FARMACOLOGÍA Y TOXICOLOGíA

El presente estudio analiza el contenido de cannabinoides en muestras de Cannabis sativa L. cultivadas ilícitamente en Colombia. En primer término se optimizan las condiciones para la extracción y cuantificación de Cannabidiol (CBD), Δ9-tetrahidrocannabinol (THC) y Cannabinol (CBN) a partir de una muestra vegetal mediante cromatografía de gases con detector de ionización de llama (CG-FID), validando el respectivo método analítico. Se analizan muestras procedentes de cuatro regiones colombianas (región de los Llanos Orientales, LL; región del Cauca, CA; región de la Sierra Nevada de Santa Marta, SN; región del Eje Cafetero, EC) , determinando cuantitativamente la presencia de CBD, THC y CBN. El contenido promedio de THC en las muestras de la región LL es de 15.74 % ± 2.92, en la región CA de 10.98% ± 6.70, en la región SN de 2.81% ± 1.72 y en la región EC de 1.87% ± 1.25. El alto contenido de THC en las muestras vegetales de Cannabis de los Llanos Orientales y el Cauca podría ser indicativo del empleo de variedades mejoradas, lo cual genera una gran preocupación en torno a los mayores efectos potenciales de la droga entre los consumidores.

Palabras clave:Cannabis sativa, marihuana, cannabidiol, cannabinol.

The present study analyzes the cannabinoids content in samples of Cannabis sativa L. cultivated illicitly in Colombia. The physicochemical conditions are optimized for the extraction and quantification of Cannabidiol (CBD), 9-Tetrahidrocannabinol (THC) and Cannabinol (CBN) starting from a vegetable sample using gas chromatography with flame ionization detector (GC-FID), validating the respective analytic method. Samples coming from four diferent Colombian regions are analyzed (Llanos Orientales, LL; Cauca, CA; Sierra Nevada de Santa Marta, SN; Eje Cafetero, EC). The study let determination of CBD, THC and CBN samples quantitatively. The average content of THC in the samples of the region LL is of 15.74% ± 2.92, in the region CA is of 10.98% ± 6.70, in the region SN is of 2.81% ± 1.72 and in the region EC of 1.87 % ± 1.25. The higher content of THC in vegetable samples of Cannabis from the Llanos Orientales (LL) and Cauca (CA) could be indicative of the employment of improved varieties. This fact generates a great concern about the potential effects produced by the drug in consumers.

Key words: Cannabis sativa, marihuana, cannabidiol, cannabinol.

La marihuana (C. sativa) es una planta originaria de las planicies de Asia central, difundida en todo el globo terráqueo gracias a la intervención humana, cuyo periodo vegetativo es cercano a un año. A causa de su rápida propagación y adaptabilidad ambiental, la Cannabis tuvo un gran impacto en las expresiones de diversas culturas (1). El principal ingrediente psicoactivo de la Cannabis es el Δ-9-tetrahidrocannabinol (THC), uno de los setenta cannabinoides (compuestos producidos exclusivamente por la Cannabis), de los más de 480 compuestos que se han identificado en esta planta (2). Aproximadamente el 4% de los 162 millones de consumidores de drogas en el planeta, emplean Cannabis cada año, haciendo de ésta la droga ilícita más ampliamente usada (3).

El cultivo en el territorio colombiano de C. sativa L., comúnmente denominada marihuana, tuvo su auge en la década del 70 ocupando principalmente las regiones de la Sierra Nevada de Santa Marta, la Guajira y los Llanos Orientales. Su producción ilegal con fines de exportación decreció en la década del 80 debido a la migración de la industria ilícita del narcotráfico hacia la producción y comercialización de cocaína. Sin embargo, la producción de marihuana se ha mantenido para abastecer el mercado local y también se ha detectado su comercialización ilegal hacia el exterior, según la Dirección Nacional de Estupefacientes-DNE (4). La información de la Dirección de Antinarcóticos de la Policía Nacional indica que el 95% de la marihuana producida en el país es para consumo interno; sin embargo, en el último año se ha incrementado el número de incautaciones de marihuana colombiana hacia el exterior, principalmente hacia Centroamérica (5). Según las cifras del Programa Presidencial para afrontar el consumo de Drogas-Rumbos (6), para el año 2001, en Bogotá, la marihuana ocupó el segundo lugar entre las sustancias de más impacto en los consumidores, esto es desde la perspectiva del usuario la sustancia que, después del alcohol, causa mayor problema entre las drogas de abuso; además la Cannabis es la tercera sustancia de inicio o entrada al consumo de drogas, con un 18.8% del total de los casos.

Actualmente el estudio forense de muestras decomisadas de C. sativa se basa en la determinación cualitativa de THC presente en los extractos obtenidos a partir de muestras vegetales, sin que se realice un análisis, a nivel cuantitativo, de dicho componente y de algunos otros cannabinoides presentes en muestras incautadas. Como consecuencia, en la actualidad no se cuenta con información sistemática que permita determinar los contenidos de THC presentes en las muestras vegetales de C. sativa que se comercializan ilícitamente en Colombia, información fundamental para monitorear los potenciales niveles de THC presentes en las muestras vegetales que fuman los consumidores de marihuana.

Muestreo

Para el análisis se recolectaron muestras vegetales de Cannabis en cultivos ilícitos ubicados en cuatro regiones geográficas diferentes, a saber: Llanos Orientales (LL), Cauca (CA), Santa Marta (SN) y Eje Cafetero (EC). Cada muestra comprendió trece plantas. Las muestras fueron recolectadas mediante arrancado en los sitios de cultivo, los cuales eran de difícil acceso. Para su remisión al laboratorio fueron envueltas en hojas de papel, y estas, a su vez, en cajas de cartón. A continuación se especifican los sitios de muestreo de cada región:

LL: Plantas recolectadas en el departamento del Meta, municipio de Lejanías.
CA: Plantas recolectadas en el departamento del Cauca, municipio de Carinto, vereda Las Guacas.
SN: Plantas recolectadas en el departamento del Magdalena en inmediaciones de la Sierra Nevada de Santa Marta (SN).
EC: Plantas recolectadas en el departamento de Caldas, área rural del municipio de Riosucio.

Preparación de muestras y método deextracción

La preparación de las muestras vegetales incluyó secado a 65°C durante 16 horas (7), selección de las hojas (separando tallos, flores y semillas), molienda de las hojas, tamizaje (malla 1.4 mm) y almacenamiento en nevera bajo condiciones de ausencia de luz. Una vez preparadas, se procedió a tomar 100 mg de hoja de Cannabis, y a cada muestra se le adicionó como estándar interno difenilhidramina (DFH), 500 µL de una solución de 1000 ppm de DFH en etanol, y posteriormente se realizó la extracción.

Cada muestra se sometió a tres extracciones, empleando en cada una 750 µL de etanol absoluto, aplicando ultrasonido durante siete minutos, para luego centrifugar a 4000 rpm durante 10 min. Los sobrenadantes de cada muestra eran posteriormente transferidos a un balón aforado de 5.00 mL, enrasando con etanol absoluto.

Análisis de los extractos

Las soluciones así obtenidas fueron analizadas, obteniendo la identificación cualitativa de CBD, THC y CBN por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM), teniendo como criterios de identificación el tiempo de retención relativo y el análisis del espectro de masas. Para ello se contó con los respectivos patrones de CBD, THC y CBN. La cuantificación de los citados cannabinoides se efectuó mediante cromatografía de gases con detector de ionización de llama (CG-FID), los respectivos resultados se expresaron en base seca. La validación del método cuantitativo incluyó parámetros cromatográficos, tales como selectividad, linealidad, precisión, exactitud, rango lineal de cuantificación y los límites de detección y de cuantificación.

Análisis por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM)

El análisis por CG-EM se realizó en un cromatógrafo Agilent® HP 6890 acoplado a un espectrómetro de masas HP 5973 con automuestreador. Se empleó Helio UAP como gas de arrastre a un flujo de 1 mL/min y una columna DB-1 (30 m × 0.25 mm × 1.00 µm). Temperatura del horno 240°C. Las temperaturas del puerto de inyección, fuente de iones, cuadrupolo e interfase fueron 260, 250, 150 y 280°C, respectivamente. Modo de inyección split (5:1). Volumen de inyección: 1.0 µL. Se empleó un sistema de automuestreador. El detector selectivo de masas se operó en el modo de ionización electrónica, con un potencial de ionización de 70 eV. El rango de masas detectado fue de 40 a 550.

Análisis por cromatografía de gases con detector de ionización de llama (CG-FID)

El análisis por CG-FID de los extractos se llevó a cabo en un equipo Varian® CP-3800. Se empleó helio como gas de arrastre (5.0 mL/min) y una columna OV-1 (30 m × 0.53 mm × 0.50 µm). Temperatura del horno 260°C. Temperatura del Inyector 280°C, Temperatura del detector 290°C. Modo de inyección split (5:1). Volumen de inyección: 1.0 µL. Cada extracto se analizó por triplicado.

Análisis por CG-EM

El estudio de los extractos por CG-EM permitió identificar los cannabinoides CBD, THC y CBN. Los tiempos de retención y los espectros de masas de los componentes del extracto coincidieron con los obtenidos para cada uno de los respectivos patrones.

Validación del método de cuantificación de cannabinoides

Para validar el método empleado en la determinación cuantitativa de cannabinoides (CG-FID) se tuvo en cuenta la determinación de los parámetros cromatográficos, la linealidad, la precisión y la exactitud, el rango lineal de cuantificación y los límites de detección y de cuantificación.

En la tabla 1 se presentan los valores obtenidos para los parámetros cromatográficos del análisis por CG-FID. Los tiempos de retención relativos (trr) se calcularon respecto al THC. En cuanto al número de platos teóricos (N) generados durante la separación de los analitos, el CBN presentó 13009, el CBD 10111 y el THC 8755. El CBN presentó un factor de respuesta (FR) mayor comparado frente al CBD y al THC, compuestos que presentaron factores de respuesta relativamente similares. Los valores de resolución (Rs) obtenidos para CBD- THC (3.89) y THC-CBN (3.35) fueron mayores que el criterio de aceptación de 1.5, por lo que se puede considerar el método como selectivo para los analitos dados.

Tabla 1. Validación de parámetros cromatográficos de los cannabinoides.

En cuanto a la linealidad, para cada uno de los cannabinoides de interés CBD, THC y CBN, se prepararon diez curvas de calibración en el rango lineal aproximado de 15 a 300 ppm y una concentración de estándar interno (DFH) de 100 ppm, aproximadamente. Mediante regresión lineal se hizo la evaluación de las curvas para obtener el coeficiente de correlación, la pendiente y el intercepto. Para cada uno de los cannabinoides, las pendientes y los interceptos, no presentaron diferencias significativas, por lo cual las ecuaciones de las curvas para CBD, THC y CBN se calcularon a partir de los valores promediados (Véase tabla 2).

Tabla 2. Parámetros para estimar linealidad de las curvas de calibración de los cannabinoides.

Para descartar la posibilidad de errores sistemáticos se hizo la comparación al forzar la curva de calibración a pasar por el origen o dejándola libre. En ambos casos se obtuvieron valores de pendiente y factor de correlación sin diferencias significativas.

Para determinar la precisión, o sea la dispersión de las medidas alrededor de su valor medio, se practicó una serie de diez mediciones en condiciones de precisión intermedia (variando el analista) sobres soluciones de CBD, THC y CBN, conteniendo como estándar interno DFH dentro de los rangos lineales establecidos. Para los tres analitos considerados en todos los niveles los datos de la desviación estándar relativa fueron menores que los pronosticados por la ecuación de Horwitz (PRSD(R)=2C-0.15), lo cual indica que las dispersiones obtenidas experimentalmente se encuentran dentro de los rangos aceptados para cada concentración. Además, los valores obtenidos para los coeficientes HORRAT(r), varían entre 0.26 y 0.68 para CBD, entre 0.29 y 1.08 para THC, y entre 0.32 y 0.72 para CBN; para los tres cannabinoides, estos coeficientes están dentro del intervalo recomendado para ensayos intralaboratorio, esto es valores entre 0.3 y 1.3.

Puede concluirse, entonces, que el método de análisis para CBD, THC y CBN ofrece precisión.

Respecto a la exactitud, para los tres cannabinoides considerados, al aplicar el test de Student, comparando los datos obtenidos (t_exp) con el valor crítico tabulado para nueve grados de libertad (t_tab), en un intervalo de confianza del 95%, se puede decir que es aceptable, porque en ninguno de los tres niveles de concentración se superó el valor tabulado (Véase tabla 3). Por otra parte, los porcentajes de recuperación (%R) y la desviación relativa (%B) para CBD, THC y CBN en los niveles bajo, medio y alto, están dentro de los rangos permitidos, ésto es, para un componente nominal mayor de 10% un intervalo de recuperación entre 98 y 102%.

Tabla 3. Evaluación de la exactitud del método de cuantificación de cannabinoides.

Estas dos pruebas permiten concluir para el análisis de CBD, THC y CBN que el método posee la exactitud requerida en los rangos bajo, medio, alto y que no hay evidencia de errores sistemáticos.

Finalmente, respecto al rango lineal de cuantificación y a los límites de detección y de cuantificación de cada analito: los rangos lineales de concentración para el conjunto de cannabinoides fueron similares, al igual que los límites de detección y de cuantificación (Véase tabla 4).

Tabla 4. Rango lineal de concentración y límites de detección y de cuantificación.

Aunque los límites de detección de los tres cannabinoides presentan valores muy similares, la sensibilidad es menor para la detección de THC ya que éste presenta un límite de cuantificación mayor en relación al CBD y el CBN.

Contenido de cannabinoides en muestras provenientes de diferentes regiones del país

Una vez validado el método de cuantificación, se procedió a la determinación cuantitativa de cannabinoides en las muestras de interés. A continuación se presentan los respectivos resultados.

Las muestras de la región LL presentaron la mayor concentración de cannabinoides. En todas las muestras de esta región el cannabinoide mayoritario fue el THC, el cual varió entre 13.37 y 17.63%, siendo el contenido promedio de 15.74%. El CBD fue el segundo cannabinoide con un promedio de 1.86%, y variando su contenido entre 0.92 y 4.14%, y el CBN fue el minoritario, con un promedio de 0.68%, y variaciones entre 0.56 y 0.80% (Véase figura 1).

Figura 1. Contenido de cannabinoides en las muestras recolectadas en la región Llanos Orientales.

Por su parte, el contenido de cannabinoides en las muestras recolectadas en la región CA fue menor al de la región LL. En la totalidad de estas muestras el cannabinoide mayoritario fue el THC, el cual varió entre 6.72 y 15.48%, siendo el contenido promedio de 10.98%. El CBD fue el segundo cannabinoide, con un promedio de 2.52%, con variaciones entre 0.60 y 4.86%, y el CBN fue el minoritario (valores entre 0.05 y 0.17%, promedio de 0.11%) (Véase figura 2).

Figura 2. Contenido de cannabinoides en las muestras recolectadas en la región Cauca.

El contenido promedio de los tres cannabinoides analizados en las muestras recolectadas en la región de SN se muestra en la figura 3. En todas las muestras el cannabinoide mayoritario fue el THC, que varió entre 1.89 y 4.00%, siendo el contenido promedio de 2.81%; el CBD fue el segundo cannabinoide con un promedio de 1.86% y variando su contenido entre 0.29 y 2.40%. El CBN fue el minoritario con un promedio de 0.05% y variando entre 0.04 y 0.06%.

Figura 3. Contenido de cannabinoides en las muestras recolectadas en la región de Santa Marta.

Finalmente, en las muestras recolectadas en la región EC, el cannabinoide mayoritario fue el THC (contenido promedio de 1.87%), el cual varió entre 1.11 y 3.17%. A diferencia de las tres regiones anteriores, el CBN fue el segundo cannabinoide con un promedio de 1.36%, variando su contenido entre 0.83 y 1.94%, y el CBD fue el minoritario, con un promedio de 0.02%, y variaciones entre 0.01 y 0.06% (Véase figura 4).

Figura 4. Contenido de cannabinoides en las muestras recolectadas en la región Eje Cafetero.

El anterior conjunto de resultados permite observar dos tipos de muestras; aquellas con concentraciones altas de THC (región LL, 15.74% y región CA, 10.98%), y otras con bajas concentraciones de THC (región SN, 2.81% y región EC, 1.87%). Cabe mencionar que los contenidos de THC encontrados en las regiones LL y CA superan notablemente el reportado en trabajos anteriores para muestras de Cannabis provenientes de nuestro país, de entre 2.5 y 3.9% (8).

El alto contenido de THC presente en las muestras vegetales de Cannabis de las regiones LL y CA podría ser indicativo del empleo de variedades mejoradas, considerando que a nivel mundial no están certificadas variedades sin manipulación genética con un contenido superior al 7% en THC (5). Esto genera una gran preocupación en torno a los mayores efectos potenciales de la droga entre los consumidores (9).

Para poner en evidencia esta preocupación, podemos considerar que un cigarrillo de marihuana se fabrica con 500 mg de hierba (tamaño promedio reportado para los consumidores en Norteamérica) (10); de tal forma, la dosis de THC potencialmente disponible para un consumidor podría variar considerablemente, dependiendo de la zona de procedencia de la marihuana empleada. El cálculo respectivo se presenta en la tabla 5.

Tabla 5. Dosis de THC potencialmente disponible en un cigarrillo de marihuana.

Con base en este cálculo, un cigarrillo de marihuana procedente de la región LL contendría casi nueves veces la cantidad de THC presente en uno elaborado con material vegetal procedente de la región EC. Con tan marcadas diferencias puede preverse que la presencia en el mercado de productos de alta potencia (sobre todo si se tiene en cuenta que esta situación no es previsible por los consumidores), entraña un alto riesgo, al igual que cualquier producto con una concentración de ingredientes activos desconocida. Si bien es posible que los consumidores de Cannabis sean capaces de "autoregularse" (regular su nivel de intoxicación moderando el consumo), esa capacidad no está tan desarrollada en los principiantes.

El valor DL₅₀ reportado para THC por inhalación en ratas es de 42 mg/kg de peso corporal (11), y está lejos de la cantidad presente en un cigarrillo, dado que dicha dosis es difícil de alcanzar vía inhalación. Esto explica que no se hayan documentado casos fatales por el consumo de marihuana (12). Sin embargo, la Cannabis de alta potencia hace efecto con una o dos "inhalaciones", e incluso teniendo en cuenta la rapidez con que aparecen los efectos, una hierba más potente supone un mayor riesgo de intoxicación. Esto limita aún más la posibilidad que tienen los consumidores en la práctica de calibrar su dosis de THC (13).

Finalmente, todas las pruebas indican que, a pesar del incremento de la potencia en muchos mercados, el tamaño de los cigarrillos de Cannabis no ha disminuido en los últimos años. De hecho, los datos de que se dispone sugieren que en muchos mercados importantes los cigarrillos han aumentado de tamaño. Unos cigarrillos de mayor tamaño, una droga de potencia cada vez mayor y la ausencia de pruebas de que se hayan producido otros cambios en las pautas de consumo sugieren un aumento del consumo de THC (3).

Dado que el consumo habitual de Cannabis puede ocasionar efectos tales como ataque de pánico, paranoia, delirio y episodios sicóticos y teniendo en cuenta los altos contenidos de THC encontrados en las muestras LL y CA, existe la posibilidad de que un mayor número de personas expuestas a esta droga sufra este tipo de problemas. Por otra parte, se ha sostenido que los síntomas problemáticos causados por el uso de marihuana pueden incrementarse por la creciente disponibilidad de Cannabis de gran potencia, lo que ha ocasionado que más consumidores hayan requerido tratamiento y asistencia especializada.

Este estudio permite evidenciar que hace falta información para una estimación más exacta de las consecuencias inherentes a los consumidores de Cannabis en Colombia; se necesitan datos científicos sobre la presencia en el mercado de variedades más potentes, lo que podría conseguirse con la caracterización de las muestras de Cannabis en los laboratorios forenses, mediante una metodología normalizada.

En cuanto a la demanda se precisa más información sobre las dosis y los volúmenes de Cannabis utilizados por los consumidores ocasionales y habituales.

El método empleado para cuantificar cannabinoides presentes en muestras de hojas de Cannabis sativa L. (CG-FID), permitió la determinación cuantitativa de cannabidiol (CBD), Δ9-tetrahidrocannabinol (THC) y cannabinol (CBN), con límites de cuantificación de 1.68, 2.44 y 1.76 ng, respectivamente.

En la totalidad de muestras en estudio el canabinoide mayoritario fue el THC.

Las muestras procedentes de la región de los Llanos Orientales presentaron el mayor contenido de THC (superior al 15%), seguidas de las procedentes de la región Cauca (mas de 10%). Caso contrario, las muestras que presentaron un menor contenido de THC fueron las procedentes de Santa Marta (inferior a 3%) y el Eje Cafetero (inferior al 2%).

El alto contenido de THC en las muestras procedentes de las regiones Llanos Orientales y Cauca permite sugerir que en el país se están cultivando variedades de C. sativa mejoradas.

Los autores agradecen al Departamento Administrativo de Seguridad —DAS, a la Fiscalía General de la Nación y a la Dirección de Investigación sede Bogotá —DIB de la Universidad Nacional de Colombia por el apoyo prestado al presente trabajo.

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* Autor a quien debe dirigir la correspondencia: nmflorianr@unal.edu.co