FARMACOLOGÍA Y TOXICOLOGÍA

Con el fin de estudiar la variación en las señales cromatográficas inducidas por las matrices de análisis (efecto matriz), se estudian tres matrices bióticas de diferente naturaleza (Lactuca sativa L., Physalis peruviana L., y Solanum tuberosum) y un grupo de plaguicidas de diferentes características fisicoquímicas, organoclorados, organofosforados y piretroides, entre otros. Los análisis se realizan por medio de un cromatógrafo de gases con detección simultánea por microcaptura electrónica (μECD) y nitrógeno-fósforo (NPD), acoplados en paralelo. En este estudio se evalúa el efecto matriz por medio de análisis de covarianza y regresión lineal, y se encuentra que cerca del 75% de los plaguicidas estudiados presentan variaciones en la respuesta cromatográfica con respecto a las señales en solvente. Por otro lado se encuentra que la naturaleza de la matriz afecta la respuesta cromatográfica de 18 de los 33 plaguicidas, mientras que la cantidad de matriz inyectada influye en la respuesta de sólo 13 de ellos.

Palabras Clave: matriz, plaguicidas, cromatografía de gases.

In order to study the matrix-induced chromatographic response enhancement (matrix effect), we select three different types of biotic matrices (Lactuca sativa L., Physalis peruviana L. and Solanum tuberosum) and a group of pesticides of different physicochemical characteristics including organochlorine, organophosphorus and pyrethroids pesticides. These pesticides are determined by gas chromatography by electronic microcapture detector (μECD) and nitrogen-phosphorus detector (NPD), coupled in parallel. This study evaluates the matrix effect by analysis of covariance and linear regression. There are nearly 75% of the studied pesticides which have variations in the chromatographic response compared to solvent signals. Furthermore, we notice that the nature of the matrix affect the chromatographic response of 18 of the 33 pesticides and the amount of matrix injected affects the response of only 13 pesticides.

Keywords: matrix, pesticides, gas chromatography.

En el análisis de residuos de plaguicidas, la necesidad de contar con técnicas analíticas selectivas, sensibles, robustas, y que cubran un gran número de compuestos con diferentes propiedades fisicoquímicas señalan las técnicas cromatográficas como la alternativa más viable. Las dos técnicas cromatográficas más empleadas son la cromatografía líquida de alta eficiencia y la cromatografía de gases de alta resolución. Esta última ha sido la más utilizada en las últimas tres décadas (1).

En el análisis de plaguicidas mediante cromatografía de gases es común encontrarse con variaciones en la respuesta, inducidas por componentes de la matriz. En general, estos fenómenos se caracterizan por aumentar la señal cromatográfica de algunos de los compuestos en estudio (2-7). Una de las principales causas de este fenómeno la constituyen los diferentes tipos de sitios activos que se pueden encontrar a lo largo del sistema cromatográfico, especialmente en la zona del inyector, responsables de la adsorción y/o descomposición térmica de ciertos analitos (2). La naturaleza de estos sitios activos se atribuye a impurezas de metales o grupos silanol, que se pueden encontrar en las superficies de la columna y del vaporizador (8). Por otro lado, este fenómeno se evidencia al comparar la respuesta cromatográfica de un analito en solvente con la de un analito a la misma concentración en una muestra real, donde puede observarse que en muchos casos la señal del analito en solvente resulta ser inferior hasta en un 95% (9). En la figura 1 se ilustra el mecanismo por el cual se dan diferencias entre las respuestas en solvente y en matriz. Al inyectar los analitos en presencia de componentes de la matriz, la cantidad de estos que se transfieren a la columna resulta ser mayor que al inyectar la misma cantidad de analitos en solvente (C-X < C-Y). Este fenómeno se debe a un proceso de competencia entre los analitos y los componentes de la matriz por los sitios activos presentes en el sistema cromatográfico.

Figura 1. Adsorción de compuestos en el vaporizador del inyector cromatográfico. o Analitos de interés Diferentes componentes de la matriz,donde C corresponde a la concentración del analito y X y Y corresponden al número de moléculas que se adsorben (C-X < C-Y). Modificado de Hajslová J, Zrostlíková J. 2003 (2).

En la mayoría de los laboratorios se ha optado por el empleo de curvas de calibración en blancos de matriz, lo cual evita la sobreestimación en los resultados cuantitativos (10,11). La principal desventaja de esta práctica es el notorio deterioro del sistema cromatográfico, debido a la introducción de componentes no volátiles que generan nuevos sitios activos ocasionando que los analitos de interés sean adsorbidos. De otra parte, la inyección de matriz ocasiona pérdida en la resolución de la columna y coelución, por lo que se hace necesario el empleo de sistemas cromatográficos más complejos, como cromatografía bidimensional o cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (12, 13).

En este documento se presentan los resultados del estudio del efecto matriz, en el cual se estudiaron algunas de las principales variables que afectan el proceso de adsorción y/o descomposición en el puerto de inyección, entre las cuales se encuentran la concentración del analito, la naturaleza de la matriz, las propiedades fisicoquímicas del analito y la cantidad de matriz inyectada (2).

Materiales de siembra

El compost ruminal (comercial) y el suelo agrícola para siembra fueron suministrados por el Grupo Interdisciplinario de Estudios Moleculares. La información detallada sobre las características fisicoquímicas del compost y el suelo se presentan en la tabla 1.

Las semillas de B. dictyoneura (familia Poacecae) fueron adquiridas en una casa comercial (Agrosemillas S.A), con pureza del 96%, germinación 80%. Las semillas se almacenaron en la oscuridad, con humedad relativa del 30% y temperatura de 4°C, para inhibir su germinación y mantener su viabilidad. Las siembras se realizaron en materas plásticas (59 cm de largo x 13 cm de alto x 12 cm de ancho), con capacidad de 4 Kg. El suelo agrícola se suplementó con compost a razón de 30 toneladas/hectárea (8).

Toxicidad y acumulación de Cd y Hg

La toxicidad y acumulación de Cd y Hg sobre B. dictyoneura se llevó a cabo evaluando el efecto de la concentración de los metales en el intervalo (1-125 mg Kg^-1), en un tiempo de exposición de 50 días. En la tabla 2 se observan diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) en los contenidos de Cd y Hg, al aumentar la concentración de 1 mg Kg^-1 a 25 mgkg^-1 en el sustrato, que se reflejó en el incremento de la acumulación en la planta; sin embargo, no se presentó diferencia estadísticamente significativa (p>0,05) entre el control (en ausencia del metal) y el tratamiento con respecto al crecimiento y coloración de la plántula, como se muestra en la tabla 3, lo que demuestra que B. dictyoneura es tolerante a estas concentraciones. Este efecto también ha sido observado en Solanum nigrum tratado con Cd y As, planteándose un mecanismo similar al de Brassica juncea y Pteris vittata (10), Brassica napus (11), Thlasp caerulescens (12) tolerantes a Cd. Con Hg se ha planteando un mecanismo para Arabidopsis thaliana (13) Brassica juncea (14) que les permite ser tolerantes a Hg.

Tabla 2. Análisis cuantitativo de Cd y Hg en B. dictyoneura.

Tabla 3. Efecto de Cd y Hg sobre el crecimiento de B. dictyoneura.

Los mecanismos de tolerancia a altas concentraciones de metales pesados en plantas son conocidos como acumulación y exclusión (10). La estrategia de acumulación consiste en que la planta acumula en mayor proporción el contenido del metal en tejidos diferentes a la raíz, transportándolo a la semilla. La estrategia de exclusión consiste en transportar el metal por el xilema, desde la raíz hasta la hoja, y eliminarlo por volatilización (10). En la figura 1, para el Cd a 125 mg Kg^-1, se observó incremento en la acumulación y disminución en el tamaño de B. dictyoneura, del 65%. Esta disminución puede describirse como un retraso en el crecimiento de B. dictyoneura por efecto tóxico del Cd sobre el modelo.

Figura 1. Efecto Cd y Hg en las características morfológicas de B. dictyoneura. (A) Control. (B) Tratamiento con Cd (125 mgkg^-1). (C) Tratamiento Hg (125 mgkg^-1).

Para el Hg a 125 mg Kg^-1 presentó disminución en la acumulación del metal pero no se observó diferencia estadísticamente significativa (p>0,05) en el tamaño de B. dictyoneura entre control y tratamiento, lo que indica que tiene mayor tolerancia a Hg que a Cd. Las estrategias utilizadas en el mecanismo de tolerancia a Hg a partir de esta concentración pueden ser: restricción de la entrada de Hg por la raíz o exclusión de Hg de la planta por volatilización (13).

Cinética de transferencia de cadmio

La cinética de transferencia de Cd hacia B. dictyoneura se llevó a cabo evaluando el comportamiento del suelo que contenía Cd a una concentración de 5 mg Kg^-1. En la figura 2 se observa una disminución gradual en el contenido de Cd, presentando una correlación estadísticamente significativa (p>0,05) entre el tiempo de exposición y el contenido de Cd en el suelo, con un coeficiente de correlación del 0,97 y describiendo para este comportamiento una cinética de orden cero expresada en la ecuación 1.

Figura 2. Efecto del tiempo de exposición de B. dictyoneura en suelo dopado con compost y Cd a 5 mgkg^-1: (•) planta, (o) suelo. Porcentaje de error del 5%.

Con respecto al contenido de Cd se observó un aumento, presentando una correlación estadísticamente significativa (p>0,05) entre el tiempo de exposición y el contenido de Cd, con un coeficiente de correlación del 0,99. Se describe para este comportamiento un modelo expresado en la ecuación 2.

Durante los 50 días de exposición de B. dictyoneura al tratamiento con Cd, se observó una continua absorción del metal, que indicaba una transferencia del suelo a la planta proporcional al tiempo de exposición.

Cinética de transferencia de mercurio

Para estudiar la cinética de transferencia de Hg sobre B. dictyoneura se evaluó el suelo inoculado a 5 mgkg^-1. En la figura 3 puede evidenciarse una disminución gradual en el contenido de Hg en el suelo en los primeros 20 días de exposición. Entre los días 20 y 30 permaneció constante (p>0,05), y a partir del día 30 continúa la disminución. Con respecto al contenido de Hg en la planta se observa absorción acumulativa de Hg hasta el día 30, entre los días 20 y 30 no se halló diferencia estadísticamente significativa (p>0,05), presentando una absorción constante. A partir del día 30 se observó disminución en el contenido de Hg en la planta, lo que indica que la estrategia utilizada por B. dictyoneura como mecanismo de tolerancia al Hg, es más de exclusión que de restricción de la entrada de este metal por la raíz, ya que el suelo muestra pérdida gradual de Hg en el tiempo.

Figura 3. Efecto del tiempo de exposición de B. dictyoneura en suelo dopado con compost y Hg a 5 mgkg^-1: (•) planta, (o) suelo. Porcentaje de error: 5%.

Considerando a las propiedades físicas del Hg se ha planteado que este elemento puede reducirse de mercurio divalente (Hg²⁺) a mercurio metálico (Hg⁰), volatilizándose por transpiración. Esta fitoreducción constituye un mecanismo de detoxificación (14).

La eficiencia de la fitorreducción de Hg parece ser el resultado de una coordinación óptima de la transferencia y la transformación bioquímica de iones de mercurio a vapor de Hg⁰. Sin embargo, esta transferencia parece que no sólo depende de la dinámica del flujo de la transpiración sino, además, de una circulación lenta entre los componentes estructurales de la planta; así, la capacidad y la cinética de acumulación del mercurio compiten con el transporte en el flujo de transpiración, por lo que puede requerir algún tiempo para el equilibrio en el xilema, antes de que se inicie la reducción en las hojas (13), hecho que se puede percibir entre los días 20 y 30, donde el contenido de Hg permanece constante, y posteriormente, la disminución en la planta se da a lo largo de 30 días.

Los resultados de este estudio mostraron que B. dictyoneura tiene un mecanismo de tolerancia para Cd, basado en estrategia de acumulación, ya que se encontró que el 23% del Cd absorbido por la planta se encuentra en la raíz y el 77% restante, distribuido entre tallo y hojas. También indican que B. dictyoneura tiene un mecanismo de tolerancia para Hg, probablemente implementando estrategias de acumulación y exclusión, dado que esta planta tolera mercurio por su capacidad de acumular y disminuir la concentración en suelos contaminados.

Estas características permiten considerar a B. dictyoneura como modelo biológico de nuevas alternativas en fitorremediación, teniendo en cuenta, para el caso de mercurio, que debe hacerse recolección de la planta antes de la perdida de mercurio por volatilización.

En el caso del cadmio, este estudio podría presentar a B. dictyoneura como un modelo bioindicador importante en el tratamiento de suelos contaminados, debido a su capacidad acumulativa del Cd.

Los autores agradecen a la Universidad de Antioquia por el financiamiento de esta investigación.

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* Autor a quien debe dirigir la correspondencia: gmontoya@farmacia.udea.edu.co