Introducción

Los psitaciformes, mejor conocidos como loros, guacamayos, pericos y cacatúas, se encuentran ampliamente distribuidos en el mundo. Se agrupan en 84 géneros y 398 especies (¹). Son aves de elevado interés biológico y comercial, víctimas del tráfico ilegal debido sus atractivos colores y fácil domesticación (²,³). El 28 % de los psitaciformes se encuentran en estado de conservación crítico, lo cual atenúa el número de ejemplares en vida libre (¹) e incrementa la cantidad de psitácidos en cautiverio, lo que predispone la adquisición de agentes infecciosos como Chlamydia, género de elevada frecuencia en el reino animal (⁴).

Actualmente Chlamydia es el único género perteneciente a la familia Chlamydaceae (⁵,⁶). Se describe como bacteria intracelular obligada con una elevada virulencia. Chlamydia psittaci (Cp) posee la capacidad de infectar a más de 460 especies de aves (⁷); es un agente causal de clamidiosis aviar en aves, mamíferos y humanos, asociada a neumonía, pericarditis, peritonitis, hepatitis y esplenitis (⁷,⁸). La gravedad de los síntomas clínicos dependerá del sistema inmunitario, edad, estado general del huésped y de la cepa chlamydial (⁷,⁹). C. trachomatis posee la capacidad de generar tracoma en animales y humanos, y en estos últimos puede originar infecciones urogenitales, linfogranuloma venéreo e infertilidad. C. abortus produce abortos en mamíferos rumiantes y humanos (¹⁰). C. pneumoniae en inicio fue considerado un patógeno exclusivamente humano; sin embargo, puede causar infecciones oculares, respiratorias y urogenitales en koalas, equinos, anfibios y reptiles. C. pecorum ocasiona infecciones genitales que pueden ser transmitidas por vía sexual, siendo aislada en semen y muestras de heces de porcinos (¹¹). C. suis, C. felis, C. muridarum y C. caviae conforman el resto de las especies chlamydiales (⁷,⁸).

Recientemente fueron identificadas tres nuevas especies de chlamydias: C. ibidis, aislada en ibis sagrado (Threskiornis aethiopicu) (¹²); C. avium, detectada en columbiformes y psitaciformes, y C. gallinácea, en aves de corral (¹³,¹⁴). Ascendieron a doce el número de especies chlamydiales. Los aislamientos de chlamydias continúan originándose, por ello existe la posibilidad de descubrir nuevas especies. Szymanska-Czerwinska et al. (¹⁵) afirman que la variedad de especies chlamidiales aún continúa incompleta y las ya identificadas se adaptan a huéspedes susceptibles, lo que genera nuevos reservorios para identificar.

De forma reiterada se han producido aislados de Chlamydia no psittaci en aves de vida libre y cautiverio, como C. trachomatis, C. pneumoniae, C. pecorum y C. abortus detectadas en paseriformes, psitaciformes, columbiformes y en humanos (¹¹,¹⁶,¹⁷), así como la detección del genotipo WC de Cp en Passeriformes de vida libre (¹¹). De este modo, se manifiesta la capacidad evolutiva de la familia Chlamydiaceae, en la que Cp era la única especie causante de infecciones aviares y ahora otras chlamydias se están adaptando a huéspedes susceptibles. Esto trae nuevos reservorios con riesgo de generar manifestaciones clínicas severas que en algunos casos pueden ser fatales para la vida del animal. En este sentido, es necesaria la notificación de nuevos aislamientos chlamydiales que faciliten la identificación de nuevas especies y reservorios para la determinación de capacidad patogénica y el potencial zoonótico que genera riesgo para la salud pública. Por ello se planteó en este trabajo la identificación de un segmento del gen 16s ADNr de Cp a través de la reacción en cadena de la polimerasa anidada en hisopados cloacales de dos psitácidos del género Ara en condición de cautiverio.

Materiales y métodos

Durante 2016 se realizó un estudio de tipo descriptivo y corte transversal en un parque zoológico de Venezuela; fueron muestreados dos de ocho ejemplares pertenecientes a las especies Ara ararauna y Ara chloropterus, ubicadas en el aviario principal de dicho parque. Los ocho ejemplares fueron sometidos a una evaluación clínica. Estos demostraron poseer buen peso, tamaño y coloración de plumas, así como la ausencia de síntomas respiratorios, neurológicos y gastrointestinales. De este modo fue descartada la presencia de signos clínicos de clamidiosis aviar.

A pesar de la ausencia de signos clínicos de clamidiosis aviar, fueron seleccionadas dos aves del género Ara y recolectados cuatro hisopados cloacales por cada psitácido para el descarte de Cp (¹⁸). La manipulación de las aves fue realizada de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de los animales de laboratorio del Institute of Laboratory Animal Resources Commission on Life Sciences National Research Council, y con la autorización de la Dirección General de Diversidad Biológica, a través del permiso para el acceso a recursos genéticos (oficio 0283) y la licencia de caza (folio 1370) entregado por el Ministerio del Poder Popular de Ecosocialismo y Aguas de la República Bolivariana de Venezuela. Una vez obtenidas las muestras fueron refrigeradas y transportadas al Laboratorio 8, sección de biología molecular del Instituto de Investigaciones Biomédicas “Dr. Francisco Triana-Alonso” (Biomed-UC), donde fueron almacenadas a -70 °C hasta realizar el protocolo de extracción y purificación de ADN.

El aislamiento del ADN bacteriano se realizó a través de la extracción con solventes orgánicos y precipitación con alcohol, mediante el protocolo de fenol-cloroformo y precipitación con etanol (¹⁹). Posteriormente, se llevó a cabo la técnica de PCRa, descrita por Rodríguez-Leo et al. (¹⁹), la cual emplea en la primera reacción de PCR un par de cebadores específicos sentido Cp1F (ACG GAA TAA TGA CTT CGG), antisentido Cp1R (TAC CTG GTA CGC TCA ATT. T), dirigidos a los miembros de la familia Chlamydiaceae, específicamente a la secuencia de una porción del gen 16s ADNr, donde se esperaba un amplicón de 436 pb. Posteriormente, en la segunda reacción de amplificación se utilizó un segundo par de cebadores dirigidos a las regiones variables de la especie Cp CpintF sentido (ATA ATG ACT TCG GTT GTT ATT) y CpintR antisentido (TGT TTT AGA TGC CTA AAC AT), que se une a las copias de secuencias de los productos formados en la primera reacción de PCR, a partir de los cebadores dirigidos a los miembros de la familia antes mencionada. En esta segunda reacción se esperaba obtener un amplicón de 126 pb. Fue utilizado como control positivo el ADN de Cp (CP018) donado por el laboratorio de biología molecular de la Universidad del Zulia.

Resultados y discusión

Los resultados evidenciaron la amplificación de un fragmento de ADN de 436 pb correspondiente a la familia Chlamydiaceae. Sin embargo, en estos casos no se originó el segundo producto de 126 pb correspondiente a la región del gen 16S ADNr de Cp. En este sentido, las aves no poseían infección por Cp, pero sí poseían ADN complementario para la familia Chlamydiaceae. Dicho resultado permite inferir sobre la posible presencia de otra especie de chlamydia.

Hasta 2008, se desconocía la presencia de nuevas especies del género Chlamydia que actualmente se encuentran documentadas (C. ibidis, C. avium y C. gallinacea) y de su capacidad infecciosa en aves psitácidas (¹¹,¹³,¹⁴,²⁰). Al igual que la presente investigación, Origlia et al. (²¹) obtuvieron aislamientos positivos solo para la familia Chlamydiaceae. Sin embargo, al emplear la secuenciación nucleotídica no se relacionaron con Cp. En este estudio, por limitaciones económicas, no se logró realizar la secuenciación de los productos obtenidos para la familia Chlamydiaceae. Esto hubiera sido altamente significativo para la identificación de la especie chlamydial que se encontraba presente en dichas aves. Es importante señalar que se desconocía el origen de estos ejemplares provenientes de incautas; de este modo, incrementa el riesgo de infección por cualquiera otra especie chlamydial.

La evidencia solo de ADN complementario para la familia Chlamydiaceae no descarta completamente la presencia Cp debido a que esta posee una elevada tasa de recombinación homóloga en varios sitios de su genoma (²²). Sin embargo, han sido reportadas cepas de Cp con secuencias similares a otras especies, como la cepa 84/2334 de Cp que posee mayor similitud a C. abortus (²³). Estos aislamientos son cada vez más frecuentes. Nuevamente fue identificado en aves de centros de rehabilitación un nuevo genotipo de chlamydia que al estudio filogenético se encuentra más próximo a C. abortus. De esta forma, proponen que esta especie, además que ser aislada en mamíferos, debe ser reconocida como causante de infecciones atípicas en aves (²⁴).

En este sentido, existen aislados de Cp que pueden poseer mayor relación filogenética a otra especie chlamydial. En Venezuela fueron detectados 93 % de anticuerpos contra Cp, mediante una técnica dirigida a la principal proteína de membrana externa de la familia Chlamydiaceae. Dichos anticuerpos podían reaccionar contra otras especies de chlamydias, pero debido a las limitaciones de la técnica no fueron identificadas (²⁵). Estos resultados demuestran la necesidad de identificar, nuevamente, los aislados de chlamydias y aplicar una caracterización molecular para así confirmar si todos corresponden a Cp, si existe una coinfección con otra especie chlamydial o la existencia de un nuevo genotipo circulante.

El aumento de la diversidad genética en la familia Chlamydiaceae y su capacidad de infectar nuevos huéspedes ha generado un abanico de nuevas posibilidades diagnósticas en esta familia de bacterias, con genotipos altamente heterogéneos (²⁶). Esto representa nuevos retos para la identificación y el control en poblaciones de animales silvestres y en cautiverio que posean mayor vulnerabilidad a ser infectadas por especies chlamydiales. Es por ello por lo que la identificación de hallazgos sobre la familia Chlamydiaceae es de vital importancia y necesaria para el entendimiento de su biología, principalmente en países como Venezuela, que alberga 1361 especies de aves y cuenta con 350 especies de mamíferos, entre las cuales 28 son autóctonas (²⁷). Este país, al igual que los del resto del continente americano, debe velar por la preservación y conservación de estas especies, sobre todo aquellas que se encuentran en riesgo de extinción y en estado de cautiverio sin posibilidades de reincorporación a su estado silvestre.