ALIMENTOS: CIENCIA, TECNOLOGÍA E INGENIERÍA

El presente estudio evaluó la capacidad antioxidante y el contenido de vitamina E en fresas fortificadas con vitamina E sintética (dl-α-tocoferol acetato) por la técnica de impregnación al vacío. La vitamina fue cuantificada por HPLC y sus niveles registrados por cada 100 g fruta fresca. La capacidad antioxidante se determinó durante el almacenamiento, en muestras envasadas con y sin vacío, por los métodos DPPH●, FRAP y Folin-Ciocalteau. El proceso de impregnación en la fresa permitió alcanzar niveles de 19,12 ± 3,01 mg de dl-α-tocoferol acetato/100 g de fruta fresca, sin que el tiempo de almacenamiento ni el tipo de envasado ocasionaran efectos significativos en ella. Estos resultados fueron coherentes con el incremento de la capacidad antioxidante expresados como valores DPPH●, FRAP y Folin-Ciocalteau de 14,7%, 82,2% y 56,8%, respectivamente. Los resultados reflejaron la potenciación de la capacidad antioxidante de la fresa por el efecto de la incorporación de la vitamina E mediante el proceso de impregnación al vacío.

Palabras Clave: alimentos funcionales, fresa, antioxidantes, ingeniería de matrices

This study evaluated the antioxidant capacity and vitamin “E” content in strawberries fortified with synthetic vitamin E (dl-α-tocopherol acetate) by vacuum impregnation technique. The vitamin is quantified by HPLC and their levels are recorded per 100 g fresh fruit. The antioxidant capacity was determined during storage in samples packaged with and without vacuum, by the methods DPPH, FRAP and Folin-Cicalteau. The impregnation process can achieve levels in strawberry of 19.12 ± 3.01 mg of vitamin E dl-α-tocopherol acetate/100 g in fresh fruit, with no significant effect over time of storage or the type of packaging. These results were consistent to increased antioxidant capacity as values DPPH, FRAP and Folin-Cicalteau in the order of 14.7%, 82.2% and 56.8% respectively. In general, the results reflect a strengthening of the antioxidant capacity of strawberries, by the effect of vitamin E incorporated by the vacuum impregnation process.

Keywords:Functional foods, strawberry, antioxidants, matrix engineering.

Los productos vegetales, como las frutas y las hortalizas, representan una alternativa importante como fuente potencial de antioxidantes porque contienen una variedad de compuestos químicos muy activos, en bajas concentraciones, principalmente polifenoles como los f lavonoides y carotenoides (antocianinas, catequinas, catsantina, quercetrinas, luteínas, b-caroteno, α-caroteno, licopeno, entre otros (1-4). Los antioxidantes son sustancias que disminuyen las reacciones de oxidación causadas por el oxígeno atmosférico en diferentes biomoléculas. La oxidación provoca cambios en los atributos de calidad, disminuyendo la vida útil de numerosos productos de las industrias de los alimentos, los cosméticos y los polímeros.

El interés en las propiedades antioxidantes de las frutas es reciente. Algunos autores han evaluado la capacidad atrapadora de radicales libres y el contenido de fenoles de algunas frutas tropicales, como mora, mango de azúcar, guayaba, granadilla, fresa, maracuyá, uchuva, lulo, piña y mortiño, entre otros (1, 5, 6).

Las tendencias mundiales en alimentación en los últimos años indican un interés acentuado de los consumidores hacia aquellos alimentos que, además de su valor nutritivo, aporten beneficios a las funciones fisiológicas del organismo humano. Estos alimentos entran en la gama de los alimentos funcionales (AF) (7).

Los AF son alimentos naturales o elaborados que no sólo tienen características nutricionales, sino que además ejercen funciones específicas sobre la salud, actuando como agentes que previenen o reducen el riesgo de contraer enfermedades (8, 9). El sistema regulatorio japonés los reconoce “alimentos de uso específico para la salud” (foods for specific health use, FOSHU), e identifica once categorías de ingredientes con actividad fisiológica, entre ellos los antioxidantes (10). El incremento en el consumo de frutas y hortalizas en los últimos años está asociado con una baja incidencia de enfermedades degenerativas, cáncer, enfermedades del corazón, inf lamación, artritis, disminución del sistema inmunológico, trastorno cerebral y cataratas (3).

Los tocoferoles son los principales compuestos que exhiben actividad de vitamina E, y los antioxidantes naturales más importantes permitidos para uso en alimentos, que atrapan los radicales libres. Éstos son especies muy inestables con un electrón desapareado que puede reaccionar con cualquier otra molécula, como ácidos grasos de las membranas de las células, proteínas, vitaminas y ácidos nucleicos de los genes, etc. (11). La vitamina E es un compuesto fisiológicamente activo (CFA), muy escaso en la mayoría de las frutas, que puede incorporarse en matrices alimentarias con características porosas a partir de la ingeniería de matrices, utilizando la técnica de impregnación a vacío (IV) (12). La ingeniería de matrices permite la rápida transferencia de masa al interior de las estructuras, de disoluciones, dispersiones o emulsiones, dando lugar a nuevos alimentos con características organolépticas y propiedades funcionales y nutracéuticas mejores (13, 14).

La fresa es un fruto perteneciente a la familia Rosaceae. Se considera alimento nutraceútico, por ser una buena fuente de compuestos antioxidantes especialmente hidrosolubles, como antocianinas, ácidos fenólicos, vitamina C, entre otros, que tienen funciones específicas como protectores de la oxidación de muchos organelos (15, 16). Se ha encontrado, en ratas, que una buena suplementación con jugos de fresa reduce la propagación de tumores del esófago (17). El ácido elágico y sus derivados, de alta concentración en la fresa, son preventores químicos que actúan estimulando la detoxificación de enzimas y previniendo la interacción de especies carcinogénicas con el ADN (18, 19).

El objetivo del presente estudio fue evaluar la incidencia de la incorporación de la vitamina E en la potenciación de la capacidad antioxidante de la fresa utilizando la ingeniería de matrices como metodología de obtención de alimentos funcionales a través de la técnica IV.

Fresas

Se utilizaron fresas enteras de la variedad Camarrosa, cultivadas en el municipio de Santa Rosa de Osos, Antioquia, Colombia. Los frutos recolectados tenían grado de madurez 5, según la Norma Técnica Colombiana NTC 4103/97 (20), exhibían características homogéneas de color, tenían un peso aproximado de 12,0 ± 2,0 g, y fueron almacenados a 4ºC.

Reactivos capacidad antioxidante

DPPH (1,1-difenil–2-picrilhidracil), 2, 4, 6-tri (2-piridil) triazina (TPTZ), de Aldrich Chem. Co (Millw WI), reactivo de Folin Ciocalteau, metanol, fosfato ácido de sodio de Merck (Darmstadt Germany), y agua grado HPLC.

Impregnación al vacío

Los ensayos de IV se llevaron a cabo en un sistema conformado por una cámara de vidrio acoplada por medio de mangueras sanitarias a un eyector, el cual proporcionó un vacío de 8,4” Hg (presión barométrica local = 25,4” Hg), y fue monitoreado durante 15 minutos en dos etapas: en la primera, las fresas fueron sumergidas en la emulsión y sometidas a vacío durante 10 minutos en la cámara de impregnación; en la segunda etapa, se restableció la presión atmosférica durante 5 minutos. Las fresas impregnadas fueron empacadas con vacío (CV) y sin vacío (SV) y almacenadas a 4ºC durante 9 días.

Extracción y cuantificación de vitamina E

Las frutas frescas e impregnadas fueron sometidas a un procedimiento de extracción y cuantificación de la vitamina E, según el método de Kmostak y Kurtz, 1993 (22), modificado por Cortés, 2004 (23). La cuantificación de la vitamina E se determinó por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en un equipo Agilent 1100. Las condiciones de operación fueron: columna Synergi 4 μm Hydro-RP 80 (código 00G-4375-E0), dimensiones 250 x 4,6mm ID; fase móvil (acetonitrilo:metanol, 75:25), velocidad de f lujo 2 mL/min, método: isocrático, temperatura: ambiente (25°C), detector: UV visible a 280 nm. La curva de calibración se determinó a partir del estándar de referencia dl-αtocoferol acetato 99,9% (Supelco).

Preparación de los extractos de fruta

Para cada ensayo sobre la capacidad antioxidante, las muestras se prepararon con la parte comestible de la fruta a diferentes concentraciones. La fresa se extrajo con una solución acuosa de Tween 80 (1% p/p), NaCl (0,05% p/p). Las muestras fueron homogenizadas, filtradas y centrifugadas a 3.500 rpm durante 20 minutos.

Contenido de fenoles totales

La determinación de fenoles se efectuó por el método colorimétrico de Folin-Ciocalteu modificado por Palomino et al., 2009 (24). Se construyó una curva patrón usando como estándar ácido gálico. Se diluyó el extracto a una concentración en la cual el contenido de fenoles se ajustó al intervalo de la curva patrón. A 50 μL de extracto se adicionaron 800 μL de agua y 100 μL de reactivo de Folin–Ciocalteau y se incubó por 6 minutos, luego se agregaron 50 μL de solución de Na₂CO₃ (20% m/v) y se dejó reaccionar durante 60 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se realizó la lectura a 765 nm, y los resultados fueron expresados como mg de ácido gálico/100 g de extracto.

Actividad atrapadora del radical libre DPPH

El DPPH● es un radical estable de color violeta, cuya absorbancia disminuye al ser reducido por un antioxidante (AH):

La capacidad antioxidante de los extractos de fresa se cuantificó midiendo el grado de decoloración de una disolución metanólica de DPPH● (20 mg/L), a una longitud de onda de 515-517 nm (25). El ensayo se llevó a cabo utilizando 100 μL de extracto y 900 μL de la solución de DPPH ●. Cada tratamiento se evaluó por triplicado, y como referencia del reactivo se usó la misma cantidad de DPPH ● y 100 μL del solvente de la muestra. Después de 30 minutos de reacción a temperatura ambiente y en la oscuridad, se leyó la absorbancia a una longitud de onda de 517 nm. La curva de referencia se construyó usando trolox como patrón primario. Los resultados se expresan como equivalentes trolox (TEAC).

Ensayo FRAP (Ferric Reducing/Antioxidant Power)

Este ensayo se llevó a cabo en un buffer ácido acético-acetato de sodio (pH 3,4) que contiene TPTZ y FeCl₃ (26). Se utilizaron 900 μL de ésta solución, 50 μL de muestra y 50 μL de agua destilada. Después de 30 minutos de reacción se determinó la absorbancia a una longitud de onda de 593 nm. Para cada muestra se tuvo en cuenta la lectura de la absorbancia del blanco sin cromóforo, de la misma manera que en las pruebas anteriores. La curva de referencia se construyó usando ácido ascórbico como patrón primario. Las actividades de las muestras en estudio se expresaron como valor FRAP (mg de ácido ascórbico/100 g de muestra) o capacidad antioxidante expresada como equivalentes de acido ascórbico (AEAC).

Análisis estadístico

Los resultados fueron analizados a través de una ANOVA, utilizando el método LSD (mínimas diferencias significativas) como método de comparaciones múltiples, con un nivel de confianza del 95% (α=0,05). El análisis de varianza realizado con el paquete estadístico STATGRAPHICS PLUS versión 5.1. Las muestras evaluadas se denominarán así: fresas frescas (FF), fresas recién impregnadas (FIV-0), fresas impregnadas envasadas al vacío y almacenadas 9 días (FIV-CV), fresas impregnadas envasadas sin vacío y almacenadas 9 días (FIV-SV).

Evaluación de la vitamina E

La determinación analítica por HPLC de los componentes con actividad de vitamina E identificó los tiempos de retención en 11,27 y 12,94 minutos, para RRR-α-tocoferol (vitamina E natural) y dlα-tocoferol acetato (vitamina E sintética) respectivamente. El resultado obtenido para la F-F como RRR- α-tocoferol fue: 0,27 mg/100 g de F-F.

La figura 1 presenta los valores medios con intervalos LSD (95%) de la concentración de vitamina E (C_Vit.E) para los diferentes tratamientos expresados, como mg dl-α-tocoferol acetato/100 g de F-F. El ANOVA no presentó diferencias significativas por efecto del factor envasado (CV y SV), ni por el tiempo de almacenamiento, gracias a la estabilidad de la vitamina E sintética y a la protección que ofrece está matriz al servir como medio de encapsulamiento de la vitamina E ante los factores externos de degradación (oxidación, luz, temperatura, entre otras) (19). Por esa razón, para analizar la inf luencia del proceso de impregnación se calculó un promedio de los valores de C_Vit.E obtenidos para las FIV-0, FIV-CV y FIV-SV, y se obtuvo una concentración de 19,12 ± 3,01 mg de vitamina E sintética/100 g F-F.

Figura 1. Concentración de vitamina E sintética/ 100 g F-F, para los diferentes tratamientos. F-F: fresa fresca, FIV-0: fresa recién impregnada, FIV-9 fresa impregnada a tiempo 9 días.

Los resultados ref lejan la efectividad de la metodología de la ingeniería de matrices al aplicar la técnica de impregnación al vacío para la obtención de alimentos funcionales fortificados con vitamina E. Esta metodología ha sido aplicada en otras matrices alimentarias, como mangos y manzanas, obteniendo también resultados satisfactorios (14, 23).

Evaluación de la capacidad antioxidante de fresa

La figura 2 representa los valores medios con intervalos LSD (95%) para la evolución de la capacidad antioxidante de fresa en función de la impregnación y del almacenamiento durante 9 días con y sin vacío. La actividad antioxidante se expresó como la capacidad para atrapar el radical libre DPPH● (valores TEAC, umoltrolox/100 g muestra), la capacidad para reducir el ión Fe³⁺ por el método FRAP (valores AEAC, mg ácido ascórbico/100 g muestra), y el contenido de fenoles totales (mg ácido gálico/100 g muestra).

Figura 2. Evolución de la capacidad antioxidante con DPPH, FRAP y contenido de fenoles totales. F-F: fresas frescas, FIV-0: fresas recién impregnada, FIV-CV: fresas impregnadas envasadas con vacío y almacenadas 9 días, FIV-SV: fresas impregnadas envasadas sin vacío y almacenadas 9 días, a.a: ácido ascórbico, a. gal: ácido gálico.

La eficiencia de la IV con vitamina E para la fresa se puede apreciar en el significativo aumento de cada uno de los valores de la actividad antioxidante, determinada por las diferentes metodologías para las F-F y FIV-0. Dicho incremento se debe a la presencia de vitamina E, que inmediatamente expresa su capacidad reductora y atrapadora de radicales libres. La capacidad antioxidante en las FIV-0 respecto a las F-F aumenta en un 14,7% en valores TEAC por el método DPPH●; los valores AEAC por el método FRAP aumentan en un 82%, mientras que los fenoles totales por el método de Folin Ciocalteu incrementan en un 56,8%.

Se puede observar que todas las formas de medir la capacidad antioxidante son afectadas de forma diferente por la presencia de la vitamina E; sin embargo, los valores AEAC por la técnica FRAP son más sensibles, y se puede sugerir esta técnica como método de trabajo para monitorear los efectos de la IV de frutas en futuras investigaciones. La variación de los valores en las matrices de trabajo se debe al efecto del aumento de vitamina E al impregnar.

Por otro lado, se observa que el factor tiempo de almacenamiento afecta significativamente la capacidad antioxidante de las fresas, encontrándose una disminución en el contenido de fenoles totales y en los valores TEAC por DPPH● y AEAC por FRAP. Este fenómeno se asocia principalmente con la degradación de compuestos propios del fruto, tales como: el ácido ascórbico y elágico; antocianinas tipo p-cumaroil-glucosa, dihidroflavonol, quercetin-3glucoronido, kampferol y kampferol-3-glucoronido (27, 28), y a la oxidación de los fenoles mayoritarios a bajas presiones de oxígeno.

Este resultado se puede concebir de manera independiente cuando la impregnación se realiza con vitamina E sintética, la cual es muy estable a las condiciones experimentales del estudio. La actividad antioxidante puede igualmente estar afectada por la permeabilidad al O₂ del empaque utilizado. Incluso bajo presiones reducidas de oxígeno, las enzimas polifenoloxidasas (PPO) tienen una alta actividad en fresa y pueden consumir compuestos fenólicos, como ácido elágico, y de antocianinas tipo p-cumaroilglucosa, dihidroflavonol, quercetin-3-glucoronido, kampferol y kampferol-3-glucoronido, entre otros, generando productos del pardeamiento enzimático que tienen muy poca actividad antioxidante (27-29).

La mayor disminución de la actividad antioxidante se encuentra en los valores AEAC por la técnica FRAP; un método específico para medir la capacidad reductora, que en este caso ref leja los mayores cambios en el proceso de conservación, porque puede medir no sólo la degradación del ascórbico sino también la oxidación de los compuestos fenólicos y polifenólicos presentes en las fresas.

El pH de la fresa, correspondiente a 3,25, resulta conveniente en la determinación de la capacidad antioxidante por cualquiera de los métodos; para el ensayo FRAP, que se realiza a pH= 3,6, podría incrementar el potencial redox del medio manteniendo la solubilidad del hierro (Fe⁺³), que reacciona con el agente reductor (30); además, a estos valores de pH, puede haber mayor expresión de los compuestos polifenólicos que pueden ser hidrolizados bajo esas condiciones (31). Para el método DPPH, cuyo mecanismo funciona por transferencia de hidrogeno, las condiciones de pH bajas favorecen la protonación del grupo fenólico.

El proceso de IV se presenta como una meto-ología efectiva de fortificación de fresas con vitamina E, alcanzando niveles de 19,12 ± 3,01 mg de l- α-tocoferol acetato /100 g de F-F, sin sufrir en u estabilidad por efecto de los factores tiempo y ipo de envasado. La capacidad antioxidante en las resas está afectada por el proceso IV de vitamina E, ue incrementan un 14,7% los valores TEAC por el método DPPH●; un 82% los valores AEAC por el método FRAP; y un 56,8% los fenoles totales por el método de Folin Ciocalteu. La disminución de la capacidad antioxidante de las fresas impregnadas durante el almacenamiento se asocia principalmente con la poca efectividad del empaque utilizado, porque la permeabilidad al oxígeno y la presencia de polifenolasas provoca reacciones de pardeamiento enzimático, lo cual contribuye a la degradación de compuestos propios del fruto, como el ácido ascórbico, el ácido elágico, y de antocianinas tipo p-cumaroil-glucosa, dihidroflavonol, quercetin-3glucoronido, kampferol y kampferol-3-glucoronido, compuestos que individualmente constituyen buenos agentes reductores y atrapadores de radicales libres. Aunque las técnicas DPPH, FRAP y fenoles totales no miden directamente la participación de los compuestos fenólicos en las reacciones de pardeamiento enzimático inducido por polifenolasas, sí evalúan la oxidación de las fresas, y pueden ser buenos indicadores del estado redox de las muestras, especialmente la técnica FRAP la más sensible, muy posiblemente debido al pH del medio.

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* Autor a quien debe dirigir la correspondencia: brojano@unal.edu.co