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1. Introducción
El metabolismo celular comprende todas las reacciones bioquímicas que se llevan a cabo dentro de una célula. Estas reacciones pueden favorecer el suministro de precursores para rutas biosintéticas, de energía para reacciones anabólicas, y los procesos de señalización y de mantenimiento generales. Para mantener el equilibrio o la homeostasis celular, las redes metabólicas deben tener una amplia plasticidad y robustez en respuesta a perturbaciones nutricionales y ambientales, lo que ha traído un gran interés por esta área en los últimos años, con la ayuda y el desarrollo de la Ingeniería Metabólica 1.
Se ha descrito que la Ingeniería Metabólica tiene como fin diseñar microorganismos que puedan ser empleados para la producción rentable de productos de interés mundial tales como biocombustibles, biofertilizantes, biosurfactantes, farmacéuticos, entre otros. La Ingeniería Metabólica es básicamente un campo destinado al diseño, la construcción y la optimización de las vías metabólicas en un microrganismo de interés 2.
Además de las metodologías experimentales de biología sintética que han facilitado el diseño e inserción de rutas metabólicas, existen enfoques matemáticos que han permitido estudiar el metabolismo de una amplia variedad de microorganismos en diferentes niveles de detalle, y en áreas que engloban la biotecnología y la medicina 3.
En la actualidad, estas metodologías matemáticas para estudiar el metabolismo se conocen como enfoques de modelado basado en restricciones (Constraint-based modeling, por sus siglas en inglés) 3,4, o métodos COBRA 5,6 y han estado en constante desarrollo desde que se ha incrementado la capacidad de cuantificar gran cantidad de biomoléculas de la célula, por medio de las tecnologías ómicas, que permiten capturar moléculas de diferentes niveles biológicos como el genoma (genes), transcriptoma (RNA mensajero), metaboloma (metabolitos), y el proteoma (proteínas) con una amplia precisión.
Con esta amplia disponibilidad de datos, se han logrado construir modelos metabólicos estequiométricos para cientos de microorganismos 7,8, aquí se relaciona directamente el metabolismo con el genoma, transcriptoma y proteoma. Particularmente, estos modelos metabólicos contienen información gen-proteína-reacción que permiten caracterizar el fenotipo a partir de la existencia de una enzima, la expresión de los genes y su posible actividad catalítica. Estos modelos estequiométricos son conocidos como modelos a escala del genoma y pueden ser construidos con diferentes puntos de partida de los niveles biológicos, de arriba hacia abajo (top-down, partiendo de la información conocida de las rutas y reacciones metabólicas del microorganismo y asociándolas con la información de sus respectivos genes, proteínas o enzimas) o de abajo hacia arriba (botton-up, partiendo de la información conocida del genoma del microrganismo y asociándolas con las proteínas, enzimas, reacciones y rutas metabólicas del microorganismo) 9.
De las metodologías computacionales más básicas empleadas en la Ingeniería Metabólica y en el estudio del metabolismo con enfoque sistémico, se encuentran el análisis de flux metabólico, el análisis de control metabólico, análisis termodinámico y modelado cinético10; en esta revisión se hará referencia a las metodologías más importantes de una forma narrativa
2. Análisis de Fluxes Metabólicos (MFA, por sus siglas inglés)
MFA es un enfoque matemático para el análisis del flux de metabolitos a través de una ruta metabólica, específicamente para los modelos metabólicos a escala metabólica o genómica que se han desarrollado/(re)construidos en los últimos 15 años 1,11. En otras palabras, MFA permite la observabilidad de una ruta metabólica gracias a la cuantificación de las velocidades de reacción en toda la red, lo cual se denomina comúnmente distribución de flux metabólico, y que está asociada a las condiciones de operación del bioproceso y al tipo de microorganismo empleado. Este enfoque permite analizar fenotipos y capacidades metabólicas de microrganismos a diferentes condiciones medioambientales, así como también modificaciones genéticas in silico. Los fluxes intracelulares de una ruta metabólica pueden ser cuantificados empleando modelos estequiométricos que tengan en cuentas todas (o la mayoría) de las reacciones intracelulares y por aplicación de un balance de materia alrededor de los metabolitos intracelulares 12. Como punto de partida se tiene un grupo de ecuaciones que relacionan las velocidades de reacción de los sustratos de entrada y los metabolitos extracelulares (productos y subproductos) de una red metabólica propuesta de acuerdo con la literatura. A continuación, se muestra una representación global de una red metabólica (Figura 1a).
Figura 1 Ejemplo de una red metabólica. (a) b1, b2, b3, b4 y v1, v2, v3, v4, v5, v6, v7, representan reacciones de intercambio e intracelulares, respectivamente. (b) balance de masa para cada uno de los metabolitos y representación matricial de la red metabólica. (c) balance de masa en estado estacionario (S.v=0).
Entonces, de acuerdo con la idea básica de MFA, la distribución de fluxes es calculada mediante un balance de masa a todos los metabolitos internos de la red (Figura 1a y Figura 1b), el cual se representa matemáticamente a través de la Ec. 1:
donde X es el vector de concentración de metabolitos, y v es el vector de distribución de fluxes, y S es la matriz estequiométrica de tamaño (m×n). m y n son el número de metabolitos y el número de reacciones (fluxes), respectivamente. Las filas de la matriz S simbolizan a los metabolitos, las columnas representan a los fluxes, mientras que los elementos de la matriz indican los coeficientes estequiométricos de los metabolitos en cada reacción, los cuales son negativos para reactivos y positivos para productos (Figura 1b).
En general, se asume que los metabolitos intracelulares están en un pseudo estado estacionario (Figura 1c), ya que en términos de escalas de tiempo, el metabolismo se adapta a cambios nutricionales y ambientales mucho más rápido que otros procesos celulares tales como la replicación o expresión génica, de manera que todo reactivo de una reacción es consumido rápidamente para formar un producto 13. Por lo tanto, el balance se puede reescribir como en la Ec. 2:
Los fluxes medidos (que se pueden obtener sus valores por algún procedimiento o técnica analítica) son usados para reducir el posible espacio de solución dada la Ec. 2. Por lo tanto, el vector de reacciones v es dividido en el vector de fluxes medidos v m y fluxes desconocidos v u . De manera similar, la matrix 𝑆 puede dividirse en 𝑆 m y 𝑆 u (Ec. 3). Dado estos arreglos de la matriz, la Ec. 2 puede ser reescrita como la Ec. 4:
2.1. Grados de libertad y dependencia lineal
En general se pueden presentar tres escenarios al momento de solucionar el sistema matricial de la Figura 1b y Ec. 4, y está relacionado con los grados de libertad (GL) de la matriz, el cual está definido como la Ec. 5:
donde el rango de S proporciona el número de filas o columnas linealmente independientes. Si el GL es igual a cero, indica que el sistema es determinado y posee una única solución, es decir, existen suficientes mediciones experimentales disponibles y la ecuación 4 puede ser usada para calcular únicamente los fluxes desconocidos v u . Cuando hay una única solución al sistema, se conoce como MFA.
En el caso de que GL sea mayor que cero, se considera el sistema como sub-determinado y el sistema tiene infinitas soluciones. En este caso es necesario agotar los grados de libertad mediante la determinación de fluxes a partir de datos experimentales, o en su defecto se trataría como un problema de optimización donde es posible aplicar métodos de programación lineal (LP, por sus siglas en inglés) para poder dar solución al sistema, en este caso, se conoce más como Análisis de Balance de Fluxes (FBA, por sus siglas en inglés). Al aplicar metodología FBA es posible determinar la distribución de fluxes más probable en la red metabólica según las restricciones impuestas y después de proponer una adecuada función objetivo. El último escenario es donde GL es menor que cero, y el sistema se considera sobre-determinado o redundante. Aquí se asegura la consistencia estadística de los datos medidos, y la estimación de fluxes se realiza por medio de la minimización de la suma de errores cuadrados entre los fluxes medidos y calculados en la red metabólica.
Debido a la alta interconectividad en una red metabólica, generalmente el número de reacciones (fluxes) es mayor al número de metabolitos participantes en dichas reacciones. En la red de la Figura 1a participan 5 metabolitos (A, B, …, E), 11 fluxes (v 1 , v 2 , …, v 7 , y b1, b2, b3, b4), 𝑆 tiene un tamaño de (5×11) y los GL son 6; para resolver el sistema como MFA se tendría que garantizar la medición de 6 fluxes: En caso de no poder contar con el total de esos fluxes medidos, el sistema propuesto se resuelve como un sistema sub-determinado y se procede a aplicar FBA.
2.2. Análisis de Balance de Fluxes
FBA es un caso particular de MFA, donde los GL son mayores a cero, es decir, hay más variables que ecuaciones linealmente independientes 11,14. FBA emplea métodos/estrategias de programación lineal casi siempre para generar/obtener la distribución de fluxes más probable a lo largo de la red metabólica maximizando/minimizando una función objetivo específica 1,11,14. En estado estacionario, el problema LP se puede representar como la Ec. 6:
Sujeto a: S.v=0v li ≤v≤v ls
donde Z es la función objetivo, w es el vector de pesos, S m×n es la matriz estequiométrica, 𝑣 el vector de fluxes, mientras que 𝑣 li y 𝑣 ls son los límites inferiores y superiores de los fluxes intracelulares, respectivamente. El vector de lo pesos es generalmente utilizado para definir las propiedades de una solución particular buscada, este puede llegar a ser un escalar (valor único de 1 para la variable a optimizar).
A continuación, se presentan las diferentes opciones que se pueden analizar para poder seccionar una función objetivo a este problema subdeterminado.
2.2.1. Funciones objetivo
No hay una función objetivo universal para los estudios de FBA, lo que constituye una de las principales limitaciones de este enfoque. En efecto, es necesario probar diferentes funciones objetivo-lineales, y la que mejor se ajuste a los datos experimentales, es la seleccionada para realizar el análisis de la distribución de fluxes. Por lo tanto, un gran número de funciones objetivo se han implementado/utilizado en las dos últimas décadas 15-17, siendo una de las más empleadas la maximización del crecimiento celular (biomasa) 1,11,17-19. A continuación, se lista una serie de funciones objetivos ampliamente utilizadas en estudios de FBA y su significado biológico 15.
Maximización de biomasa (Ec. 7): la célula busca evolutivamente el rendimiento máximo (max)de biomasa durante la adquisición de nutrientes y en fase exponencial de crecimiento.
Siendo 𝑣 biomasa (flux de biomada) y 𝑣 nutriente flux de un nutriente seleccionado.
Maximización de biomasa por unidad de flux (Ec. 8): la célula busca maximizar (max) el rendimiento de biomasa mientras minimiza el uso de enzimas. Esta función objetivo es no lineal.
Siendo 𝑣 biomasa (flux de biomada) y 𝑣i ⬚ un flux en particular a evaluar.
Maximización de ATP (Ec. 9): La célula busca evolutivamente la eficiencia energética máxima.
Siendo 𝑣 ATP flux de ATP
Maximización de ATP por unidad de flux (Ec. 10): la célula busca maximizar el rendimiento de ATP mientras minimiza el uso de enzimas. Esta función objetivo es no lineal.
Minimización del flux intracelular global (Ec. 11): La célula busca la máxima eficiencia enzimática para el crecimiento celular. Esta función objetivo es no lineal.
Siendo min: minimizar y 𝑣i ⬚ un flux en particular a evaluar.
Minimización del potencial redox (Ec. 12): La célula busca que el número de reacciones oxidantes se reduzca para conservar su energía o usar esa energía de la manera más eficiente posible.
Minimización del consumo de nutrientes (Ec. 13): La célula busca el uso más eficiente de sus nutrientes.
2.3. Restricciones a los sistemas biológicos
Las restricciones delimitan las funciones celulares, y deben estar en concordancia en la forma como los microorganismos operan y evolucionan. Sin embargo, la mayoría de las restricciones conocidas se basan en interpretación/entendimiento de los sistemas biológicos. A continuación, de acuerdo con el enfoque de MFA o FBA, se describen subclases de restricciones20,21.
Restricciones fisicoquímicas fundamentales: consideradas como restricciones inviolables. Este tipo de restricciones involucran los conceptos de conservación de masa, energía y momentum, así como la velocidad máxima de reacción y de transporte de especies.
Restricción de balance de masa: esta restricción se basa en el balance de masa en estado estacionario (S.𝑣=0), la cual es análoga a la ley de Kirchhoff para circuitos eléctricos, esta ley establece que la suma de las corrientes que entran a un nodo debe ser igual a la suma de corrientes que salen del nodo. Es decir, la tasa de producción debe ser igual a la tasa de consumo para cada metabolito (nodo) de la red metabólica en estado estacionario (Figura 1a y 1c).
Restricciones de balance de energía o termodinámicas: de manera análoga a las restricciones de balance de masa, las restricciones de balance de energía se basan en la segunda ley de Kirchhoff la cual establece que la suma de las caídas de voltaje alrededor de un lazo cerrado es igual a cero 22. Es decir, los cambios en la energía libre de Gibbs alrededor de un lazo de una red de reacciones bioquímicas deben ser igual a cero, lo cual se convierte en una restricción de igualdad. Así mismo, los principios termodinámicos también indican que para proceder una reacción el cambio en su energía libre de Gibbs debe ser menor a cero, lo cual sería una restricción de inigualdad.
Restricciones espaciales o topobiológicas: también llamadas restricciones tridimensionales. Por ejemplo, la aglomeración de moléculas dentro de la célula (por ejemplo, ADN, ARN) podrían afectar la forma y la función de los sistemas biológicos.
Restricciones medioambientales: unas de las principales características de estas restricciones es que depende del tiempo y de las condiciones de operación del cultivo celular. La disponibilidad de nutrientes (fuentes de carbono, nitrógeno, fósforo, oxígeno, azufre, etc., en el medio de cultivo) y aceptores/donadores de electrones, pH, temperatura, y osmolaridad son ejemplos de restricciones medio ambientales. Los medios de cultivo químicamente definidos son comúnmente empleados para realizar estudios de MFA y FBA debido a que es posible extraer información detallada de cada uno de los nutrientes 23. Información del medio de cultivo y de datos obtenidos a partir de técnicas analíticas son incorporados en el modelo metabólico del microorganismo de estudio para una mejor descripción y predicción del fenotipo metabólico.
Restricciones experimentales (Fluxes): se puede obtener más información del modelo metabólico a partir de la distribución de fluxes de los isótopos para los metabolitos intracelulares, esto se denomina distribución isotopómera y la técnica empleada se llama 13C-MFA 24,25. 13C-MFA es una extensión de MFA y permite la resolución de rutas en paralelo sin ninguna medición de flux relacionado, ciclos metabólicos, entre otros, lo cual es una limitación del MFA tradicional 25. Este enfoque puede ser resumido como un problema de ajuste de datos entre concentración experimental y simulada de metabolitos enriquecidos con 13C.
Restricciones de regulación: estas restricciones están ligadas con la expresión génica que depende principalmente del entorno de crecimiento (condiciones medioambientales) del microrganismo. La regulación de la expresión génica podría desencadenar en la expresión o represión de síntesis de enzimas, lo cual conlleva a la activación o inactivación de una reacción en la red metabólica 26.
2.3.1. Incorporación de restricciones a enfoque FBA
Para incorporar las restricciones anteriormente descritas a un estudio empleando el enfoque de FBA, éstas deben ser descritas matemáticamente. En este sentido las restricciones se pueden dividir en dos clases (i) de balances (restricción de igualdad) y (ii) de límites (restricción de inigualdad).
i) Restricciones de balances
Balance de masa: balance de masa en estado estacionario (S.𝑣=0) 27.
Balance de energía (energía libre de Gibbs): N(S)∗G=0, donde N es el espacio nulo de la matriz S, y G es el vector de los cambios de las energías libres de Gibbs de cada reacción 27,28. Algunos autores utilizan el concepto de potencial químico de reacción en vez de energía libre Gibbs de reacción 29.
Fluxes: estos pueden ser cuantificados experimentalmente aplicando balances de masa al sistema y utilizando datos provenientes de aplicación de técnicas analíticas, 𝑣= 𝑣 𝑒𝑥𝑝 .
ii) Restricciones de límites
Fluxes: delimitado por el mínimo y máximo flux de cada reacción.
𝑣𝑙𝑖≤𝑣≤𝑣𝑙𝑠. Para reacciones irreversibles 𝑣𝑙𝑖=0 (0≤𝑣≤𝑣𝑙𝑠). Donde el subíndice 𝑙𝑖 y 𝑙𝑠 denotan el límite inferior y superior de la variable, respectivamente. Estos límites también pueden ser expresados como el valor mínimo y máximo de la variable, 𝑣𝑚𝑖𝑛≤𝑣≤𝑣𝑚𝑎𝑥.
Concentraciones: las concentraciones no pueden ser negativas bajo ninguna circunstancia (0 ≤ C ≤ C𝑙𝑠) y pueden ser muy importantes cuando se utilizan restricciones termodinámicas como en la metodología planteada en “Thermodynamic-based Metabolic Flux Analysis” (TMFA) 30.
Constantes cinéticas: análogamente a la restricción de concentraciones, es posible delimitar las restricciones para constates cinéticas (0 ≤ 𝑘 ≤𝑣𝑚𝑎𝑥).
2.4. Métodos matemáticos de solución de fluxes metabólicos
A continuación, se describen las principales características de los métodos de optimización empleados para representar fenotipos metabólicos 21.
Programación lineal (LP): este método se utiliza en problemas en los cuales tanto la función objetivo como las restricciones (igualdad e inigualdad) son lineales. A continuación, se muestra un ejemplo de LP en FBA (Ec. 14).
Sujeto a:𝑆.𝑣=0 (restricción balance de masa)𝑣𝑙𝑖≤𝑣≤𝑣𝑙𝑠 (restricción limite)
Programación Cuadrática (QP): este método se utiliza cuando el problema a resolver involucra un conjunto de restricciones lineales (igualdad e inigualdad) y una función objetivo cuadrática. A continuación, se muestra un ejemplo de formulación QP para la identificación de fluxes metabólicos (Ec. 15).
Sujeto a:𝑆.𝑣=0 𝑣𝑙𝑖≤𝑣≤𝑣𝑙𝑠(restricción de limite)
Programación Lineal Entera-Mixta (MILP): este método se utiliza cuando el problema a resolver involucra variables de decisión real y entera. Como ejemplos, se pueden aplicar las reglas booleanas (formalismo o lógica booleana) para representar las restricciones de regulación. En este caso las reglas booleanas definen que producto génico (o proteína) está activo (“encendido”) o inactivo (“apagado”) como respuesta a la disponibilidad de señales ambientales. Este enfoque se puede extender para la presencia o ausencia de algún nutriente/sustrato en el medio de cultivo. Por ejemplo, si el microrganismo es aerobio estricto, la simulación no podría proceder en condiciones anaerobias 31. Otros autores introducen variables binarias en el enfoque de FBA para la modelación de deleción de genes, donde “uno” indica que la reacción esta activa y puede tomar un valor diferente de cero, mientras que “cero” denota que la reacción esta inactiva y que el flux por dicha reacción es cero bajo cualquier condición metabólica 32 (Ec. 16).
(restricción de límite) □ □ = {1 si el flux de la reacción j esta activo (𝑣𝑖) 0 si el flux de la reacción j esta inactivo (𝑣𝑖)
Programación No Lineal (NLP): este método se utiliza cuando la función objetivo del problema a resolver no es lineal ni cuadrática y/o las restricciones no son lineales. A continuación, se muestra un ejemplo de NLP (Ec. 17).
Sujeto a:𝑆.𝑣=0𝑓𝑖(𝑥)≤𝑣≤h𝑖(𝑥) 𝑖=1,2…M
𝑥ϵR N
donde 𝑔(𝑥),𝑓𝑖(𝑥) y h𝑖(𝑥) son funciones definidas en R N , que denotan la función objetivo, y las restricciones no lineales de inigualdad de los fluxes intracelulares (M) de la red metabólica.
3. Análisis de Variabilidad de Fluxes (FVA, por sus siglas en inglés)
FVA es empleado para encontrar el rango de los valores permitidos para cada uno de los fluxes mientras se satisface todas las restricciones nutricionales y se cumple o no con el rendimiento óptimo definido por la función objetivo seleccionada, es decir, permite determinar el mínimo y máximo flux que puede obtener cada reacción de la red metabólica mientras se satisfacen todas las restricciones (nutricionales, estequiométricas, termodinámicas, entre otras) y una restricción de igualdad adicional la cual puede o no ser el valor de la función objetivo optimizada 21,33,34.
La formulación matemática de FVA puede ser descrita de la siguiente forma (Ec. 18, 19 y 20):
Paso 1.
Sujeto a:𝑆.𝑣= 0𝑣𝑙??≤𝑣≤𝑣𝑙𝑠
Paso 2
Sujeto a:𝑆.𝑣= 0Z obj =𝑤.𝑣
𝑣𝑙𝑖≤𝑣≤𝑣𝑙𝑠
Paso 3
Sujeto a: 𝑆.𝑣= 0Z obj =𝑤.𝑣
𝑣𝑙𝑖≤𝑣≤𝑣𝑙𝑠
donde Z obj es el valor de la función objetivo calculado en el paso 1.
El resultado es un intervalo de valores de fluxes permisibles a través de cada reacción que satisfacen las restricciones.
4. Rutas Extremas y Ciclos Termodinámicos Infactibles
Las rutas extremas son un conjunto único y mínimo de vectores que caracterizan completamente las capacidades en estado estacionario de una red metabólica (Ec. 21):
donde 𝑆 es la matriz estequiométrica, 𝑣𝑖 es el vector de fluxes positivos de manera que las reacciones reversibles son separadas en sus componentes hacia adelante y hacia atrás. Cualquier distribución de fluxes en estado estacionario 𝑣𝑠𝑠 dentro del cono puede ser descrita como una combinación lineal no negativa de los bordes extremos del cono (Ec. 22):
donde las rutas extremas 𝑝𝑖 son un conjunto de vectores base convexos que definen todo el politopo de soluciones de fluxes en estado estacionario 22,35, y α𝑖 son pesos positivos y acotados.
Estos vectores base pueden definir tres tipos de rutas extremas, como se indica en la Figura 2:
Figura 2 Tipos de rutas extremas encontradas en la solución FBA de redes metabólicas en estado estacionario. Adaptado de 35
Tipo I: conocidas como rutas primarias. Son rutas que tienen fluxes de intercambio que cruzan los límites del sistema y representan rutas metabólicas primarias. Estas rutas extremas detallan la conversión de sustratos (A) en productos (E).
Tipo II: conocidas como ciclos fútiles (A→B→C→A, en azul). Las rutas extremas también tienen fluxes de intercambio que cruzan los límites del sistema, pero estos fluxes de intercambio solo corresponden a metabolitos como ATP, NADH, NADPH, H2O etc. Estas rutas deben ir en dirección favorable de energía libre, por ejemplo, involucrando el gasto de ATP, ATP→ADP + Pi.
Un ciclo fútil que funciona en sentido inverso (A→C→B→A, en azul) cargaría metabolitos de energía como el ATP sin una fuente externa de energía (Figura 2). Por lo tanto, es preciso clasificar las rutas tipo II en dos subgrupos36, teniendo en cuenta la direccionalidad de la utilización del cofactor: (a) ciclos fútiles, que consumen energía y, por lo tanto, son termodinámicamente factibles, y (b) ciclos generadores de energía (CGE) que generan metabolitos energéticos como el ATP sin una fuente energética externa. Los CGE deben eliminarse de las redes metabólicas ya que generan sobreestimación de tasas de crecimiento microbiano cuando la producción de biomasa se utiliza como función objetivo 36.
Tipo III: conocidas como ciclos internos (A →C→D→A, en rojo). Son rutas en las que no se involucra metabolitos de intercambio como el ATP, NADH, etc, ni las rutas primarias. Basados en la termodinámica, estos ciclos no pueden estar activos debido a que no hay fuente de energía para conducirlos. Por lo tanto, estas rutas extremas deben eliminarse de las redes metabólicas. Para la red metabólica de Mycobacterium tuberculosis, un patógeno intracelular que ocasiona la Tuberculosis pulmonar, se han identificado ciclos termodinámicos infactibles que afectan enzimas del metabolismo del folato (timidilato cinasas), y algunas enzimas del metabolismo redox (ubiquinona oxidorreductasas) 37.
Actualmente, existen diferentes estrategias para la eliminación de ciclos internos (Rutas Tipo III) y CGE (Rutas Tipo II, generadoras de energía) en redes metabólicas 27,36,38. i) Eliminar aquellas reacciones reversibles linealmente dependientes. ii) Restringir la direccionalidad utilizando datos del cambio en la energía libre de Gibbs de reacción 30,39. iii) Implementación de algoritmos basados en la segunda ley de kirchchoff (LoopLaw) 38,40.
4. Muestreo Uniforme (Uniform Sampling)
Una poderosa herramienta para evaluar las capacidades fenotípicas de las redes metabólicas es el muestreo uniforme 41,42. Este permite identificar todo el espacio de solución y los rangos posibles de los fluxes en estado estacionario de diferente red metabólica que esté bajo condiciones fisicoquímicas definidas (Figura 3). Actualmente, se han desarrollado diferentes algoritmos para el desarrollo del muestreo uniforme 43,44, generalmente basados en el algoritmo de Kaufman y Smith (artificial Centering hit-and-run, ACHR) 45 y muestreo de Montecarlo 46.
El muestreo uniforme ha sido utilizado exitosamente en un sin número de modelos metabólicos a escala genómica para explorar y explicar fenotipos de adaptación metabólica en patógenos 47, células animales 46, plantas 48 y organismos de interés industrial 49.
Figura 3 Ejemplo de distribuciones de probabilidad de fluxes obtenidos por muestreo uniforme en una red metabólica sometida a dos tipos de condiciones fisicoquímicas. CS, hace referencia a la enzima Citrato Sintasa y FUM hace referencia a la enzima Fumarasa del ciclo de Krebs.
Los objetivos del procedimiento de muestreo uniforme son: 1) generar muestras de puntos aleatorios uniformes del espacio de fluxes en estado estacionario (Ec. 21 y 2) calcular el hipervolumen de ese espacio.
Con el fin de que esos objetivos se cumplan, el espacio de solución de fluxes en estado estacionario está encerrado por un objeto geométrico en que los puntos uniformemente distribuidos pueden ser fácilmente generados y permiten calcular cómodamente el volumen. Un paralelepípedo con la misma dimensión del rango, 𝑟, del espacio nulo de 𝑆 (Ec. 21), es un objeto que cumple el criterio de la forma del espacio de fluxes en estado estacionario.
El paralelepípedo es representado como una matrix B , donde cada columna representa un conjunto de bordes del paralelepípedo, tal como se indica en la Ec. 23.
El volumen del paralelepípedo se calcula como se describe en la Ec. 24 50,
donde las columnas de B son los ejes que encierran el paralelepípedo. El muestreo aleatorio uniforme puede ser generado dentro de un paralelepípedo simplemente por medio de la generación de pesos aleatorios uniformes en todos los bordes del paralelepípedo entre los valores mínimos y máximos permitidos (restricciones) y eligiendo puntos que estén dentro del espacio basado en los pesos 𝑤𝑖, generados en cada uno de los vectores base del espacio nulo b i , como se indica en la Ec. 25:
donde 𝑣 es un punto dentro del espacio definido por la suma de los pesos de cada uno de los vectores base entre los valores mínimo y máximos permisibles del paralelepípedo.
5. Análisis de Control Metabólico (MCA, por sus siglas en inglés)
MCA representa un aspecto muy importante para determinar las interacciones entre las diferentes rutas y cuantificar la distribución de flux alrededor de un punto de bifurcación. Se requiere de la cuantificación de una ruta para poder mejorarla sistemáticamente, el control del flux es importante para mantener las velocidades de síntesis y conversión de metabolitos cercanos al balance de materia sobre un amplio rango de condiciones externas. Este concepto proporciona la regulación cuantitativa del flux metabólico a través de los parámetros sensibles denominados coeficientes de controles de flux y de concentración, y coeficiente de elasticidad 51,52. El MCA se aplica a condiciones estables o pseudoestables, y se define únicamente por la actividad de las enzimas que catalizan las etapas bioquímicas individuales en una ruta. El coeficiente de elasticidad (CE) está dado por la Ec. 26 y expresa la sensibilidad de la velocidad de reacción (flux) enzimática alcanzada, 𝑣𝑖, al variar la concentración de los metabolitos X j 12,51,53.
donde
El coeficiente de control puede ser de control de flux (CCF) o de control de concentración (CCC), y se refieren al cambio relativo del flux o en la concentración de un metabolito, en estado estable, como producto en un cambio infinitesimal en la actividad de la enzima. Esto se muestra en las Ec. 27 y 28. Se conocen unos parámetros (que provienen de dos teoremas que emanan de la teoría de MCA que permiten relacionar el coeficiente de control, sea de concentración o de flux con el de elasticidad para a partir del conocimiento de uno, calcular el del otro. Lo anterior se describe en las Ec. 29, 30 y 31 53,54.
donde
Teorema de la suma para CCF es:
Teorema de la suma para CCC es:
Teorema de conectividad es:
Un ejemplo sencillo para entender las bondades de MCA es tomando como caso particular una ruta bioquímica lineal. En este caso, si una enzima exhibe el valor más alto de CCF, dicha enzima puede ser catalogada/considerada como limitante de la velocidad de reacción, es decir, una sobreexpresión de esta enzima incrementa significativamente el flux a través de dicha ruta. En el caso que los CCF no varíen significativamente, se puede afirmar que el control de la ruta está distribuido equitativamente 2.
6. Aplicaciones de MFA/FBA
Con el desarrollo de las tecnologías ómicas (genómica, transcriptómica, proteómica, metabolómica), los modelos metabólicos se han convertido en herramientas de integración fundamental para analizar estos datos y generar hipótesis testeables en el laboratorio que permitan el entendimiento de cómo funciona el metabolismo y cuál es su relación con los diferentes niveles biológicos de las células 55.
MFA y sus derivados han surgido como métodos precisos y confiables para la estimación de fluxes metabólicos intracelulares en diferentes tipos de aplicaciones, biotecnológicas y médicas 56,57. Aunque la mayoría de investigaciones donde se aplica MFA han sido realizadas utilizando microorganismos modelo como E. coli ó S. cerevisiae, también se ha utilizado para comprender el metabolismo y mejorar producciones de metabolitos en microorganismos industriales como Bacillus subtilis (producción de Rivoflavinas) 58,59, Corynebacterium glutamicum (producción de Lisina y Valina) 60,61, Pichia pastoris (producción de S-adenosylmethionine) 62, Penicillium chrysogenum (producción de Penicilina) 63, Aspergillus niger (producción de ácido oxálico) 64, Basfia succiniciproducens (producción de succinato) 65, Rhodopseudomonas palustris (producción de hidrógeno) 66, Streptomyces clavuligerus (producción de ácido clavulánico) 67-70, etc.
En E. coli, específicamente se ha utilizado MFA para la producción de ácidos grasos 71,72, mejorar la disponibilidad de NADPH e incrementar la producción de Licopeno 73, e incrementar la supervivencia a estrés 74. En S. cerevisiae mejorar la producción de Etanol 75, n-Butanol 76, Isoprenoides 77, Acetil-CoA 78, Acido Shikimico y Mucónico 79, S-Adenosil-Metionina 80 y, tolerancia a estrés 59.
En el área de la medicina, MFA y FBA se han utilizado ampliamente en la identificación de biomarcadores y la caracterización metabólica de células de cáncer 81-83, evaluación de la interacción metabólica entre la microbiota intestinal con el desarrollo de alteraciones del intestino 84, incluido cáncer 85 y en la identificación de blancos terapéuticos en bacterias patógenas como Mycobacterium tuberculosis 16,37,86-89.
La biología de sistemas está creciendo a pasos acelerados y este tipo de enfoques de cómputo de fluxes intracelulares se están utilizando en para el entendimiento de fenómenos celulares, y sistémicos cada vez más complejos, como en la combinación con modelos farmacocinéticos para explorar tratamientos a diferentes enfermedades 90-92, o en combinación con modelos basados en agentes para estudiar fenómenos inflamatorios como el desarrollo de granulomas 93-95.
7. Conclusiones de la revisión de estas metodologías
Las estrategias de análisis y síntesis de redes metabólicas en las cuales se aplique las metodologías de MFA, y sus derivados como el FBA, FVA, y el muestreo uniforme, y, el MCA, constituyen herramientas que permiten el estudio y análisis de como interactúa cada uno de los compuestos (metabolitos) intracelulares y extracelulares para organizarlos de forma sistémica y de esta forma entender el comportamiento metabólico y poder proponer estrategias de mejora a cualquier bioproceso que se lleve a cabo, buscando así eficiencia en los recursos. Este material de revisión indudablemente es insumo fundamental para aquellos investigadores que se están adentrando en el mundo de la biología de sistemas o áreas afines, que le permite entender algunos conceptos y seleccionar algunas de estas metodologías para aplicarla a su caso de estudio ya sea para el mejoramiento de un organismo o para su aplicación el mejoramiento de un proceso biotecnológico.
