Artículo de revisión

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Uso de biomateriales a partir de la fibroína de la seda de gusano de seda (Bombyx mori L.) Para procesos de medicina regenerativa basada en ingeniería de tejidos

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Duverney Gaviria Arias ¹; Lyda Cenobia Caballero Mendez²

¹ Facultad de Ciencias de la Salud/Universidad Tecnològica de Pereira. Facultad de Ciencias de la Salud. Universidad Libre

² Centro de Biología Molecular y Biotecnología (CENBIOTEP)/Facultad de Ciencias de la Salud/Universidad Tecnològica de Pereira

correo electrónico: duverney.gaviria@gmail.com

Fecha de Recepción: 6/09/2014

Fecha de Solicitud de Correcciones: 10/12/2014

Fecha de Aceptación: 02/05/2015

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Resumen

La regeneración de tejidos usando células, andamios y factores de crecimiento apropiados es un enfoque clave en las terapias de regeneración de tejido o de órganos. La fibroína de la seda, ha demostrado que puede ser utilizada eficazmente como un material de andamiaje en estos tratamientos. Las fibras de seda se obtienen de diversas fuentes animales, tales como arañas, gusanos de seda, escorpiones, ácaros y las moscas. La seda extraída a partir de capullos del gusano de seda (Bombyx mori L), se caracteriza por sus excelentes propiedades mecánicas, biocompatibilidad y biodegradabilidad que le permiten ser una fuente adecuada para el desarrollo de dispositivos biomédicos. La combinación única de elasticidad, resistencia y compatibilidad con células de mamíferos hace de la fibroína de la seda un material atractivo para la ingeniería de tejidos. Esta revisión aborda el procesamiento de fibroína de la seda en diferentes formas de biomateriales, sus aplicaciones, ventajas y limitaciones como biomaterial de andamiaje en la ingeniería ósea, vascular, de piel, cartílagos, ligamentos, tendones y de tejidos cardíaco, nervioso, ocular y vesical.

Palabras clave: Biomaterial, Fibroina, Ingeniería de tejidos, Medicina regenerativa

Fibroin from silkworm (Bombyx mori L ) as biomaterial used in regenrative medicine process based on tissue engineering

Abstract

Tissue regeneration using cells, scaffolds and appropriate growth factors is a key approach in therapy for tissue or organs regeneration. The fibroin from silk has been shown to be effectively used as a scaffold material in these treatments. Silk fibers are obtained from various animal sources, such as spiders, silkworms, scorpions, mites and flies. The silk extracted from silkworm's (Bombyx mori L.) cocoons, is characterized by its excellent mechanical properties, biocompatibility and biodegradability this characteristics makes silk be a suitable source for the development of biomedical devices. The unique combination of elasticity, strength and compatibility with mammalian cells made of silk fibroin attractive for tissue engineering material. This review addresses the processing of silk fibroin in different forms of biomaterials, applications, advantages and limitations as a biomaterial scaffold in tissue engineering for bone, vascular tissues, skin, cartilage, ligaments, tendons, heart tissue, nervous , eye and bladder.

Keywords: Biomaterial, Fibroin, Tissue engineering, Regenrative medicine

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Introducción

La baja disponibilidad de donantes y el aumento en la morbilidad debida a los procesos de trasplantes han establecido nuevas demandas en las tecnologías de ingeniería de tejidos (IT) como estrategia de tratamiento en fallos orgánicos (1). El enfoque de IT implica la regeneración del tejido en un soporte adecuado con el objetivo de implantarlo en el sitio objetivo. La regeneración del tejido funcional requiere un adecuado microambiente que imita el sitio original, con el fin de obtener una respuesta celular adecuada (1). Dicho entorno es proporcionado por una matriz 3-D de ingeniería de tejidos o andamio, el cual proporciona las condiciones adecuadas para el crecimiento celular a la vez que orienta la forma del órgano o tejido a reparar (2). Además de la biocompatibilidad, requisito previo esencial para cualquier biomaterial, la capacidad de coincidir con el tiempo de degradación normal del tejido u órgano en el cual este va a ser implantado, es un requisito crítico para un material celular de andamiaje. Tales características mantienen las propiedades mecánicas y la integridad estructural del andamio en todas las etapas de su proceso de regeneración. Además, los productos de degradación del biomaterial se deberían metabolizar de forma segura y ser entonces eliminados del organismo. Materiales como polímeros, metales y cerámicas se utilizan ampliamente como andamios para el crecimiento celular en la ingeniería de tejidos. Se han ensayado polímeros sintéticos y naturales cada uno de los cuales tiene sus propias ventajas y limitaciones, por ejemplo, mientras que los materiales sintéticos permiten un fácil procesamiento y maleabilidad, los polímeros naturales poseen mejor cito y biocompatibilidad (3). No existe un biomaterial universal que cumpla con los requisitos de los andamios para todos los tejidos, es por lo tanto necesaria la obtención de diferentes construcciones con características físicas, propiedades mecánicas y de degradación específicas para los diferentes tejidos. Por tanto, la investigación de un biomaterial universal es una línea de trabajo muy importante en medicina regenerativa. Diferentes tipos de proteínas tales como: colágeno, elastina, péptidos similares a la elastina, la albúmina y la fibrina se utilizan como material de suturas, andamios de tejidos, agentes hemostáticos y de distribución de medicamentos (4). La fibroína del gusano de seda es un biopolímero natural con una larga historia de aplicaciones en el cuerpo humano como suturas. Actualmente las suturas de seda se utilizan en los labios, los ojos, boca y en el tratamiento de heridas de la piel (5). La fibroína de la seda se usa cada vez más en otras áreas de la ciencia biomédica, como resultado de los nuevos conocimientos en la manera en cómo esta puede ser procesada y como propiedades tales como la resistencia mecánica, elasticidad, biocompatibilidad y biodegradabilidad pueden ser controladas (5). Estas propiedades de la fibroína de la seda son particularmente útiles para la ingeniería de tejidos. Además, estudios recientes evalúan la seda como parte de un dispositivo electrónico flexible para el registro fisiológico y funcional en tiempo real, y el desarrollo de sistemas ópticos que pueden ser usados en el diagnóstico y tratamientos de diferentes patologías (6, 7). La seda posee una excelente transparencia óptica (ca. 95%), una superficie con una notable suavidad y procesamiento en soluciones acuosas, todo lo cual facilita su aplicación como biosensores en óptica y fotónica (6, 8). Los sistemas basados en seda son implantables y tienen la funcionalidad y sensibilidad necesaria para aplicaciones avanzadas (2, 5, 9, 10). Esta revisión se centra en la investigación basada en el uso de la fibroína de la seda en el campo de la regeneración de tejidos y se evalúan sus perspectivas para un mayor desarrollo en las aplicaciones terapéuticas relacionadas.

Seda de gusano de seda. Las proteínas de seda están presentes en las glándulas productoras de seda de artrópodos (gusanos de seda, arañas, escorpiones, ácaros y abejas) y se enrollan en forma de fibras durante su metamorfosis. La fibra de seda del gusano de seda es ampliamente utilizada en la industria textil desde hace más de 5000 años. A diferencia del gusano de seda, las arañas no pueden ser mantenidas juntas en grandes cantidades dada su naturaleza caníbal (5). Adicionalmente, mientras que un capullo de gusano de seda puede tener entre 800-1500m de seda, la glándula ampollacea de la araña produce 137m y su red solamente contiene 12m (11). Por estas razones la seda del gusano de seda es preferida como biomaterial. Sin embargo, la familia Bombycidae no es la única que la produce, ya que la familia Saturniidae en este mismo orden, también lo hacen. La seda tiene varias ventajas sobre otros biomateriales a base de proteínas, que se derivan de tejidos de origen alogénico o xenogénico, ya que con estos existe el riesgo de infección, adicionalmente el procesamiento de tales materiales es costoso debido a los protocolos necesarios para su aislamiento y purificación. La seda a diferencia de estos materiales es una fibra textil con una producción anual de 1000 toneladas métricas, y la obtención de la fibra de fibroína se realiza rutinariamente ya sea mediante un tratamiento alcalino o enzimàtico, que deja la fibra libre de sericina la cual es muy inmunogénica. La seda posee gran peso molecular (200-350 kDa o más) con grandes dominios repetitivos hidrófobos modulares interrumpidos por pequeños grupos hidrófilos (12). Los extremos N y C de la fibroina de la seda son altamente conservados (5). La fibroina de la seda de B. mori se compone de una cadena pesada (H), una cadena ligera (L) unidas entre sí por un enlace disulfuro (13) y una glicoproteina con un peso molecular de 25 kDa llamada P25, la cual se encuentra unida de manera no covalente a las cadenas L y H (14). La cadena H contiene dominios hidrófobos constituidos por residuos de G-X (X= A, S, T o V) los cuales se repiten y forman hojas β antiparalelas. La cadena L en cambio es de naturaleza hidrófila y relativamente elástica. P25 por su parte desempeña un importante papel al mantener la integridad del complejo (15, 16). En el gusano de seda la fibroina, la sericina y la proteina P25 se ensamblan manteniendo una relación de 6:6:1 (17). Algunos lepidópteros producen seda en la cual no hay cadena ligera ni tampoco P25, en lugar de esta producen un homodimero de cadena pesada con un peso de 330 kDa (18). La seda de la familia Saturniidae exhiben una mayor relación A/G y bloques poli-alanina, que forman hojas β (19). Estas también tienen una mayor proporción de aminoácidos con características base/ácido, polar/no polar, voluminosos/no voluminosos y hidrófilo/ hidrófobo (20, 21). Como resultado de estas variaciones, hay diferencias significativas en las propiedades mecánicas, bioactividad y el comportamiento de degradación con relación a la seda de la familia Bobycidae (22). Aparte de la organización en la estructura primaria, secundaria y jerárquica de la fibroína de la seda que determina muchas de sus propiedades como biomaterial, los dominios hidrófobos de las cadenas poliméricas de la seda se ensamblan en forma de nano-cristales (β-hoja). Estos dominios hidrófobos consisten de cadenas laterales polares y voluminosas que forman la parte amorfa de la estructura secundaria (23, 24). La conformación de la cadena en bloques amorfos es una espiral aleatoria es lo que da la elasticidad a la seda (25, 26). Los factores críticos que determinan las propiedades mecánicas de cualquier seda particular son debidos al preciso control de tamaño, el número, la distribución, orientación y disposición espacial de los dominios cristalinos y no cristalinos a escala nanométrica entre los tipos de seda, todas las fibras de seda de gusanos de seda siguen arreglos jerárquicos estructurales semejantes. (5, 27). Los nano-cristales contribuyen a las propiedades mecánicas sobresalientes de la seda, a pesar de los defectos en la microestructura en forma de vacuolas y micro-huecos (23, 28). Aparte de la estructura secundaria, una organización jerárquica supra molecular es también evidente en las fibras de seda (24). Las sedas de araña y gusanos de seda se componen de paquetes de microfilamentos (0.5-2 micras), cada uno de los cuales está hecho de nano-cristales y / o semi dominios cristalinos (29-31).

Características de la fibroma como biomaterial. Las principales ventajas de la seda en comparación con otros biopolímeros naturales son sus excelentes propiedades mecánicas, buena biocompatibilidad, la posibilidad de realizar su procesamiento en soluciones a base de agua, biodegradabilidad y la presencia de grupos químicos de fácil acceso para llevar a cabo modificaciones funcionales (32). La seda ofrece un equilibrio atractivo en el módulo de Young, resistencia a la rotura, y elongación, que contribuye a su buena tenacidad y ductilidad. Las fibras de seda son más duras que el Kevlar (poliparafenileno tereftalamida) (26, 33). La relación de resistencia a la densidad de la seda es hasta diez veces más alta que la del acero (34). Las fibras de seda de araña, en particular, tienen una alta extensibilidad y exhiben un comportamiento de endurecimiento por deformación marcada (35). Tal comportamiento es similar al presentado por las fibras producidas por el gusano de seda (23, 36). Teniendo en cuenta la buena resistencia y tenacidad de las fibras de seda, no es de extrañar que la seda haya sido explotada para desarrollar andamios para la ingeniería de tejidos. Sin embargo, en el diseño actual de los biomateriales basado en seda, la amplia propiedad mecánica de este material no se aprovecha plenamente. Un implante de biomaterial generalmente falla debido a sus malas propiedades mecánicas, por lo tanto, las variaciones en estas propiedades de diferentes tipos de seda proporcionan una buena elección orientada a ajustar estas al tipo de uso. Es importante señalar que a pesar de las excelentes propiedades mecánicas de las fibras de seda nativas, la mayoría de los materiales de seda desarrollados a partir solución de fibroína de seda son débiles y quebradizos. Por ejemplo, la tracción en seco, la fuerza de la película de seda es de aproximadamente 0,02 GPa y un alargamiento a la rotura es menos del 2% en comparación con fibras nativas que tienen una resistencia a la tracción de cerca de 0,5-0,6 GPa y un alargamiento a la rotura de 10-40% (23, 37). Tal diferencia se puede atribuir a la falta de una adecuada estructura secundaria en los materiales regenerados en comparación a las fibras nativas (38, 39). Los estudios recientes muestran que hay elementos para mejorar significativamente la resistencia de los productos de seda regenerados al nivel de las fibras nativas o incluso a niveles superiores a través de la manipulación de la estructura durante la regeneración (40, 42). La fibroína de la seda es soluble en agua cuando se encuentra en su forma de a-helice o de plegamientos aleatorios. La solubilidad puede mantenerse durante días e incluso semanas dependiendo de la temperatura de almacenamiento, pH y concentración de la solución de seda (43). Por lo tanto, los sistemas basados en seda se pueden preparar usando soluciones acuosas y en condiciones suaves, como temperatura ambiente, pH neutro y sin aplicación de la fuerza de alto cizallamiento. Tales condiciones son favorables para el uso de este material en el desarrollo de sistemas de liberación controlada de fármacos sensibles (44, 45). Las condiciones de procesamiento suaves también son útiles para dispositivos como biosensores fotónicos o electrónicos, que pueden ser incorporados dentro de un sistema basado en seda o recubierto con seda para mejorar la bio-integración in vivo. La transición de a-hélice y plegamientos aleatorios hacia hojas-β, que son altamente estables, es necesaria en los productos de seda con el fin de proporcionar una buena resistencia a la disolución, la degradación térmica y enzimática. Esto se puede lograr a través de tratamientos con vapor de agua, estiramiento mecánico y ultrasonido, evitando de esta manera el uso de productos químicos nocivos. Estas ventajas de procesamiento y buena estabilidad estructural en los materiales fabricados de seda son prometedoras con relación a aplicaciones relacionadas con sistemas biológicos (46).

Manipulación de las características estructurales de la fibroma.

La estructura de la seda puede ser ajustada adecuadamente durante el hilado o regeneración para obtener diferentes estructuras secundarias con el fin de manipular las propiedades del material. Por ejemplo, la extrusión de la proteína de glándula de seda forzada a través de hileras de gusanos de seda permite alcanzar la microestructura apropiada de la fibra, alterando significativamente la tenacidad de la fibra, mediante variaciones en el pH y las concentración de sales (47). Este tipo de ajustes permiten modificar los materiales de seda, ofreciendo la ventaja de hacer coincidir sus propiedades de soporte de carga con la de los tejidos objetivo. Las técnicas de renaturalizacion por vapor de agua (water annealing) también se utilizan para inducir insolubilidad en productos de seda (48, 49), películas tratadas con estos métodos son más flexibles y se degradan más rápido que aquellas tratadas con metanol (48). Por otra parte, las variaciones en los procesos pueden afectar propiedades tales como la biodegradación (50), la interacción de células (51) y la cinética de liberación de fármacos (52, 53) etc. Estos resultados demuestran que son necesarios más estudios para entender las relaciones estructura-propiedad relacionada con el control de las propiedades del material. Dicho control será una clave para el éxito de la seda como un biopolímero natural para la regeneración de tejidos.

Diversificación morfológica de los biomateriales de seda usados en la regeneración de tejidos. El desgomado (eliminación de la sericina) es el primer paso en el procesamiento de la fibra de seda. En algunos casos en los cuales es difícil disolver las fibras de seda, la fibroína se puede extraer directamente de las glándulas de los gusanos de seda utilizando una solución tampón apropiada (54). Las fibras de seda desgomada se pueden utilizar para formar diversas estructuras como cuerdas, cables trenzados e hilados texturados (38). Además, los capullos también se utilizan para construir estructuras no tejidas disolviéndolos parcialmente y utilizándolos como un modelo de soporte para células, en el cual se mantiene la disposición de los filamentos en el capullo para mantener la estructura porosa del tejido (38, 55). Una forma alternativa de utilizar los filamentos de seda directamente en la ingeniería de tejidos es haciendo una estructura de tejido de seda para reforzar soportes 3-D. Dicho refuerzo mejora las propiedades mecánicas de los andamios para aplicaciones en las que se requiere soportar cargas como en el caso de los ligamentos (56, 57). Para preparar la solución de seda para la regeneración de diferentes formatos estructurales como películas, hidrogeles, esponjas de seda, los esfuerzos se han concentrado en el uso de soluciones acuosas de sales caotrópicos tales como LiBr, CaCl2 / etanol / agua, LiSCN (5862).

Películas

Las soluciones para la fabricación de películas de fibroína de seda se pueden producir mediante el uso de soluciones acuosas (63), soluciones acidas (40, 63) y solventes iónicos (64). La fabricación de películas de seda se ha reportado también por procesos de recubrimiento por rotación y el proceso de Langmuir-Blodgett (LB) (64-66). Debido a que estas películas son inestables, se han desarrollado técnicas como el secado controlado (67), el water annealing (68), la extensión (69), y la inmersión en alcohol; todas ellas tienen como objeto el lograr mejorar la formación de estructuras secundarias de tipo hoja-β y de esta manera incrementar la cristalinidad.

Hidrogeles

Los hidrogeles de seda se forman a través de transición solución-gel (sol-gel) de una solución acuosa de fibroína de seda en presencia de ácidos, agentes deshidratantes, iones, sonicación o liofilización (7073). La transición sol-gel puede ser acelerada por el aumento de la concentración de proteína, temperatura, y la adición de Ca₂+ (74). Los hidrogeles de seda pueden ser útiles como sistemas inyectables o sistemas de administración no inyectables. Las propiedades mecánicas de la seda en forma de hidrogeles han mostrado propiedades adecuadas para la preparación de andamios, que necesitan soportar carga, como en el caso de la regeneración de cartílago (75).

Espumas

Las esponjas porosas 3-D son estructuras ideales para ingeniería de tejidos, ya que imitan estrechamente el microambiente fisiológico in vivo. Los andamios de seda se preparan mediante secado por congelación, lixiviación de porógenos y técnicas de fabricación libres de sólidos (76-78). El liofilizado de esponjas produce tamaños de poro por debajo de 100 micras aunque este se pueden controlar mediante el ajuste de la temperatura de congelación, pH de la solución y la cantidad de disolventes orgánicos (78). Adicionalmente la congelación repetida y los procesos de descongelación pueden aumentar tamaños de poro desde 60 hasta 250 micras (77). Un mejor control sobre la estructura de poros se puede lograr a partir de la fundición y posterior lixiviación de partículas o mediante métodos de generación de espumas con el uso de gases (76). Debido al control que se puede tener sobre la porosidad y tamaños de poro, este tipo de andamios se utilizan comúnmente en aplicaciones de ingeniería tisular, predominantemente para hueso y cartílago (79). La mala compatibilidad entre componentes da como resultado una mezcla no homogénea, separación de fases y reacciones adversas en los tejidos (80), para asegurar una buena compatibilidad, los andamios compuestos de seda estos se fabrican mediante la incorporación de partículas de seda molida, lo que resulta en una mejora significativa en el módulo de compresión de menos de 50 kPa a aproximadamente 2,2 MPa (81). Otras modificaciones incluyen el refuerzo de los andamios con el uso de fibras de seda para obtener una mejora adicional en el módulo de hasta aproximadamente 13 MPa (82). Tales propiedades mecánicas pueden ser suficientes para la regeneración de hueso esponjoso, pero todavía se encuentran en desarrollo con el fin de que cumplan con los requisitos prácticos de soporte de carga en procesos de ingeniería de tejidos para tejido óseo.

Partículas

La generación de micro y nano partículas de seda se realiza a partir de la solución de seda por liofilización y posterior molienda (83), secado por aspersión (84), ruptura por aceleración (85), auto-ensamblaje (86, 87) y congelación/descongelación (88). Si bien las partículas de seda son utilizadas para el refuerzo de los andamios con el fin de mejorar las propiedades mecánicas y los resultados celulares, estas partículas de seda regenerada se utilizan principalmente como sistemas para el transporte de medicamentos y liberación controlada (32, 81, 88-90). Por lo tanto, será de interés ver si las partículas pueden desempeñar la doble función de mejorar las propiedades mecánicas de los andamios y al mismo tiempo actuar como un sistema portador de factores de crecimiento para la regeneración rápida del tejido afectado.

Biocompatibilidad

La larga historia del éxito de las suturas de seda ha hecho que esta sea conocida como un material biocompatible (29, 33, 91). Sin embargo, como cualquier otro biomaterial, no autólogo, este puede causar respuesta a cuerpo extraño sobre todo debido a su origen no mamífero. Algunos casos de hipersensibilidad retardada de suturas de seda puede ser ocasionada a la presencia de la proteína sericina (34, 35). Sin embargo, otros estudios que emplean sericina de seda aislada y biomateriales basados en sericina no han proporcionado clara evidencia para sugerir la sericina como fuente de efectos adversos (36). El uso de soportes basados en fibroína no han mostrado signos de infección durante la implantación subcutánea de esteras de fibras generadas mediante electro-hilado en ratas durante un máximo de 8 semanas, aunque en algunos casos se ha identificado la acumulación típica de los fagocitos y los linfocitos como respuesta a cuerpo extraño (92). Los soportes 3D de seda implantados subcutáneamente en ratas han mostrado una respuesta inmune mínima, inclusive después de un año de implantación, con niveles de TNF-α IFN-δ, IL-4, IL-6 e IL-13 muy bajos (70). En cerdo como modelo de ingeniería de tejido para ligamento no se observó evidencia de mal funcionamiento después de 24 semanas de cultivo in vivo (56). En general, estos estudios ofrecen datos que sugieren que los productos de seda tienen buena biocompatibilidad y se pueden comparar con otros biomateriales usados comúnmente, tales como ácido poliláctico y colágeno (91). Por ejemplo, las pruebas de Biocompatibilidad, ISO 10993 de Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP), muestran que el material Seri Fascia, malla quirúrgica basada en seda cumple los requisitos de biocompatibilidad (93). Sin embargo, a pesar de los alentadores resultados, todavía quedan algunas preguntas relacionadas con la seguridad a largo plazo de biomateriales de seda en el cuerpo humano. En primer lugar, las suturas de seda permanecen en el cuerpo sólo por un tiempo limitado hasta que se eliminen dependiendo del periodo de cicatrización de la herida. Como los productos de seda para ingeniería de tejidos están obligados a estar en contacto con los tejidos por un período de tiempo prolongado, las respuestas inmunes innata y adaptativa a largo plazo merecen una mayor investigación. En segundo lugar, puede haber preocupaciones sobre la reacción inmune en respuesta a los productos degradados de biomateriales de seda, dependiendo de su tamaño y morfología (36). Se reconoce que una de las principales causas de la insuficiencia de cualquier implante de biomaterial es la generación de desechos de partículas, que pueden activar el sistema inmune. El reporte muestra que las fracciones de fibras de seda son capaces de inducir una mínima producción de citocinas proinflamatorias y el aumento de la fagocitosis (39). Los productos degradados de fibroína de la seda, también pueden causar la amiloidogénesis según lo informado por Lundmark et al. (50). Su observación sugiere la potencialidad de soluciones de seda de B. mori para facilitar la acumulación de amiloide, lo que resulta en la degeneración del tejido. Por lo tanto, las investigaciones a largo plazo sobre los productos de degradación de los biomateriales de seda son necesarias con el fin de aliviar completamente cualquier inquietud para el uso de andamios de seda en aplicaciones clínicas.

Biodegradación

La biodegradación de seda se estudia con base a la pérdida de masa, cambio en la morfología y análisis de los productos degradados in vitro. Del mismo modo, la degradación se prueba en modelos animales mediante la evaluación de las propiedades mecánicas de la seda después de la implantación durante cierto tiempo y el estudio estructural de la integridad de los exámenes histológicos, tinción fluorescente y diversos ensayos bioquímicos. La fibroína regenerada se degrada mucho más rápido que las fibras y su velocidad de degradación depende de la estructura secundaria de la seda resultante de la preparación de los materiales de seda regeneradas (68). La termo biodegradabilidad se utiliza a menudo para tratar el tema de la desintegración de materiales de seda. De acuerdo con la definición de (94) la biodegradabilidad es la capacidad de descomposición de un polímero implantable por elementos biológicos dando fragmentos, que pueden moverse lejos del sitio a través de transferencia de fluido, pero no necesariamente del cuerpo (94). Por otra parte, la bio-sorción es la eliminación total del material extraño inicial a través de la filtración o la metabolización de los bio-productos de degradación. Con relación a estos procesos en seda Wang et al. (70) mostraron que los andamios 3D de seda preparados con soluciones acuosas se desintegraron en pocas semanas y desaparecieron completamente después de 1 año. Se ha observado que los biomateriales de seda no solamente son biodegradables sino también bio-reabsorbibles en procesos mediados por los macrófagos (70). En modelos in vitro se ha determinado que la proteasa XIV de Streptomyces griseus (95-99), y la a-quimotripsina de páncreas bovino (96, 97, 100) son capaces de promover la degradación de los materiales fabricados de seda, de igual manera se ha identificado que las células in vitro, osteoblastos y osteoclastos podrían erosionar películas de seda a través de la expresión de las metaloproteinasas (MMPs) e integrina (101). Estos resultados son alentadores en la medida que la matriz extracelular nativa se remodela continuamente in vivo por proteólisis de MMPs y la regeneración de la matriz (102). La seda tiene claras ventajas sobre otros biomateriales en varios aspectos de biodegradación. Por ejemplo con biomateriales sintéticos como poliglicólidos y poliláctidos, que son aprobados por las autoridades reguladoras ya que los productos degradados se reabsorben a través vías metabólicas, sin embargo, la liberación de subproductos ácidos es un tema de preocupación. Estos problemas no se presentan con la seda, además, los materiales sintéticos pierden sus propiedades muy temprano después de la implantación (4, 103). Por otro lado, la conservación de la fuerza durante un largo tiempo por muchos sistemas de seda puede ser una ventaja particularmente en aquellos en donde la degradación lenta se requiere con el fin de mantener la capacidad de soporte de carga. A pesar de tales ventajas, un conocimiento profundo de los procesos de degradación y eliminación de seda necesita mayor investigación.

Aplicaciones de los biomateriales de fibroina de gusano de seda en ingenieria de tejidos. La sustitución de una parte del cuerpo humano por un biomaterial requiere de una buena comunicación entre el hospedero y el sistema implantado con el fin de lograr resultados exitosos. Con la intención de superar las posibles limitaciones, la fibroina de seda ha sido evaluada en múltiples modelos para ingeniería de tejidos como se describen a continuación.

Regeneración de tejido vascular.

Los tejidos vasculares basados en seda regenerada se utilizan clínicamente como dispositivos para la desviación de flujos y “stents” (104, 105). En el caso de un estudio relacionado con dispositivos para la desviación del flujo, dos de los tres pacientes mostraron resultados prometedores, lo que sugiere que la seda puede ser una opción atractiva para el tratamiento de aneurismas (46). Los “stents” de seda también se han empleado para la reconstrucción de un aneurisma intracraneal. Se han desarrollado intentos exitosos para fabricar elementos tubulares ~ 3 mm con un grosor de 0,15 mm y una resistencia media a la tracción de 2,42 MPa (106). La resistencia a la rotura de los vasos tubulares de seda está en el nivel de los 811 mm Hg en comparación con 1800 mm de Hg de la safena, estándar de oro para estudios en venas (107, 108). La implantación de injerto vascular fabricado de fibroína de seda en aorta abdominal de ratas resulto en excelente permeabilidad (ca. 85%) después de un año (109). De igual manera el uso de compuestos construidos con seda y colágeno o con compuestos sintéticos como etilenglicol, diglicoldiglicidil poli éter se han usado con éxito para desarrollar construcciones vasculares (110). Los requerimientos críticos para el diseño de los vasos sanguíneos incluyen la supervivencia en virtud de los cambios en la presión arterial, la capacidad de sostener la carga cíclica, compatibilidad con los vasos adyacentes y el revestimiento anti-trombótico (111). Se ha identificado que la fibroína de seda posee una superficie antitrombótica con buena resistencia a la alta presión arterial y el estrés de flujo cortante (69, 112). El desafío en este tema se relaciona con la inclusión de las células correspondientes, como pueden ser células endoteliales humanas primarias y líneas celulares endoteliales (HPMEC-ST1.6R e ISO-HAS-1) (113).

Regeneración de tejido nervioso

El sistema nervioso humano se clasifica en (a) sistema nervioso central (SNC) y (b) sistema nervioso periférico (SNP). El SNP es capaz de lograr la recuperación de lesiones menores, mientras que las grandes deben ser tratadas quirúrgicamente con injertos de nervios de otras partes del cuerpo. Por lo tanto, en tales tratamientos, la ingeniería de tejidos es muy pertinente y la compatibilidad del material de andamiaje con células neuro-progenitoras toma una gran importancia. Por ejemplo, la fibroína de seda soporta la viabilidad de ganglios de la raíz dorsal y las células de Schwann sin afectar su fenotipo o funcionalidad (114). Compuestos de fibroína de seda con quitosano o poli (ácido L-láctico-cocaprolactona) son capaces de cubrir un defecto en el nervio ciático en un espacio de 10 mm de largo en ratas (115-117). En otros trabajos se identificó que la mezcla de fibroína de seda de B. mori y fibra Araña X ® (a la seda de araña como la fibra) permitió tender un puente en un tramo de nervio de 13 mm en 12 semanas (118). Los avances en este tema se han orientado a la producción de poros y la adición de factores neurotróficos para el crecimiento neuronal, con el fin de mejorar el resultado de los injertos de nervio basados en seda.

Regeneración de piel

La piel es el órgano más grande en el ser humano y actúa como barrera para organismos infecciosos. Tiene una capacidad de auto-sanación limitada y en el caso de daños grandes la piel pierde su integridad, lo que puede llevar a la muerte. La piel humana adulta consta de dos capas principales: la epidermis (capa queratinizada) y la dermis (capa rica en colágeno). Estructuras como glándulas sebáceas, pelos y glándulas hormonales se generan desde la dermis. Esta complejidad estructural hace que los procesos de ingeniería de tejidos en la piel sean difíciles. Y aunque la fibroína de seda soporta fácilmente el crecimiento tanto de queratinocitos como fibroblastos humanos (69), la complejidad estructural del tejido nativo requiere un material de andamiaje compuesto. Se ha estudiado el uso de capas de fibroína con colágeno-I observándose que se mejora la fijación y la dispersión de los queratinocitos, mientras que el recubrimiento con fibronectina fomenta tanto la adhesión como la dispersión de los queratinocitos y fibroblastos dentro de la matriz (119). Estos hallazgos sugieren, por lo tanto, que mezclas de fibroína de seda puede tener una mejor perspectiva, que el uso de fibroína de seda pura para la regeneración de piel.

Regeneración de tejido óseo

El hueso es un tejido conectivo especializado compuesto por una matriz calcificada extracelular, que contiene colágeno tipo I e hidroxiapatita como componentes principales (120). Así, el material de andamiaje para ingeniería de tejidos en hueso debe asegurar la tenacidad de la matriz y la deposición de la misma. En este contexto, la fibroína de la seda es una elección racional por su alta resistencia a la fuerza mecánica junto con una buena bio-compatibilidad. La fibroína de seda usada en ingeniería de tejido óseo es una de las más estudiadas de la ingeniería de tejidos (10). Los andamios de fibroína porosa para la generación de constructos de hueso son capaces de estimular el desarrollo avanzado de tejidos óseos dentro de 5 semanas (79). Los andamios de fibroína de seda también promueven el proceso de curación basados en células madre mesenquimales humanas para defectos femorales en ratones desnudos (121). De igual manera el uso de compuestos de seda con armazones de polietileno adicionadas con proteína morfo genética de hueso tipo 2 y células madre mesenquimales han permitido la regeneración de hueso como tejido (122). La incorporación de nanopartículas de hidroxiapatita en la matriz de seda ha tenido como resultado mejorar la regeneración ósea en animales (90, 123). La incorporación de n-Hap (nanohidroxiapatita) dentro de la hoja de fibroína y el posterior cultivo de células madre mesenquimatosas de medula ósea (BM-MSC) de rata, demostraron con éxito la diferenciación de BMMSCs (14) hacia tejido osteoblastico. Una de las estrategias a mejorar en la regeneración de hueso usando compuestos de seda, es la vascularización de los modelos in vitro (124). Por ejemplo, se ha identificado que los poros son necesarios para obtener el tejido óseo 3-D completamente vascularizado.

Regeneración de cartílago

El cartílago es un tejido conectivo no vascular y no inervado. Los procesos de ingeniería de tejidos para la generación de andamios 3-D para el crecimiento de condrocitos con el uso de fibroína porosa (125-128), han usado estrategias como electro-hilado de fibras de seda tratados con microondas inducida por plasma de argón (129), fibroína de seda mezclada con quitosano (130) o sistemas de esponjas generadas por reticulado de quitosano-fibroína(131). El factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF-I) es una molécula reguladora en la condrogénesis (132), por lo tanto puede ser incorporado dentro de andamios para mejores resultados condrogénicos (132). El uso de biorreactores proporciona la estimulación mecánica y la maduración de construcciones cartilaginosas (133), identificándose que los factores hidrodinámicos generados en un bioreactor son importantes en el resultado condrogénico. Otros factores que deben tenerse en consideración para la regeneración de los tejidos cartilaginosos son fuentes de células (134), arquitecturas de andamios, tamaños de poro y la distribución de los poros.

Regeneración de ligamentos tendones

La ingeniería de los ligamentos y tendones requiere andamios fabricados con materiales con una excelente combinación de resistencia mecánica, elasticidad, tenacidad e integridad estructural. El primer proceso exitoso para la generación de un ligamento cruzado anterior (LCA) utilizo como andamio un sistema tipo cable retorcido de fibras de seda que presento propiedades mecánicas comparables a LCA humano (38). La incorporación sinérgica de fibras de seda en matrices de colágeno (135), el recubrimiento de fibroína de seda generadas por electro-hilado de nano fibras con el uso del ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA) (136), la adición de factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) y factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) han estimulado la bioquímica y vías mecánicas para la regeneración de tejido del ligamento (137). Los andamios de fibroína de seda también han sido capaces de reparar los defectos en el tendón de Aquiles en estudios realizados en conejos blancos de Nueva Zelanda (138).

Regeneración de tejido cardiaco

La pérdida de cardiomiocitos después de la lesión reduce la función cardíaca, lo que conduce a una mayor morbilidad y mortalidad. Un tratamiento posible es la ingeniería de un corazón artificial o parche cardiaco generado in-vitro seguido por la implantación de este. El quitosano, ácido hialurónico (HA) o soporte de fibroína de seda sembrados con células madre mesenquimales de rata han sido usados para la generación de parches cardiacos (139). Andamios 3-D de fibroína de seda de A. mylitta mostraron buenos resultados, sin el empleo de otro material como matriz extracelular, produciendo cardiomiocitos de rata in vitro (140). Los temas críticos que quedan por resolver son las características estructurales de seda o de compuestos que funcionen como biomateriales que soporten la fuerza mecánica de las válvulas del corazón.

Regeneración de tejido ocular

El enfoque de aloinjerto para la regeneración de los tejidos de la córnea tiene inconvenientes biológicos asociados (141) mientras que el uso de fibroína de seda ha mostrado mejores resultados. Características como la transparencia óptica de las películas de fibroína de seda y la estabilidad en solución acuosa a pH neutro son las características clave que la seda tiene a su favor para aplicaciones en bio-fotónica(6). Por ejemplo, películas de seda se pueden apilar en una estructura porosa 3-D imitando de cerca la organización helicoidal de la córnea in vivo. Cuando estas estructuras 3-D son cultivadas con fibroblastos corneales de humanos y de conejo, las células mostraron la morfología típica de los queratocitos de la córnea (142). Los implantes de fibroína de seda en la córnea del conejo adicionada con células epiteliales, se vuelven translúcidas a las 4 semanas, y forman nuevo limbo y vasos sanguíneos a las 8 semanas posteriores a la implantación. La regeneración completa de la córnea del conejo se produce a las 16 semanas, dejando atrás unas cuantas piezas opacas de andamios degradados (143). Se reporta que el recubrimiento de fibroína con colágeno IV, fibronectina, condroitina y mezclas de sulfato-laminina mejora el rendimiento de fibroína como biomaterial (144, 145), estas características abren nuevos caminos a los biomateriales basados en seda en la medicina regenerativa ocular.

Regeneración de tejido hepático

El hígado es un órgano que desempeña un papel crucial en el metabolismo de los carbohidratos, las proteínas, lípidos y vitaminas. El principal componente celular del tejido hepático son los hepatocitos, los cuales se han empleado en sistemas in-vitro para reconstruir el tejido 3-D del hígado. Los materiales compuestos de seda para la ingeniería de tejido hepático incluye seda funcionalizada con lactosa y ácido cianúrico (146), películas de fibroína de seda mezcladas con colágeno (147), colágeno humano recombinante (148), colágeno-heparina (149), y micro-partículas de seda incrustadas en andamios de ácido poli láctico (PLA) (150). Sin embargo, como los hepatocitos llevan un grado de organización estructural, formando agregados celulares grandes a largo plazo en cultivo in vitro, estos complejos celulares agregados hacen que sea difícil la difusión de nutrientes y por lo tanto requieren investigación adicional en el diseño de andamios para la completa regeneración del tejido de seda.

Regeneración de tejido espinal e intervertebral

El injerto de células olfativas encapsuladas (OECS) es uno de los enfoques más comúnmente empleados para el tratamiento de lesiones de la médula espinal. La regeneración de la médula espinal basada en biomateriales de seda se encuentra actualmente en una etapa muy temprana. El cultivo de las OECS en fibroína de seda-nano fibrosa revela perspectivas de biomateriales de seda en este ámbito (151). El diámetro de las nano-fibras posee efectos reguladores sobre el crecimiento de las OECS (152); por ejemplo, los diámetros más pequeños dan como resultado mejores respuestas celulares que los más grandes. El tratamiento de la enfermedad degenerativa de disco implica la reparación del anillo fibroso, que es uno de los principales componentes del disco intervertebral. Los andamios porosos de fibroína de seda permiten un buen crecimiento de células del anillo fibroso bovino hasta por un periodo de 8 semanas en sistemas in vitro (153).    El crecimiento de células del anillo fibroso de la especie bovina en fibroína de seda está muy influenciado por la condición del cultivo y el tamaño medio de los poros del material de andamiaje (≥600 µm)(154)    Sin embargo, se necesitan más investigaciones para llegar a imitar completamente la alta resistencia, elasticidad y morfología de los tejidos intervertebrales naturales.

Regeneración de vejiga

En el tratamiento de la incontinencia urinaria, se requieren andamios en forma de vejiga los cuales se han logrado con el uso de células musculares lisas autólogas (155). Las películas de fibroína de seda proporcionan un buen soporte a las células epiteliales de transición de las vejigas urinarias en conejos de Nueva Zelanda (156). El uso de las películas de seda en conejos ha tenido como resultado el éxito en la reparación de defectos de longitud (1,5 cm) (157). El uso de soportes basados en seda adicionados con células madre mesenquimales de médula ósea han mostrado un buen control sobre la presión y fugas, comparable a la del control negativo (158), estos resultados sugieren un tratamiento esperanzador para la incontinencia urinaria.

Regeneración de tráquea

La incidencia del desarrollo de estenosis traqueal en los recién nacidos prematuros está en aumento como resultado de la necesidad de llevar a cabo procesos prolongados de incubación. En conejos se ha logrado la reconstrucción exitosa de defectos traqueales con el uso de biomateriales basados en seda, los resultados muestran la generación de capas de fibroblastos de grosores entre 240 a 302 micras, sin granuloma de cuerpo extraño e infiltración de macrófagos (159). Estos resultados sugieren la idoneidad de los dispositivos basados en seda para la generación de revestimientos epiteliales en los trasplantes de tráquea (160).

Regeneración de tímpano

Alteraciones o daños en el tímpano tienen como resultado la generación de un intenso dolor, la posibilidad de infección e incluso la pérdida de la audición. El tratamiento quirúrgico para restaurar las perforaciones crónicas es la miringoplastia, en donde injertos autólogos, aloinjertos, y el injerto de materiales sintéticos se han utilizado comúnmente (161). Los ensayos recientes con el uso de membranas de fibroína de la seda han dado como resultado una buena adhesión y cinética de crecimiento de los queratinocitos de la membrana timpánica humana (162-164). Las membranas de seda proporcionan una mejor cicatrización en comparación con el parche de papel convencional (165). Estos hallazgos sugieren la idoneidad para la fabricación de parches de tímpano de los materiales basados en seda.

Perspectivas futuras

La regeneración tisular para terapéutica es uno de los objetivos específicos más críticos orientados a lograr la funcionalidad de los sistemas vivos. El tejido construido debe interactuar de manera exitosa con el sistema inmunológico de los organismos en los cuales se implanta. Los diseños basados en seda permiten un fácil control de la morfología de la matriz, una tasa de degradación y adhesión conforme a los tejidos subyacentes con baja toxicidad inmunológica y una buena biocompatibilidad. Los avances recientes en la comprensión de la estructura de la seda y el procesamiento de esta abren nuevas oportunidades en el uso de diversas formas de seda en la regeneración de tejidos. Los sistemas de seda serán particularmente útiles para aplicaciones que requieren procesos lentos de biodegradación y buenas propiedades mecánicas, tales como el hueso, los ligamentos y los tejidos musculo-esqueléticos. La exitosa aplicación de materiales basados en seda en la ingeniería de tejidos depende de lograr una mayor comprensión a largo plazo de la biocompatibilidad, biodegradabilidad, productos de degradación, junto con la capacidad de generar morfologías de seda para los requisitos específicos del tejido. La implementación de biomateriales basados en seda requerirán del fortalecimiento de redes de trabajo que implican disciplinas de las Ciencias Biológicas, Médicas y de Ingenierías para estudiar y adecuar en forma exitosa las propiedades de estos materiales en Ingeniería de Tejidos.

Conflictos de interés

Los autores declaramos que no tenemos ningún conflicto de interés.

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