RESUMEN

Objetivo. Evaluar la efectividad anestésica de 2-fenoxietanol, benzocaina, quinaldina y metanosulfonato de tricaina (MS-222) en alevinos y juveniles de cachama blanca (Piaractus brachypomus). Materiales y métodos. Alevinos (7.3 ± 6.8 g) y juveniles (49.6 ± 28.4 g) fueron expuestos a 2-fenoxietanol (200, 400 y 600 ppm), benzocaina (50, 100 y 150 ppm), quinaldina (7.5, 15 y 30 ppm) o MS-222 (100, 150 y 200 ppm) (n=12), para evaluar la duración de la inducción y recuperación, frecuencia opercular y la sobrevivencia postanestesia. Resultados. El desarrollo corporal y la concentración afectaron el periodo de inducción, siendo mayor en juveniles que en alevinos (p<0.05) y menor a medida que aumentó la concentración de anestésico; sin embargo, alevinos expuestos a MS-222 mostraron períodos de inducción más largos que los juveniles; y alevinos expuestos a 2-fenoxietanol mostraron períodos de inducción iguales con las tres concentraciones (p>0.05), mientras que juveniles expuestos a MS-222 mostraron el menor tiempo de inducción con la menor concentración (p<0.05). El tiempo de recuperación fue inferior a 2 min, con 2-fenoxietanol, MS-222, quinaldina y 50 ppm de benzocaina; pero altas concentraciones de benzocaina mostraron largos períodos de recuperación. No se observó tendencia en la variación de la frecuencia opercular ni mortalidad durante o después de la exposición a los anestésicos. Conclusiones. En alevinos el 2- fenoxietanol (400 ppm) y en juveniles el MS-222 (100 ppm), serían las sustancias de elección para procedimientos cortos, pero deberá recurrirse a altas concentraciones de benzocaina cuando el propósito de la anestesia sea un procedimiento prolongado.

Palabras clave: Anestésia, Piaractus brachypomus, frecuencia opercular.

ABSTRACT

Objective. To evaluate the efficiency of 2-phenoxyethanol, benzocaine, quinaldine and tricaine methasulphonate (MS-222) as an anesthesia for pirapitinga (Piaractus brachypomus) fingerlings and juvenile fishes. Materials and methods. Fingerlings (7.3 ± 6.8 g) and juveniles (49.6 ± 28.4 g) were exposed to 2-phenoxyethanol (200, 400 and 600 ppm), benzocaine (50, 100 y 150 ppm), quinaldine (7.5, 15 y 30 ppm) or MS-222 (100, 150 y 200 ppm) (n=12) in order to evaluate the induction and recovery time, opercular frequency and post-anesthesia survival. Results. Induction time was longer in juveniles than in fingerlings (p<0.05) and decreased in proportion to the increase in the concentration of anesthesia. However, induction time in fingerlings exposed to MS-222 was longer than in juveniles. Fingerlings exposed to 2-phenoxyethanol had similar induction times at the three concentrations (p>0.05), whereas the juveniles exposed to the low MS-222 concentration had lower induction time (p<0.05). The recovery time was less than 2 min. using 2- phenoxyethanol, MS-222, quinaldine and 50 ppm of benzocaine, but was longer with higher benzocaine concentrations. No variation in opercular frequency or mortality was observed during or after anesthesia. Conclusions. In fingerlings and juveniles, 2-phenoxyethanol (400 ppm) and MS-222 (100 ppm), respectively, are considered the anesthetics of choice for short procedures. Higher concentrations of benzocaine should be used for longer procedures.

Key words: Anaesthetic, Piaractus brachypomus, opercular frequency.

INTRODUCCIÓN

Para su reproducción en cautiverio y cultivo comercial, la mayoría de especies ícticas, son sometidas a condiciones de estrés como la pesca, manipulación y transporte, lo cual puede afectar su sistema inmune e incrementar la susceptibilidad a patógenos, causando morbilidad o mortalidad (1). Una gran variedad de compuestos han sido utilizados para anestesiar peces en prácticas de acuicultura, investigación y salud animal (2,3). Dentro de los compuestos más usados se encuentran, entre otros, 2-fenoxietanol, aceite de clavo, sulfato de quinaldina, benzocaina y metasulfonato de tricaina (MS- 222) (4-6). Sin embargo, algunos anestésicos son clasificados como tóxicos para varias especies acuáticas, lo que implica realizar una rigurosa evaluación de sus efectos antes de recomendar su uso como alternativa para reducir el estrés durante la manipulación (3). No obstante, la eficiencia de determinado anestésico dependerá del desarrollo corporal del individuo y de las condiciones ambientales (5).

Actualmente, MS-222 es el único anestésico aprobado por la FDA (Food and Drug Administration) y EPA (Environmental Protection Agency) para ser usado en peces de consumo (2). No obstante, otros anestésicos como el Aqui-S® están bajo revisión farmacológica por la FDA (3). Dentro de los parámetros que deben tenerse en cuenta para determinar la eficacia anestésica de una sustancia se encuentran: inducción de la anestesia en un periodo inferior a 3 min., tiempo de recuperación no mayor a 5 min., sin toxicidad para los peces ni para las personas que lo manipulan, no generar efectos fisiológicos prolongados ni residualidad en los tejidos, no causar mortalidad en el período post-anestésico, poseer alta solubilidad tanto en agua dulce como salada y finalmente ser económicamente asequible (5,7). En especies nativas colombianas de agua dulce no se conocen estudios de la efectividad ni de toxicidad de anestésicos y el uso de éstos se ha basado fundamentalmente en la extrapolación de estudios en otras especies.

El objetivo del presente estudio fue determinar la efectividad anestésica de cuatro anestésicos en dos etapas de desarrollo corporal (alevinos y juveniles) de la cachama blanca (Piaractus brachypomus), una de las especies ícticas nativas de la Orinoquia Colombiana, de gran importancia para la acuicultura nacional.

MATERIALES Y MÉTODOS

Sitio de Estudio. Estación Piscícola del Instituto de Acuicultura de la Universidad de los Llanos (IALL), localizado en la ciudad de Villavicencio - Meta, Colombia.

Especímenes y fase pre-experimental. Fueron empleados alevinos (7.3 ± 6.8 g) y juveniles (49.6 ± 28.4 g) (n=144) de cachama blanca (Piaractus brachypomus), clínicamente sanos, provenientes de un mismo desove. Alevinos (n = 12) y juveniles (n = 12) fueron sometidos a un período de aclimatación de 10 días en acuarios de vidrio (45 L) con aireación constante, cubiertos externamente con el fin de reducir el estrés. Durante la fase de aclimatación los individuos fueron alimentados con concentrado comercial dos veces al día a una proporción del 3% del peso vivo; sin embargo, 24 h previo a la fase de experimentación el alimento fue suspendido. Se empleó un sistema semi-estático con recambio de agua del 50% cada tercer día y diariamente, para las fases de aclimatación y de experimentación, respectivamente. En los dos grupos se utilizaron acuarios de vidrio para el periodo de anestesia y de recuperación, manteniendo las características físico químicas del agua similares a la usada en la fase de aclimatación. El agua del acuario de recuperación se mantuvo libre de sustancias anestésicas.

Anestésicos utilizados. Como sustancias anestésicas se emplearon 2-fenoxietanol (100% de pureza), benzocaina (100% de pureza), metanosulfonato de tricaina (MS- 222, 100% de pureza) y quinaldina (90% de pureza) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) evaluando en cada grupo etáreo tres concentraciones diferentes de cada anestésico, así: 2-fenoxietanol (200, 400 y 600 ppm), benzocaina (50, 100 y 150 ppm), MS-222 (100, 150 y 200 ppm) y quinaldina (7.5, 15 y 30 ppm). Para facilitar una mayor absorción branquial de los anestésicos, se empleó el método de anestesia por inmersión.

La benzocaina se disolvió en etanol de 98% de pureza (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) y el MS-222 se disolvió en agua con el fin de preparar una solución stock al 10%. Por su parte, el 2-fenoxietanol y la quinaldina se adicionaron directamente al agua del acuario de anestesia sin previa dilución. Las diferentes concentraciones de anestésicos evaluados fueron adicionadas al agua de los acuarios experimentales antes de la inmersión de los peces, con el fin de garantizar la completa dilución de los anestésicos.

Con el fin de determinar si el etanol (solvente de la benzocaina) generaba efectos anestésicos, se preparó una solución al 10% en agua destilada y se evaluó en alevinos y juveniles (n=5), diferentes a los que se emplearon en la fase experimental, teniendo en cuenta las misma variables de respuesta estudiadas para los anestésicos.

Variables consideradas. En este estudio, las variables de respuesta evaluadas fueron el tiempo de inducción, tiempo de recuperación, frecuencia opercular (FO) y la sobrevivencia post-anestesia. Con el fin de establecer con exactitud el tiempo de inducción y de recuperación, así como la frecuencia opercular (FO), estos procedimientos se registraron con una videocámara. Posteriormente, los videos fueron observados en cámara lenta y los datos fueron registrados con un contador digital propio de la videograbación (Sony Slx500 VHS™).

Definición de variables. El tiempo de inducción fue definido como el período transcurrido desde el momento en que el pez fue puesto en contacto con la solución anestésica hasta que sus movimientos operculares disminuyeron y se presentó pérdida del eje de nado (característico de un plano 3 de anestesia) (8). Con el fin de determinar el anestésico y la concentración óptima de anestesia se definió un tiempo de inducción inferior a 3.30 min (1, 9).

El tiempo de recuperación se definió como el período transcurrido entre el retiro del pez de la solución anestésica y la recuperación total del eje de nado (8). Durante este período los peces fueron manipulados para determinar su peso y la longitud furcal. Siguiendo los criterios definidos por Soto y Burhanuddin (10) se seleccionó el anestésico y su concentración anestésica que produjo un tiempo de recuperación inferior a 5 min. Para determinar la variación de la FO durante el período de inducción, se analizaron tres periodos seguidos de filmación de un minuto cada uno, registrados a partir de los 30 seg después de entrar el pez en contacto con el anestésico. Lo anterior con el fin de reducir el error experimental debido a la excitación generada por la inmersión del pez en el acuario de anestesia. Debido al reducido tamaño de los alevinos, esta variable sólo fue posible determinarse en individuos juveniles.

Posterior al período de recuperación los peces fueron transferidos a acuarios de vidrio con agua libre de anestésicos, con aireación constante y mantenidos allí durante 5 días con el fin de determinar la sobrevivencia post-anestesia.

Análisis estadístico. Se empleó un diseño factorial 2x4x3, donde el factor 1 correspondió a los dos grupos etáreos (alevinos y juveniles), el factor 2 a las cuatro sustancias anestésicas (2-fenoxietanol, benzocaína, MS-222 y quinaldina) y el factor 3 a las tres concentraciones de cada anestésico. Para cada concentración anestésica, se llevaron a cabo 12 repeticiones (n=12) en alevinos y juveniles, siendo el pez la unidad experimental.

Los datos obtenidos fueron sometidos inicialmente a estadística descriptiva y expresados como media (±) error estándar (SEM). Para verificar la normalidad de los datos, se realizó la prueba de Bonferroni. Con el fin de detectar diferencias significativas entre tratamientos, se realizó la prueba de Scheffé. Todos los procedimientos estadísticos fueron realizados mediante el software Instat v.3.06 para Windows y en todos los casos p<0.05, fue suficiente para revelar diferencias significativas.

RESULTADOS

En los dos grupos etáreos, no se presentó mortalidad antes, durante, ni después de los experimentos de inducción y recuperación anestésica. Por su parte, a excepción del pH, los parámetros de calidad del agua utilizada en la fase experimental se mantuvieron estables, registrándose una temperatura del agua de 26.1 ± 1.3°C y concentración de oxígeno disuelto de 5.2 ± 1.0 mg.L^-1; sin embargo, el pH varió considerablemente entre las cuatro soluciones de anestésicos evaluados, siendo las sustancias que provocaron mayor acidez del agua el MS-222 (3.6 ± 0.1) y la benzocaina (5.8 ± 0.3). A diferencia, en las soluciones de 2-fenoxietanol y de quinaldina, el pH del agua estuvo cercano a la neutralidad (6.2 ± 0.08 y 6.6 ± 0.07, respectivamente).

En los peces control que fueron expuestos al solvente de los anestésicos (etanol) no se observaron efectos anestésicos ni alteración de la reactividad a los estímulos aplicados. En los alevinos sometidos a las menores concentraciones de 2-fenoxietanol y quinaldina, no fue posible determinar el tiempo de inducción ni de recuperación, debido a la ausencia de efectos anestésicos observables.

Tanto en alevinos como en juveniles, el tiempo de inducción de los cuatro anestésicos evaluados dependió de la concentración utilizada. En los juveniles expuestos a las dos concentraciones más altas de 2-fenoxietanol (400 y 600 ppm), benzocaina (100 y 150 ppm) y quinaldina (15 y 30 ppm), el tiempo de inducción fue significativamente mayor (c.a. 60 y 39 seg, 46 y 42 seg, 72 y 49 seg, respectivamente), cuando comparado con alevinos bajo las mismas condiciones experimentales (p<0.05, Figura 1A, 1B y 2B). Sin embargo, el tiempo de inducción de los alevinos expuestos a las tres concentraciones evaluadas de MS-222 fue significativamente mayor al ser comparado con el de los juveniles (p<0.05) (Figura 2A).

En los alevinos de cachama blanca expuestos a benzocaina, MS-222 y quinaldina se observó que a medida que la concentración anestésica se incrementó, el tiempo de inducción fue significativamente menor (p<0.05). Dicho hallazgo no fue observado en alevinos expuestos a 2-fenoxietanol, en el cual los tiempos de inducción no mostraron diferencias significativas en todas las concentraciones evaluadas (Figura 1B). Por su parte, los juveniles expuestos a 2-fenoxietanol, benzocaina y quinaldina mostraron el mismo comportamiento que los alevinos, en el cual el menor tiempo de inducción fue observado con la mayor concentración (p<0.05).

Finalmente, en juveniles expuestos a MS-222, el menor tiempo de inducción fue observado con la menor concentración (p<0.05).

Al comparar tiempos de inducción todas las soluciones anestésicas en un mismo grupo etáreo, se observó que los alevinos expuestos a una solución de 150 ppm de benzocaina presentaron el menor tiempo de inducción 19 seg, (p<0.05) al ser comparado con los demás tratamientos (Tabla 1). Las siguientes tres concentraciones que mostraron bajos tiempos de inducción (p<0.05) correspondieron a 400 y 600 ppm de 2-fenoxietanol (25 y 26 seg, respectivamente) y 100 ppm de benzocaina (24 seg.). Por su parte, juveniles expuestos a soluciones de 100 y 150 ppm de MS-222, 600 ppm de 2-fenoxietanol y 150 ppm de benzocaina mostraron los menores tiempos de inducción cuando comparados con las demás concentraciones anestésicas (entre 36 y 43 seg., p < 0.05). Por otro lado, los mayores tiempos de inducción en alevinos fueron observados con las concentraciones de 100 ppm de MS-222 (1.8 min) y 7.5 ppm de quinaldina (1.4 min). En los juveniles, el mayor tiempo de inducción fue observado en la concentración de 15 ppm de quinaldina (1.2 min).

Al comparar tiempos de recuperación para todas las soluciones anestésicas, en alevinos y juveniles fue observado un tiempo de recuperación inferior a 2 min. cuando los peces fueron expuestos a las tres concentraciones de 2-fenoxietanol, MS-222 y quinaldina y a 50 mg.l^-1 de benzocaina (Tabla 1). Sin embargo, las concentraciones más altas de benzocaina (100 y 150 mg.l^-1) presentaron tiempos de recuperación significativamente prolongados (p<0.05) en ambos grupos etáreos, alcanzando en los alevinos tiempos de aproximadamente 10 min. (Figura 1B). El anestésico que presentó el menor tiempo (p<0.05) de recuperación fue MS-222 en las concentraciones de 100 y 150 mg.l^-1 (45 y 42 seg., respectivamente) en alevinos y 100 mg.l^-1 (39.5 seg.) en juveniles, comparado con las demás concentraciones anestésicas.

No se observó tendencia alguna en la variación de la frecuencia opercular de juveniles de cachama blanca expuestos a los cuatro anestésicos. En los peces anestesiados con 400 y 600 mg.l^-1 de 2-fenoxietanol se observó menor (p<0.05) frecuencia opercular durante el segundo y tercer minuto (inferior a 90 respiraciones por min.) comparado con los primeros 60 seg. (entre 103 y 114 movimientos por min.). Con la menor concentración de 2-fenoxietanol no se observaron diferencias durante los tres minutos evaluados (p>0.05) (Figura 3A). En los peces anestesiados con benzocaina se observó disminución de la frecuencia opercular a medida que la concentración se incrementó (p<0.05). A este respecto, una dramática disminución (menos de 19 movimientos operculares por min.) en la FO fue observada en los peces expuestos a 100 y 150 mg.l^-1 de benzocaina (p<0.05) (Figura 3B).

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