ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Influencia de la concentración de inóculo en la producción de celulasa y xilanasa por Aspergillus niger

Influence of inoculum concentration on the cellulase and xylanase production by Aspergillus niger

Myriam L. Izarra¹ , Mónica L. Santayana¹ , Gretty K. Villena¹ , Marcel Gutiérrez-Correa¹

¹ Investigadores del Laboratorio de Micología y Biotecnología, Universidad Nacional Agraria La Molina, Lima, Perú. gkvch@lamolina.edu.pe mgclmb@lamolina.edu.pe

Recibido: diciembre 6 de 2009 Aprobado: noviembre 10 de 2010

Resumen

Existe un gran interés por el uso de enzimas lignocelulolíticas en varias industrias, y en la biodegradación de biomasa para la producción de biocombustibles y otras aplicaciones. Entre las fuentes microbianas de enzimas, Aspergillus niger es uno de los microorganismos más utilizados en la producción de enzimas industriales, debido a sus niveles altos de secreción de proteína y a su condición GRAS (generally regarded as safe). El objetivo del presente estudio fue evaluar la influencia de la concentración de inóculo en la morfología y producción de celulasas y xilanasas con A. niger en cultivo sumergido. Para ello, fueron inoculados matraces de 250 mL con 40 mL de medio con 3% (v/v) de una suspensión de 104 o 108 esporas por mililitro e incubados a 28 ^oC y 175 rpm durante 120 horas. Se utilizaron 10 g*L^-1 de lactosa como fuente de carbono. En cada caso se determinó la cantidad de biomasa, la proteína extracelular soluble, lactosa residual, actividad celulasa total y xilanasa cada 24 horas. Aunque no hubo un efecto notorio en la morfología de crecimiento, salvo en el color y el diámetro de pellets obtenidos, sí se afectó la µmax (0,06 y 0,03 h^-1 para 104 y 108 esporas*mL^-1, respectivamente) y la concentración máxima de biomasa. Además, mientras que las productividades volumétricas de celulasa (GFPA) (8,2 y 8,0 UI.*L^-1*h^-1 para 104 y 108 esporas*mL^-1, respectivamente) fueron similares para ambos inóculos, la productividad de xilanasa (GXIL) fue mayor para el inóculo más concentrado (29,7 y 33,4 UI¨*L^-1*h^-1 para 104 y 108 esporas*mL^-1, respectivamente). Los resultados indican que la productividad de celulasas y xilanasas está estrechamente relacionada con la concentración de inóculo.

Palabras clave: celulasa, xilanasa, cultivo sumergido, morfología, Aspergillus niger.

Abstract

There is a great interest for the use of lignocellulolytic enzymes in several industries and in biomass degradation for production of biofuels and other applications. Among the microbial sources of enzymes, Aspergillus niger is one of the most used microorganisms in the production of industrial enzymes due to its high levels of protein secretion and its GRAS (generally regarded as safe) condition. The aim of the present study was to evaluate the influence of A. niger inoculum concentration in the morphology and production of cellulases and xylanases in submerged cultures. For this, 250 mL flasks containing 40 mL culture medium were inoculated with a 3% (v/v) of either 104 or 108 spores per milliliter suspension and incubated at 28 ^o C and 175 rpm during 120 hours. Lactose (10 g*L^-1) was used as the carbon source. In each case, the amount of biomass, the extracellular soluble protein, residual lactose, total celullase activity and xylanase activity were determined every 24 hours. Even thought there was not a notorious effect on the growth morphology, except in color and diameter of pellets; µmax was affected (0.06 and 0.03 h^-1 for 104 and 108 spores*mL^-1, respectively) as well as maximum biomass concentration. In addition, while the volumetric productivity of cellulase (8.2 and 8.0 UI*L^-1*h^-1 for 104 and 108 spores*mL^-1, respectively) were similar for both inocula, the productivity of xylanase was greater for the more concentrated inoculum (29.7 and 33.4 UI*L^-1*h^-1 for 104 and 108 spores*mL^-1, respectively).The results show that cellulase and xylanase productivities are closely related to the inoculum concentration.

Key words: Cellulase, xylanase, submerged culture, morphology, Aspergillus niger.

Introducción

Desde 1950, las enzimas lignocelulolíticas han incrementado su importancia en diferentes industrias como en la producción de alimentos, industria textil, industria papelera, agricultura e investigación (Bhat, 2000), principalmente debido a las ventajas que otorgan en la optimización de procesos. Además, por características como: su especificidad de sustrato, el requerimiento de condiciones suaves de pH, temperatura y presión para su actividad (comparando con procesos químicos), su contribución al cuidado del medioambiente haciendo los procesos más limpios y su posibilidad de inmovilización, evitando la presencia de éstas en los productos finales (MacCabe et al., 2002).

Las enzimas lignocelulolíticas incluyen a celulasas y xilanasas. Las celulasas constituyen un sistema enzimático de cuatro enzimas: la endo ß-glucanasa, que hidroliza randomizadamente celulosa a glucooligosacáridos; la exo ß-glucanasa, que libera glucosa de la celulosa; la celobiohidrolasa, que libera celobiosa de la celulosa cristalina; y la ß- glucosidasa (Szijárto et al., 2004). Asimismo, las xilanasas constituyen también un complejo enzimático responsable de la hidrólisis de xilano, siendo las principales enzimas involucradas la endo-1,4-ß xilanasa, que rompe los enlaces glucosídicos de la cadena principal de xilano produciendo oligómeros de ß-D xilopiranosil, y la ß-xilosidasa que hidrolizan xilobiosa y xilanooligosacáridos (Polizeli et al., 2005).

En respuesta a la demanda creciente de estas enzimas, se ha impulsado la investigación y el estudio de diferentes microorganismos lignocelulolíticos. Los hongos filamentosos son la fuente principal de hidrolasas, incluyendo celulasas y xilanasas, debido a su fácil manejo y costos reducidos. Los principales géneros incluyen a Aspergillus, Trichoderma y Penicillium (MacCabe et al., 2002). Aspergillus niger es uno de los microorganismos más utilizados en la producción de enzimas industriales, principalmente por sus altos niveles de secreción de proteína, y su estatus GRAS (generally regarded as safe) (Ward et al., 2006; Schuster et al., 2002; De Vries y Visser, 2001).

De otro lado, el sistema de cultivo más empleado en la producción de enzimas comerciales es la fermentación sumergida (MacCabe et al., 2002). En este aspecto, en la producción de enzimas con hongos filamentosos, la morfología es de crucial importancia para lograr una mayor producción (Villena et al., 2010; Papagianni, 2004; Pazouki y Panda, 2000). Los factores que afectan la morfología incluyen el tipo y concentración de la fuente de carbono, la concentración del inóculo, los niveles de hidrógeno, fósforo y otros minerales traza, el O2 y CO2 disueltos, el pH y la temperatura, y factores físicos como geometría del fermentador, tipo de agitación, reología y sistema de cultivo (Grimm et al., 2005; Papagianni y Mattey, 2004).

Las principales morfologías desarrolladas en sistemas de fermentación sumergida corresponden al crecimiento miceliar o filamentoso y el crecimiento tipo pellet, este último caracterizado por ser una esfera de micelio. Existen tres tipos principales de pellets, los de centro compacto y contorno laxo, los totalmente compactos, y los de interior vacío debido a autolisis (Pazouki y Panda, 2000).

El objetivo del presente trabajo fue determinar, mediante cultivo sumergido, la influencia de la concentración del inóculo en la morfología y producción de celulasa y xilanasa de A. niger ATCC 10864.

Materiales y métodos

Microorganismo y preparación de inóculo

Se utilizó Aspergillus niger ATCC 10864, el cual fue conservado en cuñas de agar papa dextrosa (PDA). Para obtener el inóculo se cosecharon esporas a partir de cultivos en PDA en matraces de 5 días de crecimiento utilizando 10 mL de solución de Tween 80 al 0,1%. Se realizó el recuento en una cámara Neubauer hasta obtener la concentración final requerida (10⁴ o 10⁸ esporas por mililitro). Estas suspensiones fueron utilizadas como inóculo.

Medio de cultivo

La composición del medio de cultivo por litro fue: KH₂PO₄, 2g; (NH₄)₂SO₄, 1,4g; urea, 0,3 g; CaCl₂.2H₂O, 0,3 g; MgSO4.7H₂O, 0,3 g; peptona, 1 g; Tween80, 2 ml; FeSO₄.7H₂O, 5 mg; MnSO₄.2H₂O, 1,6 mg; ZnSO₄.7H₂O, 1,4 mg; CoCl₂.6H₂O, 2 mg; Lactosa,10 g. El pH final del medio fue 5,5.

Cultivo sumergido

Cada matraz de 250 mL conteniendo 40 mL de medio fue inoculado con 1,2 mL de suspensión de esporas (3%, v/v). Luego, fueron incubados a 28 ^oC en un baño agitado a 175 rpm. Se utilizaron dos repeticiones por inóculo para cada día.

Análisis

La biomasa se determinó por diferencia de peso seco. Para ello, el contenido de cada matraz se filtró por succión con papel de filtro previamente pesado. Luego, el papel filtro fue secado a 80 ^oC para obtener un peso constante. El filtrado fue recuperado y mantenido en congelación hasta el momento del análisis. Se realizaron cuatro repeticiones por cada análisis.

Se determinó la actividad de celulasa total, como actividad sobre papel de filtro (FPA) y la actividad de xilanasa (XIL) de acuerdo con lo reportado por Ghose (1987) y Dueñas et al. (1995). Una unidad internacional (UI) de enzimas se definió como la cantidad de enzima que libera 1 µmol de producto por minuto (equivalentes de glucosa para FPA y equivalentes de xilosa para xilanasa). La proteína soluble fue determinada por el método de Lowry utilizando albúmina sérica bovina como estándar (Lowry et al., 1951).

Análisis estadístico

Los datos fueron analizados por el software Statistical Análisis System (Version 8.1) (SAS® Institute, Inc., Cary, NC, USA) mediante análisis de variancia por el procedimiento de Modelos Lineales Generales y la prueba de Duncan de rangos múltiples para encontrar diferencias significativas entre los tratamientos.

Las curvas de biomasa fueron obtenidas usando el mejor ajuste de la ecuación logística:

siendo C = x_m – x₀/x_m; donde x_m es la concentración máxima de biomasa, x₀ es la concentración inicial de biomasa, y µ_m es la tasa específica máxima de crecimiento. Estos últimos son parámetros identificados por el procedimiento Nilin con el método de Newton del software SAS®.

El análisis de superficie-respuesta para evaluar las variables de actividad de celulasa total, xilanasa y proteína secretada se realizó usando el programa Minitab 14.1 Statistical Software®.

Resultados

Se evaluó el crecimiento y la producción de enzimas lignocelulolíticas de A. niger en cultivo sumergido utilizando concentraciones de inóculo de 10⁴ y 10⁸ esporas*mL^-1. Para ambas concentraciones de inóculo se obtuvo un crecimiento de tipo pellet como se muestra en la figura 1 a, b. La concentración de 108 esporas*mL^-1 generó pellets oscuros y pequeños (figura 1c) mientras que la concentración de 10⁴ esporas*mL^-1 generó pellets de color claro y de diámetro variable (figura 1d). Sin embargo, aunque no hubo un cambio evidente en la morfología de crecimiento, sí se afectó la tasa específica máxima de crecimiento (µ_max) y la biomasa máxima (x_m) de cada cultivo, las cuales fueron 0,03; 0,06 h^-1 y 1,42: 0,48 g*L^-1 para 10⁸ y 10⁴ esporas*mL^-1, respectivamente, de acuerdo con los valores obtenidos mediante el mejor ajuste de la ecuación logística (R² = 0,9) (figura 2a). Asimismo, se advirtió que a menor concentración de inóculo se obtiene una mayor tasa específica máxima de crecimiento, encontrándose una relación lineal inversa entre el logaritmo de la concentración de inóculo y µ_max (R₂ = 0,99). El consumo de lactosa fue lineal en el tiempo y similar en ambos casos como se muestra en la figura 2b. Igualmente, no hubo diferencia significativa (p = 0,0001) para el rendimiento de biomasa respecto a sustrato (Y_x/s) para el día de mayor crecimiento (120 horas), el cual fue 0,14 y 0,13 g*g^-1 para 108 y 104 esporas*mL^-1, respectivamente.

De otro lado, los mayores títulos de FPA y xilanasa (XIL) fueron obtenidos a las 120 horas para ambas concentraciones de inóculo. La tabla 1 muestra los valores correspondientes. Aunque los títulos de actividad FPA fueron semejantes para las dos concentraciones de inóculo, la actividad XIL fue ligeramente mayor para el inóculo de 108 esporas*mL^-1. Del mismo modo, la concentración de biomasa, consumo de lactosa y concentración de proteína soluble fueron significativamente menores para este inóculo (p < 0,0001).

La tabla 2 muestra los principales parámetros de productividad de las dos enzimas evaluadas. Las productividades volumétricas (Γ _E) de FPA y XIL no mostraron diferencias significativas entre ambos inóculos, sin embargo, los rendimientos aparentes de enzima respecto a biomasa (Y_E/X ) y a sustrato (Y_E/S), así como la actividad específica de enzima respecto a proteína soluble (Y_E/Pr), tanto para celulasas como para xilanasas fueron significativamente mayores para el inóculo 104 esporas*mL-1.

La figura 3 muestra el análisis superficie-respuesta para evaluar la influencia de la concentración de inóculo y el tiempo de cultivo sobre el título de actividad de celulasa total medida como FPA (figura 3a) y actividad de xilanasa, XIL (figura 3c), además de sus respectivos diagramas de contorno (figura 3 b, d, respectivamente). Para este análisis estadístico, el punto central fue tomado de datos referenciales de título de actividad enzimática (UI*mL^-1) para una concentración de inóculo de 106 (Villena y Gutiérrez-Correa, 2006, 2007) obtenidos bajo las mismas condiciones de cultivo. Los resultados muestran que, entre las dos concentraciones probadas, el inóculo de 10⁴ esporas*mL^-1 resulta más adecuado para FPA y XIL en comparación con el inóculo 10⁸ esporas*mL^-1. Asimismo, las gráficas resultantes del análisis de superficie-respuesta muestran que tanto para FPA y XIL el mayor título de actividad se obtendría con inóculo 10⁶ esporas*mL^-1 (figura 3 a, c) para las 72 y 96 horas, respectivamente. De otro lado, el análisis de contorno muestra que las concentraciones teóricas más adecuadas para alcanzar mayor actividad FPA y XIL estarían en el rango de 10⁵-10⁷ esporas*mL^-1; entre 55 y 75 horas para la actividad de celulasa y 96 horas para la actividad de xilanasa.

Discusiones

La morfología de Aspergillus está influenciada por varios factores que incluyen las propiedades intrínsecas de cada cepa, la concentración y el tipo de inóculo, la velocidad de agitación, entre otros (El-Enshasy et al., 2006). Para A. niger se ha reportado la formación de pellets cuando la concentración del inóculo está por debajo de 10⁸ esporas*mL^-1 (Papagianni, 2004), sin embargo, en el caso de la cepa evaluada, la morfología de pellet se mantiene aún a concentraciones de 10⁸ esporas*mL^-1. Asimismo, se observó la formación de los pellets a partir de las 24 horas, los cuales fueron de tipo coagulativo, caracterizados por una agregación inicial de las esporas y micelio entrelazado, como ha sido reportado anteriormente (Villena y Gutiérrez-Correa, 2007; Znidarsic y Pavko, 2001; Pazouki y Panda, 2000; Ryoo y Choi, 1999). De otro lado, la diferencia en la concentración de esporas puede explicar el aspecto de los pellets obtenidos en cada caso. El color oscuro de pellets formados a la concentración de 10⁸ esporas*mL^-1 pudo deberse a inhibidores-propios, que inhiben la germinación de esporas cuando están en altas concentraciones (Barrios-Gonzáles et al., 1989). También, el tamaño de los pellets, particularmente para A. niger, se explica por el equilibrio termodinámico que existe entre la superficie del pellet y el medio; la alta hidrofobicidad de las esporas rompe la tensión superficial del medio dando lugar al crecimiento en forma de pellet, mientras mayor sea el inóculo, menor será la tensión superficial del medio y más pequeños los pellets formados (Ryoo y Choi, 1999). Los tamaños de pellets obtenidos en cada caso son coincidentes con este comportamiento.

De otro lado, la morfología desarrollada por un microorganismo tiene una marcada influencia en la productividad. Para la producción de cada enzima o metabolito se tiene una morfología apropiada con la cual se alcanza una productividad óptima; por ejemplo, para la producción de ácido cítrico por A. niger y de acido itacónico por Aspergillus terreus se prefiere el crecimiento en forma de pellets, mientras que para la producción de penicilina se desea el crecimiento en forma de pellets y filamentos. Para la producción de enzimas pécticas por A. niger y para la producción de ácido fumárico por Rhizopus arrhizus se desea el crecimiento filamentoso (Pazouki y Panda 2000), aunque se ha reportado una mayor producción de celulasas con A. niger en microcolumnas de burbujeo aireadas con oxígeno puro, en las cuales se obtuvo crecimiento disgregado (Villena y Gutiérrez-Correa, 2006).

De acuerdo con los resultados, la productividad volumétrica (Γ _FPA) de celulasa obtenida fue similar para las dos concentraciones de inóculo probadas, pero resultaron menores que la productividad volumétrica reportada para un inóculo de 106 esporas*mL^-1 (Γ _FPA = 16,4 UI*L^-1*h^-1) en las mismas condiciones de trabajo para morfología tipo pellet (Villena y Gutiérrez-Correa, 2006). En xilanasa, se observó una mayor productividad volumétrica para la concentración 108 esporas*mL^-1; sin embargo, las productividades para las dos concentraciones de inóculo también fueron menores que las reportadas para 10⁶ esporas*mL^-1 (= 53,1 UI*L^-1*h^-1). Por el contrario, las productividades específicas para ambas enzimas, a las dos concentraciones de inóculo, fueron mayores que las reportadas para 106 esporas*mL^-1 (q_FPA = 6,1 y q_XIL =19.8 UI*g^-1*h^-1, respectivamente) (Villena y Gutiérrez-Correa, 2007).

De otro lado, los niveles de celulasas fueron menores a los reportados por otros autores para A. niger (Subramaniyan y Prema, 2002; Narasimha et al., 2000) y otras cepas celulolíticas (Domingues et al., 2000, 2001) en diferentes medios, mientras que los títulos de xilanasa fueron similares o menores a los obtenidos en otros estudios con diferentes fuentes de carbono (Subramaniyan y Prema, 2002; Ghokale et al., 1986). Sin embargo, fueron superiores a los obtenidos por Chipeta et al. (2005) con la misma cepa de A. niger utilizando inóculo miceliar y xilosa como fuente de carbono.

El cultivo sumergido otorga grandes ventajas, pues permite el modelamiento y escalamiento, facilita el procesamiento de salida, reduce la viscosidad del medio e incluso se pueden reutilizar los pellets para un proceso continuo, donde también se evita el crecimiento de micelio libre en las paredes y en la turbina (Znidarsic y Pavko, 2001).

Conclusiones

La concentración inóculo de esporas no muestra una marcada influencia en la morfología desarrollada por A. niger ATCC 10864 en frascos agitados de cultivo sumergido, la cual fue del tipo pellet. Sin embargo, esta influye considerablemente tanto en la velocidad de crecimiento como en la producción de celulasas y xilanasas, existiendo una relación lineal inversa entre el logaritmo de la concentración de inóculo y la tasa específica máxima de crecimiento µmax. Aunque no se evidencia una diferencia significativa de la productividad volumétrica (Γ _FPA) de celulasa para las dos concentraciones de inóculo probadas, en xilanasa sí se obtiene mayor productividad volumétrica para la concentración 10⁸ esporas*mL^-1. En ambos casos las productividades específicas de celulasas y xilanasa (UI*g^-1*h^-1) fueron superiores a las obtenidas en estudios anteriores para otra concentración de inóculo.

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