracto se observó un alto porcentaje de inhibición, mientras que en la piperina libre solo la muestra más concentrada exhibe un porcentaje significativo. Se calculó el valor IC50 (half maximal inhibitory concentration por sus siglas en ingles) en las muestras libres, Tabla 7.

El valor de IC₅₀ del extracto se comparó con la quercetina; un estándar de referencia preparado bajo las mismas condiciones. Este análisis mostró que el extracto de pipilongo posee una buena actividad antioxidante.

Experimentalmente, los resultados corroboran que la piperina no posee una actividad antioxidante significativa una vez es separada del extracto de la planta proveniente ^1,6.

Las muestras de extracto y piperina encapsuladas difieren en sus resultados. Mientras que en el extracto las vesículas logran atenuar casi por completo el porcentaje de inhibición protegiendo la muestra y previniendo la medida de actividad antioxidante, en la piperina las vesículas MLV tienden a mantener constante el porcentaje de actividad inhibitoria en las tres distintas concentraciones. Cabe resaltar que, en la muestra preparada con piperina libre, se tomó una alícuota directa de las soluciones para reaccionar con DPPH, a diferencia de los MLV que fueron diluidos, obteniéndose valores de absorbancias cercanas a la absorbancia de control (A₀). El valor de IC₅₀ para las vesículas cargadas con extracto no fue calculado, su porcentaje de actividad inhibitoria fue muy baja. Al igual que en la piperina libre, en las vesículas cargadas con piperina se obtuvo un promedio de IC₅₀ muy alto y desviación grande.