DESCRIPCIÓN Y DISCUSIÓN ACERCA DE LOS MÉTODOS DE ANÁLISIS DE FIBRA Y DEL VALOR NUTRICIONAL DE FORRAJES Y ALIMENTOS PARA ANIMALES

DESCRIPTION AND DISCUSSION ABOUT THE METHODS OF ANALYSIS OF FIBER AND OF THE NUTRITIONAL VALUE OF FORAGES AND FOODS FOR ANIMALS

Freimar SEGURA S.¹, Rosario ECHEVERRI F.¹, Arley C. PATIÑO Ll.¹ y Amanda I. MEJÍA G.^1*

¹ Grupo Biodegradación y Bioconversión de Polímeros -BIOPOLIMER, Facultad de Química Farmacéutica, Universidad de Antioquia. A.A. 1226. Medellín, Colombia.
^* Autor a quien se debe dirigir la correspondencia: amejia@quimbaya.udea.edu.co

Recibido: Noviembre 11 de 2006 Aceptado: Mayo 15 de 2007

RESUMEN

Es necesario contar con un mayor volumen de forrajes de adecuado valor nutricional mejorando así la cadena agroalimentaria y disminuyendo el uso extensivo de la tierra en cultivos para ganadería. Una alternativa la constituyen los procesos biotecnológicos con pastos mejorados por fermentaciones con hongos basidiomicetos, pero determinar el cambio en los componentes del forraje con el proceso de fermentación y su relación con el valor nutricional es complicado. Existen numerosas publicaciones sobre técnicas para evaluar componentes de un forraje; el sistema detergente es el más utilizado, aunque existen métodos más modernos. La accesibilidad y los costos de estos métodos son factores limitantes para muchos laboratorios. Algunos de ellos no están reconocidos como métodos oficiales de análisis. En este artículo se describe y discute especialmente el sistema detergente para evaluar el valor nutricional de alimentos para rumiantes, y las dificultades de interpretación. Se concluye que en el análisis de forrajes sometidos a procesos de biodegradación, los valores de lignina y celulosa por el sistema van Soest encontrados entre blancos y muestras, no corresponden al contenido total de lignina o celulosa de la muestra biodegradada. Se deben utilizar otros métodos más precisos como la espectroscopia IRTF (Infrarrojo con Transformada de Fourier) o la NIRs (Infrarrojo cercano) para caracterizar estas muestras.

Palabras clave: Fibra, análisis de los alimentos, esquema Van Soest, sistema de análisis Weende.

ABSTRACT

In order to improve the agroalimentary chain and to diminish the extensive use of land to grow crops for cattle raising, there is a need for greater availability of forages with adequate nutritional value. Biotechnological processes to improve grass by fermentation with basidiomycetes, are an alternative. However, it is difficult to determine the changes that take place in forage with the fermentation process. There are many reports on techniques to evaluate forage components. Of them, the detergent system is the most frequently used but more modern methods are also available. Accesibility and costs of the latter are limiting factors for many laboratories and some of the newer methods have not yet been officially approved. We describe and discuss the detergent system to evaluate the nutritional value of foods for ruminants, and the difficulties of its interpretation. In the analysis of forages exposed to biodegradation processes, we concluded that values of lignin and cellulose (van Soest system) found in blanks and specimens do not correspond to the real contents of these substances in the biodegraded specimen. More precise methods should be used such as IRTF spectroscopy (infrared with transformed of Fourier) or near infrared (NIRS) to characterize these specimens.

Keywords: Fiber, food analysis, van Soest scheme, Weende system of analysis.

INTRODUCCIÓN

Los métodos analíticos son muy importantes en investigaciones en nutrición puesto que constituyen la base para la interpretación de datos y, en consecuenci,a existen numerosas publicaciones con información disponible sobre técnicas para evaluar componentes de un forraje. Pero aparece una gran dificultad para seleccionar el método mas adecuado, porque defi nir la capacidad de un método, tanto desde el punto de vista analítico como de la interpretación de los resultados es tarea complicada, por tanto, la determinación del valor nutricional depende básicamente de la necesidad del investigador y del producto analizado según su composición teórica. Sin métodos confiables o significativos en la valoración nutricional se restringen muchos avances científicos. También, porque aunque es posible analizar la composición química de tejidos individuales de plantas, los requerimientos necesarios para su aislamiento limitan su uso solamente al desarrollo de investigaciones donde se justifica separarlos, porque consumen mucho tiempo y dinero.

El término fibra dietaria en nutrición humana se refiere a los componentes de los alimentos derivados de plantas que no son digeribles por los sistemas enzimáticos de los mamíferos (1) y no es el objeto de este artículo. En forrajes, normalmente en alimentación para ganado, fibra se refiere a las paredes celulares de las plantas (2,3,4,5), y está bien establecido que la rata de degradación ruminal de diferentes sustratos depende de la composición de la pared celular de la planta (5). La fibra es importante en ambos casos porque representa la porción orgánica de los alimentos que es más difícil de digerir; las fracciones de alimentos que no son fibras son fácil y casi completamente digeridas por la mayoría de las especies animales.

La fibra está constituida por celulosa, lignina, hemicelulosa, pectina, inulina, agar, quitina, gomas y silicatos; inclusive algunos autores incluyen como parte de la fibra algunos compuestos fenólicos, el ácido fítico y otros compuestos antinutricionales presentes en muy pequeñas cantidades en los alimentos (5,6). A la celulosa y a la hemicelulosa les corresponden los mayores porcentajes en la constitución de la fibra, las siguen la lignina y las pectinas que poseen en algunos alimentos porcentajes relativamente altos. El resto de los componentes no tienen especial importancia nutricional y no representan cuantitativamente cifras elevadas (6,7). Es necesario contar con ensayos rápidos y simples para determinar el contenido total de fibra insoluble en los alimentos para animales, pero con esta composición tan compleja, es una tarea difícil (8).

En este artículo de reflexión se describen y discuten los métodos analíticos conocidos por la comunidad científica para evaluar el valor nutricional de forrajes y alimentos para rumiantes, así como las dificultades de interpretación de los mismos en los desarrollos experimentales. Es el resultado de la revisión bibliográfica y la experimentación efectuadas durante el trabajo de grado para optar al título de magíster en Ciencias Farmacéuticas, de dos estudiantes del grupo de investigación BIOPOLIMER, de la facultad de Química Farmacéutica, en el marco del proyecto de investigación: Estudio del mejoramiento nutricional de un forraje tosco (pasto king grass), al utilizarlo como sustrato en la fermentación en estado sólido con varias especies de basidiomicetos, financiada por la red Alfa Caribiotec, la Universidad del Antioquia y el Sena.

COMPOSICIÓN FISICOQUÍMICA DE LA FIBRA

La pared primaria -P- de un tejido de una planta se observa en la figura 1. Está compuesta de fibrillas de celulosa, hemicelulosa y proteína con grandes cantidades de pectina formando una matriz viscosa que consolida toda la pared. A la izquierda en la figura 1, se muestra la relación entre células contiguas, en el centro se muestra una vista de un corte de las capas de la pared celular y a la derecha un esquema de la relación de lignina, hemicelulosa y celulosa en la pared secundaria. El diámetro de cada célula es aproximadamente de 25 μm.

La composición molecular varía entre tipos de células, tejidos y especies de plantas; una aproximación de peso seco podría ser 30% de celulosa, 25% de hemicelulosa, 35% de pectina y un 10% de proteína (9). Los componentes proteicos de la pared celular primaria son glicoproteínas ricas en hidroxiprolina, llamadas extensinas, que están involucradas en la arquitectura de la pared celular y en la resistencia de la planta a enfermedades (10,11).

La morfología básica de las paredes celulares de las plantas está determinada por la celulosa (9), polímero lineal de unidades de celobiosa anhidra (dímero de D-glucosa), formada por polimerización de moléculas de D-glucosa unidas en la posición β-1,4-enlace glicosídico, formando cadenas lineales planas que se unen entre sí, por puentes de hidrógeno y fuerzas de van Der Waals, dando lugar a microfibrillas (9,12,13,14) de gran estabilidad y baja digestibilidad en monogástricos puesto que su hidrólisis se da principalmente por acción de celulasas procedentes de los microorganismos ruminales.

La pared de la matriz que rodea la pared primaria está compuesta por hemicelulosa, proteína y pectina. Las hemicelulosas son mezclas de polímeros de diferentes polisacáridos neutros y acídicos. Èstos se adhieren a la superficie de las microfibrillas de celulosa por puentes de hidrógeno a través de los grupos OH de los azúcares y mejoran la resistencia de la pared celular. Los polisacáridos pécticos están covalentemente unidos a las hemicelulosas. Cuando algunos tipos de células maduran, una pared secundaria se deposita entre la pared primaria haciéndola más densa porque tiene menos agua unida (2,12). Las hemicelulosas son heteropolisacáridos formados por monómeros de carbohidratos como hexosas (D-glucosa, D-manosa, D-galactosa), pentosas (D-xilosa, L-arabinosa), deoxiexosas (L-ramnosa), y ácidos urónicos (D-ácido glucurónico, 4-O-metil- D-ácido glucurónico) (14). Por ser altamente ramificadas y poseer tantos grupos polares en los diversos azúcares, las hemicelulosas son fácilmente solubles en agua (6,13). Algunos investigadores han propuesto que las hemicelulosas, en asociación con la celulosa, influencian la organización de la lignina (12).

La lignina es un polímero que se diferencia notablemente de las otras macromoléculas constituyentes de la pared celular; es un polímero aromático tridimensional que rodea las microfibrillas de celulosa y a la hemicelulosa, con algunas uniones covalentes a la hemicelulosa (9,15). Es poco sensible al agua; es una red polimérica heterogénea, amorfa, ópticamente inactiva y altamente ramificada. La unidad básica estructural de la lignina es un fenilpropano. Las sustituciones sobre los anillos aromáticos de los monómeros y la proporción de estos precursores varían dependiendo del origen botánico y determinan el tipo de lignina. Las ligninas de monocotiledóneas, como cereales y pastos, están compuestas por unidades de coniferil alcohol, y trans-sinapil alcohol y por eso se conocen como “guayacil-siringil ligninas” aunque también contienen ciertas cantidades de ρ-coumaril alcohol que es un precursor del ρ-hidroxifenil (13,16).

Todos los pastos tienen ligninas que están acetiladas por ácido ρ-coumárico en la posición γ de las cadenas laterales de lignina, principalmente sobre las unidades de siringil; y también incorporan ferulatos que se entrecruzan con la lignina y con carbohidratos y tienen un impacto negativo en la disponibilidad de los polisacáridos para su utilización, por ejemplo, por microorganismos ruminales de animales rumiantes (17).

La lignina es completamente indigerible tanto para monogástricos como para poligástricos, y su determinación sirve para predecir la digestibilidad en materia seca y energía de un alimento (6), porque se encuentra envolviendo a la celulosa y hemicelulosa y restringe al acceso a estos carbohidratos, que sí pueden ser digeribles (14).

Como resultado de esta complejidad, el análisis de fibra puede proporcionar sólo datos de una composición promedio de las paredes celulares en un alimento y no puede informarnos la influencia de tipos individuales de tejidos sobre el desempeño rumiante. Los mamíferos no poseen las enzimas para hidrolizar el enlace predominante β 1-4 de los polisacáridos que se encuentra normalmente en las paredes de las plantas y dependen de microorganismos en el tracto gastrointestinal para fermentar estos polisacáridos a nutrientes absorbibles. Los rumiantes son herbívoros más especializados en utilizar esta relación simbiótica para explotar las paredes celulares de las plantas como fuente de nutrientes (18).

MÉTODOS DE ANÁLISIS PARA DETERMINAR EL VALOR NUTRICIONAL DE ALIMENTOS PARA ANIMALES

Uno de los sistemas de análisis de alimentos más importantes en investigación sobre nutrición de rumiantes (y cada vez más en investigación no rumiante) es el sistema análisis Fibra Detergente (19).

La historia de la fibra detergente

El pobre estado del análisis de alimentos para animales en los años 60, desencadenó el programa de investigación de Peter van Soest, en el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, el cual condujo al sistema detergente de análisis de alimentos. Van Soest logró convencer a la comunidad científica de remplazar el sistema Weende o de análisis proximal (20) por su sistema detergente. Remplazando fibra cruda (CF) y extracto libre de nitrógeno por solubles en detergente neutro (NDS), fibra detergente ácida (ADF), fibra detergente neutra (NDF) (las siglas se deben a su nombre en inglés) y lignina, fue posible explicar respuestas nutricionales en términos de digestibilidad y consumo de alimentos (19).

NDS constituye las fracciones completamente digeribles de carbohidratos y proteínas, así como lípidos y algunas cenizas; mientras que NDF representa la fibra estructural, la cual es sólo parcialmente digerible, y lignina es la fracción de NDF completamente indigerible.

El método para ADF dado a conocer en 1963 (21, 22) fue la primera publicación que realmente describía el sistema de análisis detergente. ADF rápidamente remplazó a CF en muchos laboratorios porque era un método más simple y daba valores similares en muchos forrajes. El procedimiento ADF fue aprobado por la Association of Official Analytical Chemist (AOAC) y no fue difícil estandarizarlo en los laboratorios. ADF aísla principalmente celulosa y lignina, pero no hemicelulosa, lo que lo hace inadecuado para medir la fibra estructural total. Cuando el procedimiento de análisis NDF fue publicado por primera vez en 1968 (23), ADF se hizo menos interesante para la formulación de alimentos y su uso empezó a disminuir lentamente, aunque todavía es utilizado. Hoy en día el principal uso de ADF es preparar un residuo bajo en proteína para el posterior análisis de lignina.

La publicación de Goering y van Soest en 1970 (24) fue la primera descripción detallada del método NDF para uso en el laboratorio. Unos diez años después salió a la luz otra publicación (25), donde fueron introducidas una serie de variantes para el análisis NDF incluyendo el uso de amilasa, y diez años después, una tercera publicación (26) presentó cambios adicionales, pero no recomendaba un solo método para todas las muestras de alimentos (19). La dificultad en la extracción y el lavado de los residuos fibrosos en algunos materiales y la variedad de modificaciones sobre el método NDF dieron la percepción de que NDF es difícil de medir con precisión. A pesar de todo, NDF ha remplazado enormemente a CF entre los científicos, pero CF de ningún modo es un método obsoleto; como NDF no era un método gubernamentalmente aprobado, CF continuó siendo usado en muchos países.

En los años 80, David Mertens (estudiante del doctorado dirigido por van Soest) inició esfuerzos para estandarizar el análisis NDF en los laboratorios de USA; él afirmaba que la única forma de reducir el error en los laboratorios era esencialmente prescribir un único método analítico para todo tipo de alimentos (19), porque ya para la época se habían propuesto modificaciones para extender su aplicación a granos, concentrados para animales y alimentos para consumo humano (26, 27, 28, 29, 30), muchas de las cuales fueron realizadas sin pruebas de desigualdad para determinar su conveniencia para todas las matrices de alimentos o aplicación práctica como métodos de rutina, lo que condujo a métodos para análisis de fibra que aunque diferían entre sí, todos ellos se llamaban NDF (8). Los esfuerzos de Mertens dieron como resultado algunas recomendaciones y finalmente, después de un largo proceso, salió una publicación de aprobación del método NDF por la AOAC en el 2002 con el uso de amilasa (aNDF) (8, 31). Sin embargo, esta publicación describe simplemente algunas variantes del procedimiento NDF, con o sin el uso de una amilasa estable al calor y con o sin la expresión de NDF sobre una base libre de cenizas. Se describe entonces que el almidón no es completamente removido en NDF, se recomienda el uso de amilasas (8); también que se puede utilizar sulfito de sodio para eliminar material proteínico de los residuos de fibra, pero se debe tener cuidado si se va a usar conjuntamente con amilasas (8). El AOAC Oficial Method 2002.04 establece que el análisis detergente neutro y a-amilasa se utiliza para disolver proteínas, lípidos, azúcares, almidones y pectinas fácilmente digeribles en los alimentos, dejando un residuo fibroso que consiste principalmente en componentes de la pared celular de las plantas (celulosa, hemicelulosa y lignina) y nitrógeno indigerible en productos para animales (31).

Resumiendo se puede decir que aunque es poco probable que todos los científicos se adhieran rigurosamente a los protocolos de Mertens, revistas como Animal Feed Science and Technology (3, 4, 5) recomiendan el uso del artículo de Mertens como la principal referencia para el análisis NDF; para el análisis ADF se recomienda usar el manual de la AOAC; y para lignina los análisis más comunes sobre los residuos ADF son el método directo con ácido sulfúrico y el método indirecto con permanganato (las mejores referencias sobre estos métodos están en (28)). En la Tabla 1 se presentan los usos y limitaciones para algunos de los principales métodos de análisis de fibra y paredes celulares usados para determinar la calidad de los forrajes y en nutrición animal. Cada método tiene sus propias fortalezas y debilidades. La elección de uno determinado depende los objetivos del proyecto de investigación o de las necesidades del usuario.

Caracterización de forrajes sometidos a procesos de biodegradación ligninolítica

El bajo “valor nutricional” de algunos forrajes se debe principalmente a la baja disponibilidad de los carbohidratos (no a su concentración) porque algunos, como el pasto King grass (32, 33), poseen un alto contenido de ellos, pero normalmente se encuentran paquetes de lignina envolviendo los carbohidratos como la hemicelulosa y celulosa y de esta manera impidiendo el acceso a ellos en el proceso de digestión de los rumiantes. Si se logra disminuir el contenido de lignina con respecto al de los carbohidratos, se facilitaría el acceso y asimilación de éstos. (34, 35, 36).

Los organismos de la naturaleza que han demostrado ser los más eficientes degradadores de la lignina son los hongos basidiomicetos de la podredumbre blanca de la madera, gracias a sus complejos sistemas enzimáticos (37, 38, 39, 40, 41, 42). Estos hongos, a su vez, también son capaces de degradar los carbohidratos disponibles en los residuos vegetales (43) y, por lo tanto, el método analítico que se use debe ser capaz de determinar qué componentes de la pared celular están descomponiendo. El sistema análisis Fibra detergente no es aconsejable porque tiene muchas limitaciones que conducen a sobreestimaciones o subestimaciones. El análisis de forrajes a los cuales se les quiere determinar cambios en su composición al ser tratados con hongos basidiomicetos que cambian la composición y la estructura de la lignina (44), se convierte entonces en el problema que se debe resolver.

Una de las principales limitaciones para el análisis de ADL de estos forrajes biodegradados es que en una etapa, específicamente al analizar ADF, una parte considerable de lignina es solubilizada, especialmente en pastos; no se conoce a qué estructuras corresponde exactamente esa parte de lignina soluble, ni si las estructuras de lignina que quedan después del proceso de degradación son más o menos solubles que las estructuras de lignina que existen en el pasto sin biodegradar (en la biodegradación se dan cambios estructurales en la lignina).

Por lo tanto, las diferencias entre los valores de lignina encontrados entre blancos y muestras analizadas por el esquema van Soest, no corresponderán realmente al contenido total de lignina del pasto biodegradado. También al calcular celulosa como ADF-ADL se corre el riesgo de sobreestimar los valores porque se puede solubilizar en mayor proporción parte de la lignina producto del tratamiento con los hongos que la lignina del pasto sin tratar, dando como resultado valores más bajos de ADL y, por lo tanto, valores más altos de celulosa.

Lo anterior sugiere que se deben utilizar otros métodos de análisis más precisos, como por ejemplo, análisis de Infrarrojo con Transformada de Fourirer (IR-TF) (52) y análisis de las áreas de algunas bandas características de la lignina con respecto a bandas características de carbohidratos o infrarrojo cercano (NIRS) (53). El principal objetivo del análisis espectroscópico IR es la determinación de los grupos funcionales químicos presentes en la muestra.

Diversos grupos funcionales químicos absorben en frecuencias características de la radiación IR y por medio de la utilización de varios accesorios para el muestreo. Los espectrómetros IR pueden aceptar una amplia gama de tipos de muestra tales como gases, líquidos, y sólidos. Así, la espectroscopia IR es una herramienta importante y popular para la aclaración estructural y la identificación de un compuesto. Presenta varias ventajas sobre otros métodos más tradicionales, entre las cuales se destaca el hecho de que las muestras no necesitan mucha preparación (algunos mg son suficientes) y no es un análisis destructivo.

Los cambios en la química de la madera, o de residuos lignocelulósicos resultantes de la degradación con hongos, han sido estudiados directamente en análisis gravimétricos (43, 54, 55, 56), espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (IR-TF) (56, 57, 58, 59, 60, 61, 62), espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) (63, 64, 65, 66), microscopía (67, 68), entre otros métodos.

Los métodos gravimétricos demandan una gran cantidad de tiempo y de reactivos, preparación de la muestra, cantidades relativamente altas de muestra y, además, los resultados obtenidos se ven afectados por muchas variables que analizamos aquí y algunas veces no reflejan las proporciones reales de los constituyentes de interés. Por esas razones, aunque la IR-TF es una técnica estrictamente limitada para proporcionar datos cuantitativos absolutos sobre los constituyentes de una muestra, está especialmente indicada para comparación entre espectros de muestras tratadas y de control incluidas dentro de un mismo experimento (60, 69).

CONCLUSIONES

Aunque en sí mismo el análisis de alimentos es un asunto extremadamente importante para las investigaciones sobre nutrición animal, desafortunadamente las investigaciones en este campo son con frecuencia poco valoradas y es raro que se destaquen publicaciones en nutrición animal sobre las técnicas y metodologías. Es común que estudiantes graduados desarrollen métodos analíticos o modificaciones en sus investigaciones de tesis, pero estos procedimientos, por lo general, se encuentran muy resumidos y subsumidos en otras publicaciones (19).

Existen métodos modernos para analizar la fibra y sus componentes, pero la accesibilidad a ellos y sus costos son factores limitantes para muchos laboratorios, en especial en países en desarrollo, impidiendo su implementación como métodos de análisis rutinarios. Además, algunos de ellos no están reconocidos como métodos oficiales de análisis y por esta razón se sigue utilizando ampliamente el sistema análisis detergente, que aunque no determine exactamente la composición real de los diferentes componentes de las paredes celulares, se utiliza como punto de partida para predecir la digestibilidad o para calcular los componentes que lleva una formulación.

IR-TF y NIRs son técnicas muy utilizadas para estudiar la química de los residuos lignocelulósicos, ya que se requiere mínima preparación de la muestra, son necesarias muy pequeñas cantidades de muestra para el análisis (unos pocos miligramos) (52) y el tiempo de análisis es muy corto. Un simple cambio en la composición del sustrato se puede reflejar en un patrón complejo de cambios en diferentes regiones del perfil IR-TF ó de NIRs que de esta manera permiten reconocer patrones de la degradación de la madera de una forma más simple (60, 69).

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad de Antioquia, a la RED ALFA CARIBIOTEC, al SENA y al programa de Gestión Tecnológica de la Vicerrectoría de Extensión de la Universidad de Antioquia, por la financiación de la investigación.

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