BIOTECNOLOGÍA

El Fusarium oxysporum Link es el causante de la pudrición basal en el cardamomo. En el presente trabajo se evalúa el efecto fitotóxico del filtrado crudo del hongo, para seleccionar variantes somaclonales de cardamomo resistentes al mismo en pruebas de patogenicidad en invernadero. Mediante los resultados de mortalidad se seleccionaron el clon 5 y el aislado 4 como los de mayor interacción de susceptibilidad – virulencia. De plántulas madres mantenidas en medio de crecimiento acelerado, se inocularon mensualmente 25 plántulas con diferentes concentraciones del filtrado, causando mortalidad en las primeras semanas. A partir de la semana 6, sólo un 32% resistieron el incremento de concentración. Para el décimo ciclo de inoculación, el 100% de plántulas permanecían en el filtrado crudo sin diluir, demostrando que a más tiempo en medio de crecimiento acelerado y mayor presión de selección, incrementando la concentración del filtrado, mayor probabilidad habrá de obtener variantes somaclonales con resistencia in vitro a Fusarium oxysporum.

Palabras Clave:Fusarium oxysporum, cardamomo, fitotoxinas, variación somaclonal, presión de selección.

Fusarium oxysporum Link is the cause of basal rotting in cardamom. The present article evaluates the phytotoxical effect of of the fungus crude filtrate,for selecting somaclonal variations of cardamom that showed resistance in greenhouse pathogenicity tests. According to mortality test results clone 5 and the isolated 4 were pointed with the most susceptibility-virulence interaction. From accelerated growth media seedlings there were selected 25 and inoculated with different concentrations of filtrate, causing mortality on the initial weeks. By the sixth week only a 32% resisted the concentration increment. By the tenth cycle of inoculation 100% of seedlings remained in the crude filtrate without dilutions. The more time the seedlings remain in accelerated growth media and the more selection pressure increasing filtrate concentration show increased probability of getting somaclonal variants with in vitro resistance of Fusarium oxysporum.

Keywords: Fusarium oxysporum, cardamom, phytotoxin, somaclonal variation, selection pressure.

El cardamomo es una hierba perenne perteneciente a la familia de las Zingiberaceae, y de la cual sólo se usan las semillas. Es oriunda de las selvas tropicales de la India meridional, Sri Lanka, Malasia y Sumatra. Actualmente se cultiva también en Nepal, Tailandia y América Central, y es Guatemala el mayor productor mundial (1). Entre sus componentes activos se encuentra un 4% de aceites volátiles, incluidos el terpineol, el cineol, el limoneno, el sabineno y el pineno, almidón y ácidos grasos (1). Gracias a estos componentes, el cardamomo es carminativo, estimulante, antiespasmódico, y aromático, y ha adquirido gran importancia en las industrias alimentaria y farmacológica (1).

Una de las mayores limitantes del cultivo del cardamomo (Elettaria cardamomum) es la pudrición de la raíz, que se destaca entre las enfermedades más importantes causadas por el hongo Fusarium sp (2), especie F. oxysporum, considerado a nivel mundial como el agente causal de la enfermedad (3). Se sabe que las pérdidas en la producción por causa de esta enfermedad superan en ocasiones el 40%, lo cual constituye un gran problema para la rentabilidad del cultivo.

Su control se basa en el uso de fungicidas, que hacen poco atractivo el producto ahora que se impone el consumo de alimentos saludables, es decir de “nula trazabilidad con agroquímicos”.

A pesar de estas medidas la producción sigue afectada. El control de fitopatógenos implica el uso de agropesticidas, que incrementa notablemente los costos de producción, además de contribuir al deterioro del medio ambiente. Es necesario encontrar otras alternativas de manejo de esta enfermedad. Dentro de los diferentes métodos estudiados en otros cultivos, se ha considerado la selección de variedades para plantar en el huerto, las cuales, además de adaptarse a la región, deben demostrar su alta productividad, calidad excelente y resistencia al ataque del hongo, de modo tal que demanden sólo moderadamente el uso de agroquímicos.

Sin embargo, aún no se generan protocolos para el cardamomo que permitan adelantar programas de este tipo, y conduzcan a la obtención de un variante somaclonal. Constituye todo un reto la labor de aplicar una metodología biotecnológica y verificar la interacción hospedante – patógeno, y la selección de aquellas poblaciones de plántulas tolerantes o resistentes al factor de presión (fitotoxinas), con el fin de regenerarlas, esperando que su comportamiento in vitro sea el mismo que el de las plantas adultas en campo, y convertirlo en una alternativa rápida y confiable que pueda ser adoptada en un programa de mejoramiento genético de dicha planta.

El empleo de fitotoxinas extraídas de varios fitopatógenos de importancia comercial, conducentes a la obtención de material resistente a enfermedades a través de procesos de selección in vitro, es una técnica ampliamente utilizada desde hace varias décadas, con resultados exitosos en varias especies vegetales (4-6).

Algunas investigaciones confirman la inhibición del crecimiento de Colletotrichum gloeosporioides cuando el micelio del hongo se inocula en macerado de tejido embriogénico de plantas previamente seleccionadas por su resistencia a toxinas de tipo pectinasas (7) o metabolitos secundarios (8) presentes en filtrados crudos del mismo hongo. Se confirma así la existencia de compuestos antifúngicos generados por el vegetal y directamente implicados en los mecanismos de defensa de tejidos seleccionados.

Rappaport y Pullman, 1983 (9), Orton et al., 1984 (10), Paugliuso et al., 1988 (11), han hecho estudios tendientes a determinar la reacción de materiales, en los cuales se informa haber obtenido resistencia al ataque de Fusarium sp (12), utilizando técnicas de suspensiones celulares en especies como apio o alfalfa. También hay informes de resistencia en cultivos de tomate, con hongos como Colletotrichum gloeosporioides (6), y en apio con Septoria apiicola (13).

Los resultados de dichos trabajos indican que, en estas condiciones, los cultivos mencionados se destacan por su baja susceptibilidad a la enfermedad. Lo anterior demuestra que la selección in vitro puede generar variantes somaclonales genéticas o epigenéticas con algún grado de resistencia a la enfermedad causada por el patógeno in vivo. Estudios de laboratorio y campo con diferentes especies confirman la existencia de variantes somaclonales resultantes de procesos de selección, cuya progenie conserva las características de resistencia adquiridas en la fase de cultivo de tejido (5, 14).

Con miras a contribuir desde otra perspectiva a encontrar materiales resistentes a la marchitez causada por F. oxysporum, este trabajo tuvo como objetivo principal evaluar el método de selección in vitro usando tejidos somáticos diferenciados de cardamomo contra el filtrado crudo de F. oxysporum para obtener, al menos, un clon con resistencia inducida in vitro a sus metabolitos tóxicos, y consolidó la metodología del crecimiento acelerado para generar variantes somaclonales de cardamomo que permitan la selección in vitro contra toxinas de hongos fitopatógenos y, por ende, la obtención de materiales resistentes a estos.

Material fúngico

Los aislados de F. oxysporum se obtuvieron de cormos de cardamomo con síntomas típicos de marchitamiento o pudrición radical, donados por la empresa Cultivares S.A. De ocho aislamientos axénicos del hongo se obtuvieron cultivos monospóricos, que al cabo de doce días de crecimiento fueron utilizados para pruebas de patogenicidad en invernadero.

Pruebas de patogenicidad en invernadero.

Se trabajó con plántulas de entre ocho y doce meses de establecimiento in vitro y ocho semanas de endurecimiento, correspondientes a los clones 5 y 9 donados por Cultivares S. A. al Laboratorio de Micropropagación de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín que, después del establecimiento in vitro, los suministraron para la investigación.

Todos los aislados monospóricos del hongo fueron evaluados en cada clon de cardamomo, para estimar la interacción virulencia susceptibilidad; cada bioensayo tuvo cuatro réplicas y su respectivo testigo. La inoculación de las plántulas se hizo escindiendo los ápices radicales y sumergiéndolos en una suspensión de esporas de 1x10⁶ durante una hora, al cabo de la cual las plántulas se sembraron individualmente en materas con suelo esterilizado.

Pasados ocho días de la siembra, las plántulas se fertilizaron con N.P.K., para garantizar que los síntomas expresados se debieran a efectos patogénicos y no a carencias nutricionales. Tres meses después se cosecharon, disectaron y evaluaron según cinco variables respuesta. La figura 1 muestra: clorosis foliar, longitud de la raíz, longitud del vástago, número de hojas y necrosis de haces vasculares. Fueron seleccionados el clon 5 como el más susceptible, y el aislado 4 del hongo como el de mayor virulencia. En las figuras 1a y 1b aparecen las variables respuestas mencionadas.

Figura 1. (a). Efecto fitotóxico de Fusarium en plántulas de cardamomo en relación con el testigo. (b). Diferencia de crecimiento entre las plántulas con inoculación de Fusarium oxysporum L. (derecha), y sin ella (izquierda). (c). Segmentos disectados para evidenciar el avance del hongo por los haces en plántulas infectadas. (d). Reaislamiento del hongo a partir de segmentos afectados (abajo) para la obtención de monospóricos, y comparación con el testigo (arriba).

La presencia y el avance de la infección en el sistema vascular de las plantas tratadas se evaluó mediante siembra y crecimiento in vitro de la porción terminal del tallo, practicando cinco cortes transversales, de 3 mm aproximadamente, desde el cuello de la raíz hacia arriba, colocando en medio PDA las secciones en respectivo orden ascendente, incubando a temperatura ambiente y luz tenue por 72 horas, después de las cuales se evidenció, por germinación de micelio, el nivel vascular de avance del hongo, procediéndose a reaislarlo monospóricamente comos e evidencia en las figuras 1c y 1d.

Selección y regeneración in vitro de variantes somaclonales

Para obtener y regenerar variantes somaclonales de cardamomo con resistencia inducida in vitro a la pudrición basal causada por Fusarium, se evaluaron los efectos de dos factores: concentración de la citocinina 6-bencilaminopurina (BAP), y concentración de filtrado fitotóxico, estableciendo un diseño bifactorial con cuatro niveles de concentración de BAP de 3, 4, 7 y 10 mg • L ^-1 en medio de cultivo básico (15), y cuatro niveles de dilución del filtrado crudo con acción fitotóxica.

El diseño bifactorial no contempla niveles de concentración sino niveles de dilución por haber trabajado filtrados crudos no cuantificados o caracterizados. Para establecer la dilución del filtrado fitotóxico como agente de selección en el medio de cultivo, se procedió según la metodología empleada por Pagliuso et al., 1988 (11), cosechando el filtrado después de tres semanas de germinación de las esporas y crecimiento micelial, filtrando en papel Whatman #1 con posterior refiltración en Millipore 0,2 μm.

Los niveles evaluados de dilución del agente selectivo (filtrado fitotóxico) correspondieron a las diluciones 1:0, 1:2, 1:4, 1:8 en donde crecieron las plántulas de cardamomo; el nivel 1:0 correspondió al filtrado crudo puro, es decir, sin diluir. El solvente utilizado para las diluciones fue medio de cultivo básico BAP 3 mg • L ^-1

Ciclos de inoculación del filtrado y estrategias de selección

Un grupo de 1.000 plántulas madres desarrolladas y conservadas in vitro en el laboratorio de Micropropagación de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín, se mantuvo durante ocho meses en medio de crecimiento acelerado 3 mg/L de BAP, e igual número de plántulas, en medio de crecimiento básico, con concentraciones normales de BAP de 0,7mg/L, con el fin de intervenir en la división celular de cardamomo, generar posibles variantes somaclonales y poder evaluar la respuesta organogénica de los explantes, sometidos o no a la acción del filtrado fitotóxico.

Se utilizó medio de cultivo básico M&S (14), suplementado con 0,5 mg/L de piridoxina, 0,5 mg/L de ácido nicotínico, 2,0 mg/L de glicina, 1,0mg/L de ácido indolacético, 20 g/L de sacarosa, pH de 5,6 ± 1,0. Las plántulas se sembraron en diferentes tratamientos, con y sin filtrado, y se mantuvieron a 12 horas fotoperíodo y 25 ± 2°C. Los brotes eran subcultivados cada 20 a 30 días en medio fresco.

En cada ciclo de inoculación se evaluaron 25 plántulas de cada grupo madre y se inocularon con el filtrado crudo del hongo durante tres semanas, para obtener un filtrado crudo de 21 días de crecimiento. La variable respuesta corroborada fue la presencia de necrosis como característica primaria de la enfermedad. En los medios con filtrado los brotes sin necrosis se mantenían en la misma dilución por un mes, al cabo del cual se incrementaba la dilución del filtrado fitotóxico.

Los datos obtenidos se analizaron mediante el programa estadístico MSTAT-2.13 (Programme Statistical University of Michigan). Para su transformación se utilizó X+0,5 y la comparación de las medias transformadas se realizó mediante la prueba de Duncan.

La figura 2 resume la metodología empleada para generar variantes somaclonales en plántulas de cardamomo con resistencia o tolerancia inducida in vitro a los metabolitos fitotóxicos de Fusarium oxysporum Link como estrategia de selección.

Figura 2. Diagrama de flujo para la generación de variantes somaclonales de cardamomo, resistentes a F. oxysporum.

Pruebas de patogenicidad en invernadero

El protocolo de patogenicidad en invernadero fue efectivo. Los análisis demostraron que la inoculación de aislados monospóricos a los clones 5 y 9 de cardamomo contribuye de manera eficiente al proceso de selección de la interacción del clon 5 como el más susceptible, y aislado 4 (cuatro) de Fusarium como el más virulento. La tabla 1 muestra una interacción altamente significativa (P=0,005), con un coeficiente de variación del 12,97%, que selecciona la interacción entre susceptibilidad y patogenicidad para realizar pruebas de patogenicidad in vitro.

Tabla 1. Análisis de varianza de comportamiento de los clones de cardamomo vs cepas de Fusarium oxysporum.

Teniendo en cuenta los resultados de la tabla 1 y la figura 3, se puede afirmar que los aislados monospóricos del hongo, rotulados como 3, 4, 7, y 8 ocasionaron mayor mortalidad por necrosis sobre el clon 5, en contraste con el efecto que causan estos mismos aislados en el clon 9, en donde las medias de los tratamientos transformados muestran mayor supervivencia de las plantas. Por consiguiente, las combinaciones clon 5, aislados 3, 4, 7 y 8, fueron escogidos para la selección in vitro por presentar el mismo valor en medias transformadas.

Figura 3. Comportamiento de los clones 5 y 9 de Elettaria cardamomum frente a los aislamientos de Fusarium oxysporum Link.

El análisis de resultados permitió apreciar diferencias estadísticas significativas entre algunos de los tratamientos; la acción virulenta de los aislados ocasionó necrosis de la corteza de los cormos, decoloración vascular al nivel de la raíz y el tallo, clorosis intervenal, necrosis foliar, defoliación prematura, reducción del crecimiento, amarillamiento y enrojecimiento de las hojas adultas y pardeamiento vascular. Se dieron diferencias significativas en la susceptibilidad de los clones; así, se halló una afección del 89% de plántulas evaluadas del clon 5, en comparación con un 45% en el clon 9, después de cuatro semanas de inoculación con el hongo.

Los síntomas de afección por Fusarium se observaron a las cinco semanas de inoculación, resultado concordante con los obtenidos por Hartman y Wildholm (16), cuando en sus ensayos con soya, al realizar cortes al nivel del tallo y sumergirlos en suspensión de esporas antes de la siembra, pudieron apreciar los efectos tóxicos con un nivel de signif icancia de (P=0,01), lo que indica que se trata de un método rápido para determinar la toxicidad del hongo, que puede resultar útil en la identificación de fracciones de toxinas en el filtrado.

La diferencia de susceptibilidad que pudo apreciarse concuerda con la informada por Roca y Mroginski, 1993 (17), quienes afirman que en clones provenientes de tejidos organizados de una misma planta madre se puede dar la segregación de ciertos tipos celulares presentes en el explante primario como resultante de mutaciones o cambios ocasionados por el medio de cultivo, la presión de selección ejercida por el tiempo en cultivos in vitro, el medio de cultivo y las condiciones ambientales, que conducen a reordenamientos cromosómicos y modificaciones del cariotipo, en respuesta diferencial a los procedimientos de cultivo, siendo causa de variación somaclonal.

Estas afirmaciones podrían conducir a análisis más detallados y revaluar el concepto de clon en cultivo de tejidos. Más importante sería que, existiendo plasticidad en el genoma de las plantas, la programación del genoma y la modificación de su expresión según el desarrollo fuera lo que caracterizara al clon.

La diferencia en el nivel de afección de los aislados monospóricos de Fusarium obedece, según lo reportado por Pagliuso et al., 1988 (11), a que las variaciones somaclonales de la especie son las utilizadas en la selección de plantas por su resistencia a las enfermedades que el hongo ocasiona, ya que al seleccionar aislados fitopatogénicos se puede incrementar la resistencia a las enfermedades específicas producidas por patógeno, mediante el uso de los filtrados crudos donde se encuentran sus micotoxinas.

Las cepas no patogénicas pueden ser el resultado de derivaciones resistentes de variaciones somaclonales en cepas patogénicas, ya que las cepas no patogénicas (denominadas así por su incapacidad de causar enfermedad) son colonizadores agresivos de la corteza de la raíz que actúan como barreras biológicas al establecer competencia con cepas patogénicas, contrarrestando así los efectos de estas últimas. Esta afirmación es respaldada por Schneider, 1984 (18).

Según Gaot et al., 1995 (19), se presume que las cepas no patogénicas, por su habilidad para entrar en el tejido vascular, en contraste con las patogénicas, suscitan una rápida respuesta en el hospedero para localizar un sitio de infección, activar su maquinaria genética y organizar una respuesta rápida al ataque, lo que constituye un importante recurso en fitopatología. La colonización sintomática es el efecto de una infección latente, cuyo crecimiento agresivo induce rápidamente la muerte en el hospedero cuando se activa el hongo.

Selección in vitro y regeneración de variantes somaclonales de cardamomo

El mayor número de regenerantes por explante se observó en los tratamientos de medio de crecimiento acelerado, donde se utilizó 3 mg/L de BAP. La figura 4 representa la morfología de los explantes evaluados. Al igual que en los estudios realizados por Patiño et al., 2007 (6), los tratamientos con concentraciones de BAP normal sin filtrado se mantuvieron vivos y su morfología estable.

Figura 4. Efecto de la concentración de BAP en la producción de brotes en cardamomo. a) 10 mg/L BAP (30 – 25 brotes); b) 7 mg/L BAP (20 – 25 brotes); c) 4 mg/L BAP (15 – 20 brotes); d) 3 mg/L BAP (5 – 10 brotes).

Se descartaron los tratamientos con concentración de BAP por encima de los 3 mg/L porque los explantes producidos fueron amorfos, lo que indica que, dependiendo del nivel endógeno de la fitohormona en el testigo, la adición de sustancias reguladoras de crecimiento puede provocar resultados contradictorios en varias especies cultivadas in vitro, y resultar anormalidades mitóticas.

Atendiendo a lo mencionado, en esta investigación se escogió la concentración de 3 mg/L de BAP, que genera un número adecuado de explantes (10 brotes por frasco), morfológicamente deseables. Esta concentración, además de incrementar la tasa de divisiones celulares, presiona a la planta a generar variación somaclonal en sus tejidos. Es de anotar que en los cinco primeros ciclos de inoculación con el filtrado, cuando a la presión ejercida por el incremento de citocininas se le sumó la adición del filtrado fitotóxico, se redujo significativamente la tasa de aparición de regenerantes en los explantes de cardamomo, causando una mortalidad del 99%, comportamiento que, según Patiño et al., 2007 (6), se puede dar cuando se utiliza un agente de selección adecuado. No obstante, en la presente investigación, a partir del sexto ciclo se presentaron los primeros regenerantes a partir de los explantes.

Los mismos autores destacan un aspecto importante que se manifiesta con la adición de citocinina (BAP) al medio de cultivo al contrarrestar los efectos fitotóxicos del filtrado. Esta observación respalda el ya conocido papel de las citocininas en las respuestas de las plantas al estrés ambiental, como presencia de fitotoxinas en el medio (22).

Los resultados corroboran que la interacción citocinina - filtrado contribuye de manera eficiente a seleccionar in vitro variantes somaclonales con resistencia inducida a Fusarium. Esto se respalda en el hecho de que durante el cultivo de tejidos, las células individuales o los tejidos de los explantes se desdiferencian y luego se rediferencian nuevamente dando origen a nuevos tejidos. Esta reprogramación del genoma, sumada a una presión por metabolitos fitotóxicos en el medio de cultivo, infringe a las células y/o tejidos una serie de experiencias traumáticas (23) ocasionando nuevos cambios en ellas.

Además, teniendo en cuenta que en los cultivos de tejidos los explantes están expuestos a diferentes condiciones de tensión (desequilibrios osmóticos, lesiones causadas en el aislamiento de los tejidos de los explantes, niveles y calidades atmosféricas anormales, etc), se puede prever que aparezcan alteraciones en sus niveles de citocininas, y posiblemente otros reguladores y, por ende, posibles ploidias.

El diseño experimental demostró que in vitro también se pueden apreciar diferencias significativas entre varios tratamientos. Se destaca que el grupo de plantas madres mantenidas en medio básico, no presentó ningún regenerante resistente, independientemente de que el mismo contuviera o no filtrado fitotóxico en cualquiera de las concentraciones evaluadas; la fototoxicidad de los tejidos del explante se hizo evidente por el pardeamiento y el necrosamiento.

La figura 5 muestra los regenerantes hallados en los tratamientos con inóculos. Estos datos concuerdan con los que suministran Patiño et al., 2007 (6) cuando, al evaluar segmentos foliares de tomate de árbol con toxinas de Colletotrichum, encontraron que no hubo ningún regenerante a partir de los explantes sembrados en medios sin BAP, contuvieran o no filtrado fitotóxico, presentando también pardeamiento y necrosis.

Figura 5. (a). Efecto del filtrado fitotóxico de dilución 1:8 sobre plántulas de cardamomo con filtrado (derecha), y sin filtrado (izquierda). (b). Regenerantes de plántulas de cardamomo en la dilución 1:8 después del sexto ciclo de inoculación con el filtrado.

Estos autores demostraron que la interacción citocininas – filtrados contribuía de manera eficiente en el proceso de selección in vitro. Los resultados encontrados en cardamomo son congruentes con los de Roca y Mroginski, 1993 (17), quienes afirman que cuando se experimenta in vitro con tejidos diferenciados, como meristemos, ápices de tallo y yemas apicales, se cuenta con estructuras genéticamente estables importantes para producir material uniforme de experimentación; pero no cuando se pretende producir variabilidad, razón por la cual en esta investigación se intervino el ciclo celular de cardamomo usando citocininas para que, al incrementar la tasa de divisiones mitóticas, se causaran saltos génicos que condujeran a la obtención de variantes somaclonales.

Ciclos de inoculación con el filtrado y estrategias de selección

En el primer ciclo de inoculación con el filtrado crudo a las plantas madres de crecimiento acelerado, se inhibió completamente la aparición de regenerantes en los explantes que tuvieron un 99% de mortalidad. Este comportamiento se mantuvo hasta los ciclos tercero y quinto de inoculación, cuando un total de 125 plántulas evaluadas, provenientes del grupo de plantas madres de crecimiento acelerado, mostraron los primeros indicios de resistencia, con el resultado de un 6,4% y un 3,2% de plántulas vivas en la dilución 1:8 y 1:4 respectivamente, como se muestra en la figura 6.

Figura 6. Efecto del tiempo en la resistencia in vitro de cardamomo a las diferentes diluciones a las toxinas del hongo.

La tabla 2 indica el efecto de la dilución y el mantenimiento de las plántulas en medio de crecimiento acelerado, en donde el nivel de significancia de 0,09 indica que la interacción ciclo por dilución es altamente significativa, lo que determinó que en la medida que se incrementó el tiempo de permanencia en medio de crecimiento acelerado, las plantas lograron tolerar tratamientos mensuales progresivos en la dilución del filtrado crudo del hongo.

Tabla 2. Análisis de varianza del efecto de las diluciones del filtrado crudo del hongo sobre los ciclos de inoculación vs selección por resistencia.

Para el sexto ciclo de inoculación, el 32% de plántulas de cuatro meses de sometimiento a medio de crecimiento acelerado toleraron el primer incremento de dilución del filtrado fitotóxico cuando fueron trasladadas de la dilución 1:8 a la dilución 1:4, datos que resultaron concordantes con los de Rutkowska-Krause et al., 2003 (20), quienes informan que, a los seis meses de inocular cultivos de callos de Linum usitassinum L. con Fusarium oxysporum L., pruebas citométricas revelaron un aumento diferencial en los niveles de ploidias en un 41%, ligado a un incremento altamente significativo de resistencia callogénica al filtrado fitotóxico, comparadas con el control.

Los regenerantes de plántulas de cardamomo mantenidas seis meses en medio de crecimiento acelerado en la dilución 1:8 lograron tolerar sometimientos progresivos mensuales a las diluciones 1:4, 1:2, 1:0, llegando a obtener una resistencia directa de la plántula al filtrado crudo sin dilución (figura 6). Las convenciones D1, D2, D3, D4 corresponden a cada una de las diluciones evaluadas donde la convención D1=1:0, D2=1:2, D3=1:4, D4=1:8. Al cabo de dos meses fueron subcultivadas a medio básico de micropropagación.

Resulta interesante el efecto del BAP sobre los explantes, inoculados o no con el filtrado fitotóxico. Al adicionar esta fitohormona al medio de cultivo, la tasa de supervivencia y viabilidad se incrementó notablemente según aumentaba el tiempo de sometimiento al medio de crecimiento acelerado. Según Patiño et al., 2007 (6), la adición de BAP al medio de cultivo contrarresta de manera significativa los efectos del filtrado fitotóxico sobre los explantes.

Švábová y Lebeda, 2005 (5) afirman que la obtención de líneas resistentes a enfermedades mediante el proceso de selección in vitro utilizando filtrados fitotóxicos, toxinas aisladas o elicitores, ha sido exitosa en banano, clavel, uva, fresa y trigo.

Buitrago y Pacheco, 1991 (21) afirman que, para la selección de un material por resistencia al filtrado de un patógeno, una de las condiciones esenciales en el procedimiento es la utilización de un agente de selección adecuado, como base para establecer un protocolo de regeneración que permita la obtención de plántulas resistentes a un nivel eficiente y que garantice repetibilidad.

Al trabajar con filtrados crudos no se define con precisión la causa de la fitotoxicidad. Es probable que se deba en parte a la presencia en los filtrados de enzimas pectinasas (6). Al igual que en trabajos realizados por los investigadores mencionados, en éste se evidenció que con la adición de la citocinina (BAP) al medio de cultivo se contrarrestaron los efectos fitotóxicos del filtrado, como respuesta de las plantas al estrés ambiental que éste les ocasiona (22, 23).

La metodología empleada demostró ser útil en la obtención y regeneración de plántulas de cardamomo con resistencia inducida in vitro a la acción del filtrado fitotóxico cuando, en sinergia con citocininas utilizadas en tejidos diferenciados, se incrementa la tasa de división celular. Cuando el propósito es obtener variantes somaclonales, el uso de filtrados crudos de Fusarium oxysporum L. como agentes de selección in vitro para obtener material de cardamomo con resistencia inducida a la pudrición basal, es un método rápido, eficaz y seguro que permite la obtención de plantas con resistencia a enfermedades.

En esta investigación, la selección se hizo utilizando filtrado crudo y no aislando una molécula tóxica en particular, basando nuestra decisión en las investigaciones realizadas por Shahin y Spivey, 1986 (24), quien concluye que en el modo principal de infección de Fusarium oxysporum no parece estar involucrado una toxina específica, afirmación que respaldan Hartman et al., 1984 (12) en su trabajo con alfalfa resistente a Fusarium, donde se incrementó en mayor medida la regeneración de plántulas en medios que contenían filtrado crudo que cuando se trabajó con toxinas aisladas.

Las pruebas previas de patogenicidad realizadas en invernadero constituyen un método rápido y determinante en la identificación y escogencia de las cepas más virulentas del hongo, lo cual garantiza filtrados crudos altamente fitotóxicos para seleccionar in vitro plantas de cardamomo resistentes a Fusarium oxysporum.

Someter plántulas de cardamomo por largos períodos de tiempo a medios de crecimiento acelerado (en concentraciones relativamente altas de citocininas) y alta presión de selección, mediante el incremento de los metabolitos tóxicos del filtrado crudo del hongo en el medio, aumenta la posibilidad de generar variantes somaclonales, lo que implica alteraciones fisiológicas de interés, en respuesta a la selección in vitro.

Someter plántulas de cardamomo durante amplios períodos de tiempo a medios de crecimiento acelerado y a altas presiones por incremento de los metabolitos tóxicos del filtrado crudo, aumenta la posibilidad de seleccionar variantes somaclonales que posean resistencia inducida in vitro a Fusarium oxysporum.

Se debe tener en cuenta que in vitro podrían no seleccionarse plantas con resistencia completa a la enfermedad, pero sí materiales que muestren diferencia en la expresión de los síntomas, puesto que un pequeño cambio en la susceptibilidad del hospedante o en la patogenicidad del microorganismo puede tener efectos significativos en el desarrollo de la enfermedad, y por tanto, en la biología de la evolución de la interacción planta-patógeno.

A la Dirección de Investigación y Posgrados del Politécnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid y a la Universidad de Antioquia por la financiación del proyecto.

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* Autor a quien debe dirigir la correspondencia: dorcas.zuniga@unalmed.edu.co