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INTRODUCCIÓN
Los arrecifes de coral son los ecosistemas marinos más complejos y productivos (Grigg et al., 1984; Díaz et al., 1996). Se ha comparado su biodiversidad con la de las selvas tropicales (Connell, 1978), y se han denominado ‘oasis del mar profundo’ debido a su alta productividad (Hoegh-Guldberg, 1999). Desafortunadamente, durante las últimas décadas los arrecifes de coral han experimentado cambios importantes en todo el mundo. Varias amenazas naturales y humanas, como el cambio climático global, el blanqueamiento de corales y las enfermedades contribuyen a su degradación y destrucción (Goldberg y Wilkinson, 2004). Aunque la vulnerabilidad y resistencia de los arrecifes varían en función de muchos factores como las diferentes especies y las respuestas específicas de la población (Rowan et al., 1977) -la mayoría de los arrecifes de coral presentan cambios en la composición de las comunidades de corales (Reaser et al., 2000), habiendo desaparecido en algunos casos, tanto la estructura de los arrecifes como las comunidades marinas (Graham et al., 2006). En consecuencia, se han visto afectadas las comunidades humanas que viven de estos ecosistemas (Wilkinson, 1999).
Se han desarrollado diferentes estrategias de conservación de corales, incluyendo métodos de conservación in situ, que incluyen el diseño y establecimiento de Áreas Marinas Protegidas (Carr, 2000), la administración de las mismas, así como políticas regulatorias y económicas (White y Courtney, 2004), y también los métodos de restauración ecológica (Edwards, 2010). Sin embargo, la interacción entre las amenazas globales y locales requiere métodos de conservación ex situ para mantener y asegurar el futuro de los arrecifes de coral. Los métodos ex situ incluyen diferentes sistemas, como el uso de viveros terrestres para la crianza asexual de corales, la cría de larvas de coral y reclutas hasta juveniles (Rinkevich, 2005; Edwards, 2010), y la conservación de muestras biológicas en bancos de criopreservación (Hagedorn et al., 2010). Esta última es una herramienta efectiva de conservación donde las células se congelan en compuestos parecidos a los azúcares llamados crioprotectores (Hagedorn y Spindler, 2014). Estas sustancias preservan las estructuras celulares intactas durante el proceso de congelación (Pegg, 2007) y las temperaturas de congelación estabilizan las condiciones que ayudan a preservar los tejidos vivos durante décadas (Hagedorn y Spindler, 2014).
La criopreservación de gametos ya ha sido utilizada como una forma efectiva de asegurar el mantenimiento de la diversidad genética de muchas especies de vida silvestre, incluidos los hurones, antílopes (Wolf et al., 2001; Wildt et al., 2010), y también los invertebrados marinos como las ostras y los erizos de mar (Gakhova et al., 1988; Paniagua-Chaves y Tiersch, 2001). Las células que han sido criopreservadas y almacenadas en bancos de criopreservación de forma adecuada pueden permanecer viables durante años sin daño en el ADN (Hagedorn et al., 2012). Sin embargo, el uso de estos bancos de criopreservación es nuevo para las especies de corales (Hagedorn et al., 2012) y se espera que sirva para preservar las especies existentes y la diversidad genética como parte de los procesos de rehabilitación. La criopreservación de espermatozoides se ha aplicado con éxito en algunas especies de corales, incluyendo Acropora palmata (del Caribe), A. millepora, A. tenuis, A. loripes, Fungia scutaria, Platygyra lamolina, P. daedalea y Goniastrea aspera (Hagedorn et al., 2006; Hagedorn y Spindler, 2014). Aún no se ha conseguido lograr el éxito de la criopreservación con ninguna larva de coral u ovocitos (Hagedorn y Spindler, 2014).
Como la mayoría de las áreas de arrecifes de coral del Caribe, la salud de los arrecifes de coral colombianos y los servicios de los ecosistemas están disminuyendo. Entre 2010 y 2013, tres instituciones colombianas (Universidad Jorge Tadeo Lozano, Calipso Dive Center y el Parque Nacional Natural Tayrona) se unieron para desarrollar proyectos de restauración de arrecifes de coral. Este estudio forma parte de este esfuerzo y su objetivo es describir la morfología espermática del coral formador de arrecifes en el Caribe Orbicella faveolata, y evaluar la funcionalidad de los gametos en cuanto a su motilidad y vitalidad después de dos tratamientos diferentes de criopreservación.
MATERIALES Y MÉTODOS
Colecta de esperma
Se colectó el esperma de coral durante el evento de desove del 6 de septiembre de 2012 en la bahía de Gayraca (Parque Nacional Natural Tayrona-Colombia), de cinco colonias del coral formador de arrecifes O. faveolata. Esta especie es hermafrodita con fertilización externa, liberando sólo durante una noche al año paquetes de gametos que contienen tanto huevos como espermatozoides (Levitan et al., 2011). Estos paquetes tienen una alta flotabilidad, lo que permitió su recolección mediante el uso de redes modificadas (Vermeij et al., 2003). Los paquetes de gametos se colectaron de las trampas de malla y se transportaron a tierra, donde se agitaron suavemente hasta separar los espermatozoides de los huevos usando agua de mar esterilizada y una malla de plancton de 60 mm.
Evaluación de la morfología y motilidad espermática
La morfología y calidad espermática se determinó de acuerdo con los métodos de Rurangwa et al. (2004) y Gaitán-Espitia et al. (2013). Para describir la morfología espermática, se colocó una gota del esperma en un portaobjetos de microscopio y se cubrió con un cubreobjetos de vidrio. Se obtuvieron imágenes digitales (n=10) utilizando un microscopio (Nikon Eclipse E200) con cámara digital (Nikon Digital Sight DS-Fi1). Se analizaron las imágenes con el programa Image J (Abramoff et al., 2004) para medir la longitud de la cabeza y del flagelo de los espermatozoides. Se observó el esperma al microscopio (aumento de 100x), evaluando tanto la duración como la viabilidad de la motilidad espermática. La duración de la motilidad se definió como el período de tiempo transcurrido hasta el cese de cualquier movimiento. La viabilidad espermática, definida como el porcentaje de espermatozoides vivos, se determinó utilizando el método eosina-nigrosina (Rose y Heath, 1978), cuantificando todos los espermatozoides vivos y muertos. Se preparó un frotis mezclando una gota de esperma de coral con una gota de eosina: nigrosina (1:1) en cada uno de los cinco portaobjetos. Después de secarlos al aire, se examinaron los portaobjetos con un aumento de 100x (Nikon Eclipse E200). Los espermatozoides vivos no se tiñeron (sin color), mientras que las células muertas se tiñeron de rojo. Se realizó una evaluación de la movilidad y viabilidad espermática cada dos horas. Después de seis horas, los espermatozoides dejaron de moverse, aunque seguían vivos, y la última evaluación se realizó ocho horas después de la liberación de esperma de los paquetes de gametos, considerando que ya no se cumplían las condiciones de viabilidad.
Ensayos de criopreservación
El crioprotector utilizado en los ensayos consistió en una solución de 1,2-propanodiol, leche en polvo y Ringer-C (modificado de Gaitán-Espitia e t a l., 2 013). S e m ezcló e ste crioprotector con esperma de coral en una proporción de 1:10 respectivamente y se dejó equilibrar durante 20 minutos aproximadamente (Gaitán-Espitia et al., 2013). Se llenaron un total de 20 pajillas de 0.5 ml con la mezcla y se dividieron en dos grupos para los ensayos de criopreservación: el primer grupo se almacenó a 4 °C (criopreservación lenta) y el segundo en nitrógeno líquido a -196 °C. (criopreservación rápida), ambos durante 24 h. Para determinar el éxito de estos ensayos y las diferencias entre los mismos, se descongelaron todas las pajillas en un baño de agua a 37 °C hasta que el medio líquido se hizo visible (González y Díaz, 2001; Gaitán-Espitia et al., 2013). Inmediatamente después de la descongelación se retiró una parte del esperma criopreservado (aproximadamente 5 μL), la cual se colocó en un portaobjetos de microscopio y se observó a 100 aumentos. Se midieron tanto la motilidad como la vitalidad espermática. Para determinar si la criopreservación tuvo algún efecto sobre la motilidad y la vitalidad espermática del coral, se construyó una tabla de contingencia y se realizó una prueba de independencia Chi-cuadrado. Estos análisis permitieron la comparación entre los ensayos de criopreservación. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa STATGRAPHICS 5.0 (Moreno-Gil, 1998).
RESULTADOS
Morfología, motilidad y vitalidad espermática
Los espermatozoides de Orbicella faveolata tienen cabezas con forma de pala y colas largas (Figura 1). Los espermatozoides maduros tenían una longitud media de flagelo de 43.24 ± 7.99 μm (media ± DE), y una longitud media de la cabeza de 4.10 ± 0.69 μm (se midieron N= 40 espermatozoides). La densidad espermática fue de 8.58 x106 espermatozoides ml-1.
Después de ser liberados de los paquetes de gametos, la motilidad espermática era del 90%; como se esperaba, ésta disminuyó con el tiempo y el último movimiento se observó en menos del 15% de los espermatozoides después de 6 h y 14 min de romper los paquetes de gametos. La motilidad espermática en fresco varió desde la natación (65.0 ± 1.26%) hasta la vibración (movimiento de látigo, 23.5 ± 1.29%), y 12.3 ± 1.43% se mantuvieron inmóviles. Tres horas después de romper los paquetes de gametos, 42.3 ± 1.01% nadaban, 30.1 ± 0.91% vibraban y 25.1 ± 1.26% estaban inmóviles. Después de cinco horas, 38.6 ± 1.29% vibraban, 11.8 ± 0.34% nadaban, y 47.9 ± 2.80% estaban inmóviles. Aunque la viabilidad espermática también disminuyó con el tiempo, su reducción fue menor que la de la motilidad. Los espermatozoides vivos del esperma fresco fueron 75%, y después de cinco horas alrededor de 60%, disminuyendo a menos de 30% después de ocho horas (Figura 2).
Ensayos de criopreservación
Aunque hubo una ligera disminución de la capacidad natatoria de los espermatozoides, no se encontraron diferencias estadísticas entre el esperma fresco y ambos tratamientos para la motilidad y vitalidad de los espermatozoides criopreservados (X2=2.92, p=0.572; X2=1.69, p=0.428, respectivamente, Figura 3). Después de 24 h, 70% de los espermatozoides de la criopreservación lenta (4 °C) presentaban motilidadyviabilidad, mientras que los espermatozoides de la criopreservación rápida (nitrógeno líquido) tuvieron una vitalidad promedio de 55% y una motilidad promedio de 75% después 24 h. No se observaron cambios en la morfología espermática dentro de los tratamientos.
DISCUSIÓN
En este estudio se describe la morfología espermática del coral Orbicella faveolata y dos métodos de criopreservación (a 4 °C y en nitrógeno líquido) para preservar con éxito los espermatozoides durante 24 h, manteniendo al menos 70% de la motilidad y vitalidad espermática después de la descongelación. Este es el primer estudio sobre la criopreservación del esperma de O. faveolata.
La cabeza triangular del espermatozoide de O. faveolata es común en muchos invertebrados marinos como los erizos de mar (Landry et al., 2003). En el caso concreto de los corales, se han descrito dos formas diferentes de cabeza de los espermatozoides: cabeza piriforme y cabeza cónica alargada (Harrison y Wallace, 1990). La cabeza de los espermatozoides de O. faveolata se asemeja a la segunda forma mencionada. De acuerdo con la descripción de Harrison y Wallace (1990), el proceso anterior localizado en la cabeza de los espermatozoides podría tener una función acrosómica, aunque nunca se ha sido estudiado este aspecto. Aunque las diferencias en la longitud de la cabeza podrían ser una característica taxonómica específica de la especie, y ser utilizadas para identificar los clados genéticos (Briones et al., 2012), no existen datos sobre O. faveolata u otros orbicélidos para comparar. Los datos de los que se dispone de Albright (2011), que midieron el área de la cabeza de O. faveolata utilizando micrografía electrónica de barrido, no se pudieron usar para la comparación debido a la diferencia en la resolución de las imágenes.
La limitación de esperma, definida como la dilución de esperma en agua de mar (Yund, 2000), es un factor clave que limita el éxito reproductivo de los invertebrados sésiles de desove masivo (Levitan et al., 1992; Oliver y Babcock, 1992). Para maximizar el éxito de la fertilización y, por lo tanto, la reproducción, han desarrollado múltiples estrategias (Yund, 2000). Algunas de estas estrategias en los corales de desove masivo son la sincronización del desove (Harrison, 2011), los gametos flotantes (Oliver y Babcock, 1992), y la morfología y longevidad específicas de los espermatozoides (Benzie y Dixon, 1994). Las colonias de O. faveolata tienen desoves sincrónicos y los paquetes de espermatozoides y óvulos tienen flotabilidad positiva. Las interacciones de los gametos están controladas por atributos tales como el tamaño del óvulo, la capacidad de nadar de los espermatozoides, y la probabilidad de que la fusión del espermatozoide y el óvulo produzca la fertilización (Levitan y Petersen, 1995). Los flagelos largos de los espermatozoides se asocian con una mayor velocidad de natación y mayores distancias recorridas, lo que es muy importante para el éxito de la fertilización (Fitzpatrick et al., 2010). En otras especies de invertebrados marinos como el erizo de mar negro, Diadema antillarum, se ha medido que la disponibilidad de esperma y la proximidad entre el macho y la hembra durante los desoves influyen en el éxito de la fertilización (Levitan, 1991).
La longevidad de los espermatozoides en los invertebrados marinos con desove libre varía de pocas horas a días y, además de ser característica de la especie, depende de la concentración, la temperatura y el contacto con el óvulo (Jhonson y Yun, 2004). Nuestros resultados muestran que más de 50% de los espermatozoides pueden mantenerse vivos y móviles durante seis horas después de ser liberados. Este factor podría desempeñar un papel importante en el éxito reproductivo de O. faveolata a pesar de la dilución del agua de mar (Jhonson y Yun, 2004). En general, se ha supuesto que la dilución de esperma en el agua reduce la longevidad de los espermatozoides en decenas de minutos (Levitan, 1991); sin embargo, nuestros resultados muestran que es posible que el esperma de O. faveolata permanezca viable durante largos períodos de tiempo a pesar de la dilución del agua de mar, lo que aumenta las posibilidades de fertilización de los óvulos de colonias aisladas.
Para varios invertebrados marinos, incluidas algunas especies de coral del género Acropora, la motilidad espermática se inicia en respuesta a señales químicas específicas secretadas por los óvulos (Morisawa, 1994; Yoshida et al., 2002; Morita et al., 2006). Específicamente, para tres especies de Acropora del Pacífico, la motilidad espermática se inició en presencia de los óvulos a 150-300 mm de distancia cuando se incrementó el pH agregando cloruro de colina (agua de mar artificial libre de Na que contiene NH4 Cl) al agua de mar artificial (Morita et al., 2006). Estos autores argumentan que la regulación espermática es modulada por las secreciones de los óvulos, las cuales juegan un papel importante en el éxito de la fertilización. Como Acropora spp., el complejo de especies de Orbicella annularis tiene tiempos de desove similares (Fukami et al., 2004): sin embargo, en este estudio, se observó la motilidad espermática en O. faveolata desde el principio cuando los gametos fueron separados y los óvulos no estaban presentes en las muestras. Por lo tanto, como la regulación espermática está modulada por las secreciones de los óvulos, es posible que algunas de éstas se hayan lavado junto con los espermatozoides durante la separación o que el compuesto químico que induce la motilidad espermática en esta especie se encuentre en el agua de mar. Este aspecto debe ser estudiado más a fondo.
Los ensayos de criopreservación del esperma de O. faveolata tuvieron éxito; los espermatozoides sometidos a criopreservación lenta tuvieron una motilidad promedio después de la descongelación del 70%, y aquellos sometidos a criopreservación rápida de 75%. En ambos tratamientos, la morfología espermática no cambió. En comparación, Hagedorn et al. (2006) obtuvieron una motilidad espermática posterior a la descongelación superior a 95% después del almacenamiento, pero registraron un cambio en la morfología espermática tanto en el diámetro de la cabeza como en la longitud de la cola. Parece que estos cambios fueron el resultado del crioprotector utilizado. Todos los crioprotectores son tóxicos o letales para los espermatozoides, especialmente a altas concentraciones. En nuestro estudio, la ausencia de cambios en la morfología espermática podría ser el resultado de la combinación de un crioprotector intracelular (1,2-Propanodiol) y otro extracelular (leche). El intracelular podría proporcionar una protección inicial contra la formación de hielo intracelular (Gaitán- Espitia et al., 2013) y el contenido de lípidos de la leche puede estabilizar las membranas celulares durante los procesos de congelación-descongelación (Odintsova y Boroda, 2012).
Aunque evaluamos la funcionalidad espermática en términos de motilidad y vitalidad, el siguiente desafío consiste en determinar el éxito de la fertilización espermática después de la criogenización. Se ha utilizado el esperma congelado descongelado de diferentes especies de corales para fertilizar óvulos conespecíficos liberados en el mismo y sucesivos desoves, alcanzando un éxito de fertilización de 60% y dando como resultado larvas funcionales (Hagedorn et al., 2012). Además, en experimentos preliminares sobre A. clathrata, las larvas producidas a partir de esperma congelado-descongelado se desarrollaron, asentaron y asimilaron simbiontes, creando nuevos corales in vitro (Hagedorn y Spindler, 2014).
Todos los métodos de criopreservación en coral se han aplicado con éxito a los espermatozoides, pero no a los óvulos de coral que aún no se han criopreservado con éxito. Una de las razones principales es la sensibilidad de los óvulos a la disminución de temperatura (Hagedorn y Spindler, 2014) que influye en las propiedades, función e integridad de la membrana celular (Lin y Tsai, 2012). Se obtuvieron resultados similares al evaluar la criopreservación de óvulos de O. faveolata, después de que los procesos de congelación- descongelación desintegraran todos los óvulos.
Este trabajo sustenta el de Hagedorn et al. (2006, 2012) al pedir el desarrollo de protocolos de criopreservación que puedan utilizarse para crear un banco de criobiología para preservar las especies de coral existentes y su diversidad genética. Hoy en día, existen tres criobancos a largo plazo en el mundo donde se almacenan células de coral, dos de ellas ubicados en EE.UU. -en el Instituto Smithsoniano/Instituto de Biología Marina de Hawái y el Programa de Germoplasma Animal del Departamento de Agricultura de EE. UU. - y uno en Australia en el Zoológico Taronga Western Plains (Hagedorn y Spindler, 2014). La criopreservación de gametos de coral podría desempeñar un papel importante en la restauración coralina en el futuro inmediato y también contribuir a expandir los viveros de corales mediante la inclusión de corales de reproducción sexual (Hagedorn y Spindler, 2014) que, como O. faveolata, sólo lo hacen una vez al año.
Se necesitan más estudios sobre las técnicas de criopreservación de coral, el éxito de la fertilización y el desarrollo de larvas y reclutas después de la criopreservación. El uso de técnicas de criopreservación de esperma, como la evaluada en este estudio, puede ayudar a preservar la diversidad genética, prevenir la desaparición de los corales y crear oportunidades para diversificar unas poblaciones cada vez más pequeñas, evitando la pérdida natural de heterocigosidad debido a la deriva genética (Hagedorn y Spindler, 2014). Además, permite avanzar en la investigación sobre la biología del desarrollo, la genética, la sistemática y la biología molecular de los corales.
