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Introducción
La infección por el virus del dengue (DENV) es una enfermedad de carácter endemoepidémico, transmitida por mosquitos del género Aedes, principalmente por A. aegypti. En los últimos cincuenta años, la incidencia de esta esta enfermedad ha aumentado a nivel mundial 1. Anualmente, se presentan entre 50 y 100 millones de infecciones sintomáticas, de las cuales 500 000 son dengue grave (DG) y, de estas, el 2,5 % tiene desenlace fatal 2.
En Colombia el dengue representa un problema prioritario en salud pública, por múltiples factores, incluyendo la reemergencia e intensa transmisión viral, con tendencia creciente, y circulación de los serotipos DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4 3. En 2016, se notificaron 103 822 casos de dengue; 61 220 casos (50 %) sin signos de alarma; 41 555 casos (40 %) de dengue con signos de alarma (DCSA) y 1047 casos (1,0 %) de DG. El 25,1 % de los casos de dg se presentó en menores de 15 años. En el departamento colombiano del Huila, la incidencia fue de 488 casos por cada 100 000 habitantes en riesgo; datos por los cuales se ubica por encima de la media nacional 4.
Por otro lado, Colombia presenta una prevalencia de alergias del 12,0 % en la población de niños en edad escolar, que suele ser la población más afectada; las alergias respiratorias (asma y rinitis) son las más frecuentes y, en menor proporción, las relacionadas con la piel 5. Reportes previos mostraron que personas con hipertensión arterial, alergias en la piel 6 y comorbilidades como la diabetes 7 presentan mayor riesgo de desarrollar dengue hemorrágico (según clasificación Organización Mundial de la Salud [OMS] - 1997). En los niños menores de 15 años infectados por DENV, el 19,54 % podría desarrollar dengue hemorrágico 6.
Además, se han encontrado niveles más elevados de IgE total en el suero de personas con niveles de IgM positivos para dengue, en comparación con individuos IgM negativos; la concentración de IgE fue mayor en individuos con infección primaria o secundaria de dengue, en comparación con los de individuos sin contacto previo con el DENV 8,9.
Se observa clínicamente que pacientes con dengue tienen manifestaciones dérmicas como eritema y prurito, lo que sugiere degranulación del mastocito, síntomas que mejoran con antihistamínicos. El DENV es capaz de desencadenar la degranulación del mastocito e, incluso, se ha observado que los mastocitos son blanco del DENV por vía dérmica 10.
En su proceso de alimentación, antes de succionar la sangre, los mosquitos depositan proteínas de la saliva 11, como tropomiosinas, glucosidasas antibacterianas y anticoagulantes que podrían interaccionar con la IgE sobre la superficie del mastocito, al cual degranulan en el proceso. El factor antiagregante plaquetario (PAF) y algunas citoquinas con efecto endotelial, como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) también son producto de la degranulación del mastocito; generan vasodilatación y están relacionadas con la gravedad del dengue.
En pacientes alérgicos, las proteínas provenientes de la saliva del mosquito inducen IgE específica, que activa el receptor FCSRI, lo que induce la liberación de mediadores preformados 12. Contrario a la IgE, parece ser que la IgG4 contra proteínas del vector actúa como inhibidor de la degranulación ya que compite con la IgE para la unión con los alergenos 13-16.
La IL-33 producida por el epitelio dérmico induce LT CD4 Th2, a través de su interacción con el receptor ST2. Sin embargo, la forma soluble (SST2) de este receptor es capaz de antagonizar la IL-33. El SST2 se ha visto incrementado en el DG por lo que su medida puede ser reflejo de la actividad del mastocito y la inducción del LTh2, el cual promueve la producción de IgE por parte de los linfocitos B 17,18.
Por otro lado, anticuerpos IgE e IgG4 contra proteínas del Aedes aegypti fueron medidos para identificar si esas proteínas inducen IgG4 o IgE en niños con dengue y si este reconocimiento se asocia con la gravedad de la enfermedad 11,14,19,20. Asimismo, se evalúa si existe relación entre los niveles séricos de anticuerpos IgE e IgG4 específicos contra proteínas del Aedes con biomarcadores previamente asociados con la gravedad del dengue en niños como SST2, VEGF y VEGFR1.
Materiales y métodos
Población de estudio
Se llevó a cabo un estudio de corte transversal en el que se incluyeron 66 niños menores de 15 años (n=66) con infección por dengue, que asistieron al Hospital Universitario Hernando Moncaleano Perdomo (Neiva), durante el periodo de 2011 a 2016 (junio). Los criterios de inclusión fueron los de la clasificación revisada en 2009 por la OMS 20 tanto para dengue grave (DG) como para dengue con signos de alarma (DCSA).
Para DG, se tuvieron en cuenta: niños con signos clínicos o radiológicos de derrame pleural, ascitis, hipotensión con presión arterial media menor de 70 mm de Hg o presión de pulso menor de 20 mm de Hg, acompañados de recuento de plaquetas por debajo de las 100 000 células/mm3, con manifestaciones hemorrágicas o sin ellas, alteraciones del sistema nervioso central y hepatomegalia.
Por su parte, para DCSA se tuvieron en cuenta estos criterios: niños que presentan deterioro clínico con dolor abdominal intenso y continuo, vómito persistente, acumulación de líquido, hematemesis o hematuria, letargias, hepatomegalia de más de 2,0 cm y disminución progresiva de las plaquetas en al menos dos mediciones durante el seguimiento 21.
Además, se incluyó un grupo sin dengue, conformado por niños sanos, tomados como grupo control. Todos los pacientes firmaron el consentimiento informado y se obtuvo permiso para el estudio del Comité de Ética de la Universidad Sur-colombiana, por medio del Acta No. 02, del 27 de mayo de 2015.
Preparación del extracto de Aedes aegypti
La obtención del extracto se realizó siguiendo el protocolo descrito por Cantillo y sus colaboradores 22. Brevemente, se realizó una mezcla 1:40 P/V de liofilizado de cuerpo entero de mosquito A. aegypti en búffer fosfato salino (PBS), pH 7,2 y se agitó durante toda la noche a 4 °C. Posteriormente, la mezcla se centrifugó a 10 000 rpm, durante 10 minutos y el sobrenadante se filtró por una membrana con poros de 0,2 µm. Finalmente se dializó en agua destilada en una bolsa de diálisis de punto de corte 3,500-Da (Spectra / PorDialysis Membranes, Houston, Texas, EE. UU.) y se liofilizó. La concentración de la proteína obtenida se determinó mediante el ensayo de Bradford.
Ensayo de ELISA
La medición del nivel sérico de IgE e IgG4 específicas se realizó en el laboratorio de inmunología de la Universidad de Cartagena. Brevemente, se recubrieron los pozos de microplacas con 0,5 µg de extracto de mosquito A. aegypti en 100 µl de tampón carbonato/bicarbonato 0,05 M (pH 9,6). Después de lavar tres veces con PBS con Tween-20 (PBS-T), la unión inespecífica se bloqueó durante 1,0 hora con PBS-T que contenía albúmina sérica bovina (BSA) al 1,0 %, seguido por tres lavados. Las microplacas se incubaron después durante 2,0 horas con suero del paciente diluido 1:8 en PBS-T/BSA al 1,0 % y, después del lavado, se incubaron durante 1,0 hora anticuerpos de ratón anti-Fc de IgE o de IgG4 humanos, conjugados con peroxidasa de rábano diluida 1:2000 (Southern, Biotech).
Finalmente, las microplacas se lavaron e incubaron con dihidrocloruro de o-fenilendiamina (Sigma-Aldrich). La reacción se detuvo con HCI y se leyó la absorbancia a 492 nm. Todas las muestras se ensayaron por duplicado. Se usaron tres desviaciones estándar por encima del valor medio de la densidad óptica (492 nm) del suero del sujeto control, para determinar el límite para la unión positiva de IgE e IgG4.
Cuantificación de SST2 y VEFG en el plasma
Para la cuantificación del sst2 y VEFG se tomaron muestras de sangre obtenidas en la fase aguda de la enfermedad, en tubos con EDTA. Se obtuvo plasma por centrifugado y se congeló a -70 °C hasta su uso. Los niveles plasmáticos de SST2 y VEFG se cuantificaron por ELISA, usando kits comerciales (R&D systems, Número DY523 y DY3625) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la estimación de concentración de citocinas (en pg/ml) se utilizó una curva de regresión. La concentración más baja en las curvas estándar de ELISA fue 31 pg/ml y 23 pg/ml para SST2 y VEFG, como se describió en Guerrero y colaboradores 18.
Análisis estadístico
Las variables cualitativas se expresaron en porcentaje, se dicotomizaron las variables continuas (inmunoglobulinas) con los siguientes puntos de corte 22: IgE total de 0,150 OD, IgE específica de 0,2 OD e IgG4 específica de 0,5 OD. Se consideraron negativos valores por debajo de los mencionados, para el cálculo de la odds ratio (OR). También se describieron variables de caracterización sociodemográfica, características clínicas y paraclínicas. Como variables cuantitativas, se calculó la mediana y rango intercuartílico y, para el análisis bivariado, se utilizó la prueba U de Mann Whitney. Por último, se hizo la regresión logística. Los datos fueron analizados en el programa Stata™, versión 14.0.
Resultados
Al analizar las características sociodemográficas, se encontró un mayor porcentaje de niños de género masculino (70 %) y, en cuanto a edad, hay diferencia estadísticamente significativa entre el grupo de dengue (mediana de 6 años) y niños sanos (mediana de 12 años).
Los síntomas más frecuentes fueron: vómito (74 % de los niños), dolor abdominal (42 %) y cinco días de fiebre (41 %). Al comparar la presencia de estas características clínicas entre los grupos de DG y DCSA, el dolor abdominal presenta una diferencia estadísticamente significativa (OR de 0,05; IC del 95 % de [0,0007-0,33]), resultados que se muestran en la tabla 1.
Tabla 1 Características clínicas de los niños con dengue en fase aguda
| Síntomas | DG (n=16) | DCSA (n=15) | OR | IC del 95 % |
|---|---|---|---|---|
| Vómito | ||||
| Sí | 69 % (11) | 80 % (12) | 0,55 | 0,10-2,86 |
| No | 31 % (5) | 20 % (3) | ||
| Dolor abdominal | ||||
| Sí | 12 % (2) | 73 % (11) | 0,05 | 0,0007-0,33 |
| No | 88 % (14) | 27 % (4) | ||
| Diarrea | ||||
| Sí | 12 % (2) | 13 % (2) | 0,92 | 0,11-7,5 |
| No | 88 % (14) | 87 % (13) | ||
| Ascitis | ||||
| Sí | 12 % (2) | 7,0 % (1) | 2,0 | 0,16-24 |
| No | 88 % (14) | 93 % (14) | ||
Una vez comparados los recuentos plaquetarios entre los grupos de DCSA y DG, se observaron niveles más altos de plaquetas en el primer grupo (p=0,0002). Por su parte, la concentración de VEGF (p=0,003) fue más elevada en los niños con DCSA; mientras que el nivel SST2 fue más alto en el grupo de DG (p=0,004), tal como se detalla en la tabla 2.
Tabla 2 Descripción de características paraclínicas de los niños con dengue en fase aguda
| Variable | DCSA (n=15) | DG (n=16) | Prueba U de Mann Whitney |
|---|---|---|---|
| Hematocrito | Mediana: 38 *RIC: 35-40,3 | Mediana: 37,8 *RIC: 36,0-41,7 | 0,782 |
| Leucocitos | Mediana: 3300 *RIC: 1900- 5400 | Mediana: 4050,0 *RIC: 2800,0- 8600,0 | 0,276 |
| Plaquetas | Mediana: 58 000 *RIC: 48 000- 94 000 | Mediana: 35 000 *RIC: 24 250- 43 000 | 0,0002 |
| Receptor de TNF soluble (STNFR) | Mediana: 7971,4 *RIC: 5492,5- 9585,4 | Mediana: 9624,3 *RIC: 4978,7- 12 562,9 | 0,580 |
| SIL2 | Mediana: 3895,3 *RIC: 3224,8- 5961,3 | Mediana: 5050,1 *RIC: 2998,9- 6715,6 | 0,812 |
| VEGF | Mediana: 171,4 *RIC: 55,2- 292,3 | Mediana: 53,3 *RIC: 4,5-73,4 | 0,003 |
| VEGFR2 | Mediana: 10 603,4 *RIC: 6957,8- 12 708,5 | Mediana: 10 974,7 *RIC: 7187,3- 14 376,5 | 0,874 |
| IL6 | Mediana: 10,0 *RIC: 6,1-17,8 | Mediana: 7,4 *RIC: 3,9-9,0 | 0,080 |
| IL10 | Mediana: 49,0 *RIC: 25,2- 105,1 | Mediana: 32,1 *RIC: 12,4-70,2 | 0,289 |
| IL8 | Mediana: 21,2 *RIC: 19,2- 32,2 | Mediana: 23,4 *RIC: 17,5-28,7 | 0,649 |
| SST2 | Mediana: 318,6 *RIC: 34,3- 1050,4 | Mediana: 2337,3 *RIC: 985,9- 3607,7 | 0,004 |
* Ric: rango intercuartílico.
Al analizar los niveles plasmáticos de la IgG4 específica en niños con dg y en el grupo de control, se encontró una relación estadísticamente significativa (tabla 3). Teniendo en cuenta esta información se realizó una regresión logística, incluyendo los niveles séricos de IgG4 específicos, IgE específicos, IgE Total y dengue (tabla 4). Se determinó que la oportunidad de los niños de tener DG con niveles séricos de IgG4 específica mayores de 0,5 OD es 78 % menor (OR=0,22), en comparación con la oportunidad de tener dg con niveles plasmáticos de IgG4 específica menores de 0,5 OD, cuando se ajusta por IgE específica e IgE total.
Tabla 3 Relación entre los niveles de IgE total, IgE e IgG4 específicas anti Aedes con la gravedad del dengue
| Prueba | Sí (n=16) | No (n=26) | OR | IC del 95 % | |
|---|---|---|---|---|---|
| Dengue con signos de alarma (n=42) | IgE total | ||||
| Positivo | 29 % (12) | 26 % (11) | 4,09 | 0,88-21,57 | |
| Negativo | 9,0 % (9) | 36 % (36) | |||
| IgE específica | |||||
| Positivo | 2,0 % (1) | 70 % (3) | 0,511 | 0,009-7,17 | |
| Negativo | 36 % (15) | 55 % (23) | |||
| IgG4 específica | |||||
| Positivo | 21 % (9) | 45 % (19) | 0,47 | 0,10-2,15 | |
| Negativo | 17 % (7) | 17 % (7) | |||
| Dengue grave (n=41) | IgE total | ||||
| Positivo | 19 % (8) | 27 % (11) | 1,55 | 0,36-6,78 | |
| Negativo | 17 % (7) | 37 % (15) | |||
| IgE específica | |||||
| Positivo | 2,0 % (1) | 7,0 % (3) | 0,54 | 0,009-7,17 | |
| Negativo | 35 % (14) | 56 % (23) | |||
| IgG4 específica | |||||
| Positivo | 12 % (5) | 46 % (19) | 0,18 | 0,036-0,879 | |
| Negativo | 24 % (10) | 17 % (7) | |||
Discusión
Se ha sugerido que existe una relación entre la concentración de IgE total y el dengue toda vez que se han encontrado niveles séricos mayores de IgE en pacientes que han tenido dengue hemorrágico 8. La IgE desencadena una respuesta de hipersensibilidad inmediata 23, uniéndose al mastocito por medio del receptor FcsRI 24. Por lo cual la interacción de la IgE con antígenos de la saliva del mosquito vector del Aedes aegypti podría generar una inflamación temprana que influencie la evolución clínica del dengue en el paciente afectado. Cantillo y su equipo identificaron que la tropo-miosina, proteína de la saliva del mosquito, generaba reactividad de la IgE, de esta manera señalan que podría servir para el diagnóstico de alergia causada por Aedes22.
En el presente estudio, se exploran los niveles séricos de IgE e IgG4 específica para proteínas del mosquito, en relación con la gravedad del dengue. No se encontró relación entre los niveles séricos de IgE específica para proteínas de la saliva del mosquito (tropomiosina) con los análisis de las OR; pero se encontró evidencia estadísticamente significativa para la IgG4 específica. Cuando se comparó el grupo de niños con DG y los niños del grupo de control, se encontró que la oportunidad que tienen los niños de tener DG con niveles séricos de IgG4 específica mayores de 0,5 OD es 78 % menor (OR=0,22), en comparación con la oportunidad de tener dg con niveles séricos de IgG4 específica menores de 0,5 OD.
La IgG4 es una subclase de la IgG, característica de tolerancia al alergeno, incluso, como antagonista de la actividad de la IgE, al competir con ella por la interacción con el alergeno: la IgG4 es probablemente inducida por las células T reguladoras, productoras de TGF-(3, IL-10 e IL-35 8,25.
En comparación con otras subclases de IgG (IgG1, IgG2 e IgG3), la IgG4 proporciona una base estructural para la menor afinidad de unión a receptores de Fcv 15.
James LK y su equipo evidencian dos posibles mecanismos por los cuales IgG4 inhibe la hiper-sensibilidad mediada por IgE: (a) al secuestrar el antígeno IgG4 puede funcionar como un anticuerpo bloqueante, evitando que la IgE se una al receptor y (b) se ha propuesto que la IgG4 coestimula el receptor de IgG inhibidor FcyRiib, que puede regular negativamente la señalización de FCSRI y, a su vez, inhibir la activación de células efectoras 15.
El aumento en la síntesis de IgG4 disminuye la fijación del complemento por la vía clásica y, por ende, la síntesis de C5a activadora, igualmente, del mastocito 16. Al generar tolerancia la IgG4, podría verse implicada en la disminución de síntomas y, probablemente, desempeñaría una función importante de protección, para que la enfermedad en el huésped no ocurra.
Se identificó la gravedad del dengue según hallazgos paraclínicos en los niños diagnosticados con la enfermedad, atendidos en el Hospital Universitario Hernando Moncaleano Perdomo (Neiva). Se evaluó la relación con biomarcadores presentes en esta enfermedad y se encontraron diferencias estadísticamente significativas con las plaquetas, VEGF y SST2. Como en el estudio de Villar y sus colaboradores 26, se evaluó la presencia de biomarcadores predictores de trombocitopenia, vasodilatación y fuga capilar característicos del DG. Los mastocitos, productores de sustancias como histamina y citocinas como IL-6, 8 y 10, VEGF, SST2, IFNY, TNFCX 27, son blanco del DENV, el cual genera su degranulación, proceso inductor de liberación sustancias mediadoras que aumentan la permeabilidad vascular.
El VEGF es un factor asociado con la angiogénesis y la permeabilidad vascular, por lo cual, según diversos estudios han evidenciado, es relevante determinarlo en el dengue. El VEGF se fija a los receptores VEGFR1, VEGFR2 y VEGFR3; algunos de estos receptores, como el VEGFR1, pueden ser solubles y, de ese modo, antagonizan la función del VEGF. En el dg, se ha encontrado aumento en las concentraciones séricas de VEGFRI y disminución de la VEGFR2 12.
Un estudio realizado en Nueva Delhi (India) por Mohit Singla y sus colaboradores, en 2016, identificó que sustancias liberadas por la degranulación del mastocito se encuentran presentes en el DG; los análisis univariado y multivariado muestran que las características predominantes en el DG son el aumento de la producción de IL-6, 8, 10 y VEGF 28.
En Taiwán, Tseng y su equipo tomaron 53 pacientes con diagnóstico de dengue; 39 con fiebre de dengue y 14 con fiebre hemorrágica de dengue (criterios OMS) y 5 pacientes con enfermedad febril no por dengue. Los investigadores observaron que, como en el presente estudio, los niveles medios de VEGF sérico en los pacientes con dengue hemorrágico (54,6 pg/ml; p<0,05) fueron significativamente más altos que en los pacientes con dengue grave y el grupo de control. Además, los niveles de VEGF en los pacientes con dengue grave no fueron significativamente distintos de aquellos de los del grupo de control [p=0,17] 29. También se identificaron niveles más bajos de VEGF (53,3 UI/ml) en el DG, mientras que el VEGFR2 fue más alto (10974,7 UI/ ml). Este resultado es consistente con los de Rat-tanamahaphoom y su equipo 30, quienes evidenciaron que la activación de células T específicas en el DG se asocia con la modulación de la expresión del VEGFR2, que puede contribuir al aumento de la capacidad de respuesta del VEGF y así estimular o conducir a la activación endotelial y fuga plasmática. Además, los niveles de VEGF en pacientes con DF no fueron significativamente diferentes de los del grupo de control con enfermedad febril no debida al dengue.
Por su parte, Guerrero y su equipo demostraron el aumento del SST2 en el dg 18. Asimismo el dg se correlacionó negativamente con el recuento plaquetario, coincidiendo con los resultados del presente estudio, pues, como se determinó por medio de la correlación de Spearman, el SST2 y las plaquetas presentan una correlación inversamente proporcional, estadísticamente significativa.
También el estudio de Villar y sus colaboradores, después de cuantificar el SST2 y otras citocinas en la fase aguda de la enfermedad, encontraron niveles significativamente más elevados en el DG. Una vez más, se afirma el papel esencial de la respuesta inflamatoria y regulación de las citocinas de la enfermedad y, por tanto, estos hallazgos contribuyen a identificar grupos en riesgo de desarrollar formas graves de la enfermedad 26.
En este estudio, se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre la edad de los controles (niños sanos) y los casos de dengue (DCSA y DG), lo cual puede ser explicado porque las madres de niños de 5 años dificultan el acceso, ya que, como son niños sanos, no permiten el procedimiento de la toma de la muestra de sangre. Ramírez y su equipo establecen valores de referencia de concentraciones de IgE independientemente del sexo y la edad 31, mientras que Londoño-Rente-ría y su equipo encontraron una correlación positiva estadísticamente significativa entre anticuerpos IgG contra proteína D7 y el factor edad en mayores de 20 años y las condiciones de vida 11.
De acuerdo con características clínicas, la presencia del dolor abdominal fue estadísticamente significativa en términos de su relación con el dg, en lo que también este estudio coincide con otros estudios sobre manifestaciones y caracterización clínica en paciente con dengue, por ejemplo, los realizados en Catamarca, Argentina 32, y Cartagena, Colombia 33, que identifican el dolor abdominal en cerca del 70 % de los pacientes con dengue.
Algunas limitaciones encontradas fueron efecto del diseño de la investigación, ya que el tipo de estudio transversal no permite establecer relaciones causales; el tamaño de muestra y el tipo de muestreo por conveniencia puede aumentar el error aleatorio, un aumento en el número de pacientes podría dar mayor claridad en los resultados.
Otro tipo de sesgo que pudo haber afectado los resultados es el sesgo de selección, al trabajar con una base de datos del grupo de investigación de parasitología y medicina tropical. En cuanto al sesgo de medición, no fue posible conocer la historia de alergias de los pacientes ni su clasificación, aspecto que debe tenerse en cuenta para indagar en un próximo estudio. También es probable que los padres pudieran no tener claro el tiempo de evolución de los signos y síntomas, pero, generalmente, estos datos son recolectados durante la fase febril, muy cerca del inicio del cuadro clínico, lo que podría hacer que la información fuera de mejor calidad. Sin embargo, es importante tener en cuenta que los registros dados en la base de datos provienen de la información registrada en la historia clínica por los residentes de la especialidad en pediatría y los reportes del laboratorio de I & I de la Universidad Surcolombiana.
Para tener mayor certeza podría tomarse una cohorte de individuos alérgicos al mosquito y hacerles seguimiento para saber si, en caso de ser infectados con el virus dengue, presentan formas graves de la enfermedad.
