ARTÍCULO CORTO

Caracterización molecular y agronómica de aislados de Trichoderma spp nativos del noreste de México

Molecular and agronomic characterization of Trichoderma spp natives of northeastern Mexico

José Luis Hernández Mendoza¹ , María Isabel Sánchez Pérez¹ , Jesús Gerardo García Olivares ¹ , Netzahualcoyotl Mayek Pérez ² Juan Manuel González Prieto ² Jesús Di Carlo Quiroz Velásquez ¹

¹ Laboratorio de Biotecnología Experimental.
² Laboratorio de Biotecnología Vegetal. Centro de Biotecnología Genómica. Instituto Politécnico Nacional, Blvd del Maestro s/n Col Narciso Mendoza, Reynosa, Tam. 88710. México. ce: jhernandezm@ipn.mx

Resumen

Trichoderma sp es un hongo frecuentemente usado en actividades agrícolas, pues actúa como antagonista de diversas especies de hongos fitopatógenos. En este estudio se realizó el aislamiento de cuatro cepas de Trichoderma sp nativas del noreste de México, las cuales fueron identificadas a nivel molecular mediante la secuenciación del ITS 1. Además se evaluó su capacidad antagonista en contra los hongos fitopatógenos Macrophomina phaseolina y Fusarium oxysporum, que afectan severamente cultivos de sorgo, maíz y fríjol en el noreste de México. La identificación se realizó de acuerdo al grado de concordancia con secuencias reportadas y corresponden a las especies T. hammatum (HK701); T. koningiopsis (HK702); T. asperellum (HK703) y Trichoderma sp (HK704). Por otra parte, las pruebas de antagonismo muestran que los aislados HK701, HK703 y HK704 inhiben por competencia el crecimiento de M. phaseolina y F. oxysporum , mientras que HK702 tiene la capacidad para hiperparasitar dichos fitopatógenos. Finalmente, se evaluó la promoción de crecimiento de T. asperellum HK703, en maíz (Pionner 30P49®), usando para ello concentraciones de tratamiento de 1x10e² hasta 1x10e⁶ esp/mL. En estos ensayos se midió la producción de biomasa. Los resultados muestran que en concentraciones intermedias se tiene el mayor incremento en altura de plantas y mayor producción de peso seco en follaje y raíz. Entre los parámetros antes mencionados existen diferencias significativas.

Palabras clave: control biológico, antagonismo, biofertilizantes, Zea maiz , Sorghum bicolor .

Abstract

Trichoderma sp is a fungus often used in agricultural activities, because it acts as an antagonist of several species of plant pathogenic fungi. In this study four strains of Trichoderma sp was isolated from the northeastern Mexico, which were identified by sequencing the ITS 1. We also evaluated its ability antagonistic against phytopathogenic fungi Macrophomina phaseolina and Fusarium oxysporum this fungi are reported affecting severely maize, sorghum and beans crops in northeastern Mexico. The identification was made according to the degree of consistency with reported sequences and the data show that the isolates belong to the species T. hammatum (HK701), T. koningiopsis (HK702), T. asperellum (HK703) and Trichoderma sp (HK704). Antagonism tests showed that the isolated, HK701, HK703 and HK704 inhibited the growth by competition to M phaseolina and F. oxysporum , while the HK702 has the ability to hyperparasites these pathogens. Finally was evaluated in maize (Pioneer 30P49®) We measured the dry weight and biomass production. The results show that at intermediate concentrations have the greatest increase in plant height and dry height of root and foliage.

Key words: biological control, antagonism, biofertilizers, Zea maiz , Sorghum bicolor .

Introducción

Las enfermedades producidas por hongos fitopatógenos causan pérdidas severas en la agricultura (Rey et al ., 2000); estas mermas consisten en la reducción de la calidad y/o la cantidad de la cosecha obtenida (Monte, 2001). La forma tradicional para el control de las enfermedades en cultivos es la aplicación de productos químicos, pero debido a su composición resultan tóxicos e inespecíficos, ya que además de eliminar los organismos fitopatógenos, dañan la flora del suelo (Vinale et al ., 2008). Por ello es necesaria la búsqueda de alternativas orientadas al manejo de agentes antagonistas que sean eficientes y compatibles con el ambiente (Cupull et al ., 2003).

Trichoderma spp. es un organismo de vida libre en suelos y ecosistemas de raíz, donde se pueden observar interacciones complejas entre la planta huésped, los patógenos y diversos factores del ambiente (Harman, 2006; Woo et al ., 2006). Este es un hongo fácil de aislar y cultivar en medios de cultivo naturales o semisintéticos (Rey et al ., 2000).

Diversas especies de Trichoderma spp. son utilizadas en la agricultura para el manejo de fitopatógenos, ya que limitan el desarrollo de hongos dañinos como Rhizoctonia solani , Fusarium oxysporum, Verticillium dahliae (González et al , 2005). Los mecanismos empleados por Trichoderma spp son la competencia, la antibiosis o el hiperparasitismo; en este último caso, se adhiere a las hifas de los fitopatógenos por medio de estructuras especializadas llamadas apresorios y libera enzimas (glucanasas, quitobiosas y quitinasas) y antibióticos (viridina, gliotoxina, gliovirina y peptaiboles) (Howell et al , 1993).

Trichoderma sp es un hongo que degrada la pared celular y destruye las hifas y estructuras reproductivas de Sclerotium cepivorum (Vera et al ., 2005). Este fenómeno es muy importante, pues muchos hongos forman estructuras de resistencia en el suelo que les permiten sobrevivir bajo condiciones adversas del ambiente hasta por más de 20 años (Higuera et al ., 2003).

Se tienen reportes que Trichoderma induce el crecimiento vegetal al degradar el epispermo de la semilla e interviene en los procesos respiratorios durante la germinación. Acelera además, el desarrollo de los tejidos meristemáticos primarios, los cuales aumentan el volumen, la altura, así como el peso de la planta (Moity, 1982; Miranda et al ., 1998; Gravel et al , 2007; Shoresh y Harman, 2008a; Shoresh y Harman, 2008b). Este hongo secreta fitohormonas como el ácido Indol Acético que estimulan la germinación, el crecimiento y desarrollo radicular, mejora la asimilación de nutrientes, lo que influye en el crecimiento vegetativo de cultivos como papa, tomate, maiz y cafetos (González et al , 1999; Cupull et al , 2003; Windham et al , 1986; Andreu et al , 1992; Harman et al , 2004; Harman, 2006; Gravel et al , 2007; Vinale et al , 2008; Sánchez- Pérez, 2009).

Por otra parte, el hongo Macrophomina phaseolina es capaz de atacar a más de 500 especies de plantas cultivadas, entre ellas sorgo, maíz y fríjol, en las que produce la enfermedad conocida como pudrición carbonosa. Además el hongo forma esclerocios como estructuras de resistencia, los que sobreviven en el suelo y son difíciles de destruir (Cardona, 2006). En el caso de Fusarium oxysporum se reporta que ataca a más de 100 especies de plantas gimnospermas y angiospermas (Bosland, 1988; Garofalo and McMillan, 2003) y que puede formar tres estructuras de resistencia: macroconidios (estructuras distintivas del género), microconidios y clamidosporas, estas últimas son las que le permiten sobrevivir como saprófito de vida libre en ausencia de un hospedero (Nelson, 1981).

Existen reportes del antagonismo de Trichoderma spp contra Macrophomina phaseolina, donde T. viride y T. lignorum parasitan las hifas de Macrophomina phaseolina produciendo colapso y degradación de la pared celular (Dhingra and Sinclair, 1978). T. koningii, por su parte, reduce la incidencia de la pudrición carbonosa en semilla de arveja ( Pisum sativum) (Lifshitz et al , 1986). Resultados similares se reportan al tratar plantas de ajonjolí ( Sesamum indicum) con esporas de Trichoderma sp, ya que se reduce el porcentaje de muerte de plantas causadas por Macrophomina phaseolina (Pineda y Gonnella, 1988). Así mismo se observa una resistencia a la presencia de Macrophomina phaseolina cuando las semillas de fríjol son tratadas con una suspensión de 6,8 x 10⁷ ufc/mL^-1 (Adekunle et al , 2001). T. harzianum reduce significativamente la germinación de esclerocios de Macrophomina phaseolina de 30 a 60% (Srivastava et al , 1996) y la incidencia de Fusarium oxysporum en semillas de melón ( Cucumis melo) y en plantas de papayo ( Carica papayag L.) (Booth, 1971; Harman and Nelson, 1994; González et al , 2005).

El objetivo del presente trabajo fue aislar e identificar aislados de Trichoderma spp nativos del noreste de México y hacer una caracterización agronómica de los mismos tomando en cuenta su antagonismo con- tra Macrophomina phaseolina y Fusarium oxysporum y la inducción de crecimiento vegetal en plántulas de maíz.

Materiales y métodos

Aislamiento de cepas

Se procesaron 3 muestras de suelo de la rizósfera de girasol silvestre (Helianthus annus L.) y uno más de rizósfera de pino (Pinus cembroides Zucc) de vivero. Los aislamientos se realizaron en medio de cultivo agar papa dextrosa (PDA) por el método de diluciones (Sánchez-Pérez, 2009), para ello se seleccionaron las colonias que presentaron las características morfológicas de Trichoderma spp, entre las que se destacan: la morfología, la forma, el color y el crecimiento de la colonia.

Caracterización molecular

Obtención de biomasa de aislados de Trichoderma spp

Los aislados de Trichoderma spp. se multiplicaron en matraz con 50 ml de caldo LB (Luria-Bertani, Difco®), incubados a 27 °C y 200 rpm. El cultivo de 72 h de crecimiento se centrifugó para obtener la biomasa.

Extracción de DNA genómico

Se siguió el método modificado de Hoffman y Wriston (1987), citados por Sánchez-Pérez (2009), en el cual la biomasa obtenida es centrifugada y lavada con agua desionizada estéril, el sobrenadante fue desechado. La biomasa se resuspendió en 0,2 ml de solución de lisis (tritón X-100, 2%; SDS, 1%; NaCl, 0,1 M; Tris-HCl pH 8, 10 mM y EDTA 1 mM) y se le añadieron 0,2 ml de fenol-cloroformo (1:1) y 0,3 g de perlas de vidrio (ballotini) de 0,45 mm de diámetro.

vEl tubo donde se trató la biomasa se agitó en vorte durante 1 min, después se colocó en hielo por 1 min y se repitieron estos dos pasos en tres ocasiones; pos teriormente se añadió 0,2 ml de TE 10:1 (Tris 10 mM y EDTA 1 mM) y se centrifugó durante 10 min a 12000 rpm a 4 °C. La fase acuosa se transfirió a un tubo nue vo al cual se le añadieron 10 µl de RNAsa. Posterior mente se incubó a 37 °C por 15 min. Enseguida s agregaron 10 µl de acetato de amonio (NH₄ C₂ H3O₂ 4 M) y 1 ml de etanol (C₂ H5OH) al 100%; se dejó repo sar por 15 min a -20 °C, se centrifugó a 12000 rpm po 5 min a 4 °C. El sobrenadante se desechó y se lavó e sedimento con 100 µl de etanol al 70%, se centrifugó nuevamente para eliminar la fase acuosa y se secó e precipitado a 55 °C durante 5 min. El DNA obtenido s resuspendió en 40 µl de TE 10:1 y se mantuvo a -20 °C hasta su uso.

Una vez que se extrajo el DNA se visualizó en gel de agarosa al 1% y se adicionó 0,1 µl de syber gold. Para ello se depositó 1 µl de cada muestra en el gel y se corrió en una cámara de electroforesis horizontal (BIO- RAD, ®) a 100 v por 50 min, usando una fuente de poder EC105. Se observó el gel en el transiluminador de luz ultravioleta y se captó la imagen del gel con el programa Kodak digital Science® 1D.

Amplificación ITS

Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen final de 50 µl. Se utilizó 1 µl del ADN genómico, 5 µl de Buffer 10X (concentración final a 1X), 1,5 µl de cloruro de magnesio de 50 mM (final 3 mM), 1 µl de dNTPs 10 mM (0,2 mM), 1 µl de cada uno de los iniciadores 5 µM (final 0,1 µM) y 0,4 µl de la enzima Taq DNA polimerasa y se adicionó agua milliQ estéril hasta alcanzar el volumen de 50 µl. El programa de amplificación que se utilizó consis tió en 1 ciclo de 3 min a 94 °C y 35 ciclos de 1 min a 94 °C, 1min a 53 °C y 1 min a 72 °C. Por último, se realizó una extensión final de 1 min a 72 °C y se procedió a visualizarla en un gel de agarosa al 1%, se adicionó 0,1 µl syber gold y 0,4 µl de orange. Se depositaron 5 µl de cada muestra en el gel y se corrió en una cámara de electroforesis horizontal (Bio- Rad®) a 80 volts por 1 h. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un termociclador Peltier MJ Research® y los geles se trataron como ya se mencionó con anterioridad.

Secuenciación

Los productos de PCR, en una concentración de 50 ng, fueron tratados en el secuenciador de columna marca Applied System, modelo 3130®. Para la identificación a nivel de especie, se empleó el primer de ITS 1 Forward (5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’), las secuencias obtenidas fueron comparadas con las secuencias de referencia de la base de datos del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y en TricOkey de ISTH (http://www.isth.info/tools/molkey/index.php), y se asignó la especie de acuerdo a los niveles de concordancia.

Fitopatógenos

La cepa de Macrophomina phaseolina (cepa HMP5) fue aislada de plantas de fríjol (Phaseolus vulgaris) en Cotaxtla, estado de Veracruz, México.La cepa HFO6 de Fusarium oxysporum también se aisló de fríjol en la Isla, estado de Veracruz, en México. Ambos materiales fueron proporcionados por el Laboratorio de biotecnología vegetal del Centro de biotecnología genómica del Instituto Politécnico Nacional (IPN).

Antagonismo

Los hongos fueron cultivados de manera individual en cajas de petri con PDA y se obtenieron mediciones de desarrollo de la colonia cada 24 h. Posteriormente se realizaron las pruebas de antagonismo en individual, confrontando directamente la Trichoderma spp. contra los fitopatógenos, siguiendo la metodología descrita por Acevedo (1995), la cual consiste en colocar en puntos opuestos en una caja de petri con PDA, un disco de 7 mm de diámetro de agar con micelio de siete días de desarrollo de Macrophomina phaseolina y Fusarium oxysporum (respectivamente), y en el otro extremo, un disco de agar con micelio de Trichoderma spp. de cuatro días de crecimiento. Cada ensayo se realizó por triplicado.

Inducción de crecimiento

La evaluación de la inducción de crecimiento fue realizada en semillas (72 por tratamiento) de maíz (Pionner 30P49®), las cuales fueron inoculadas en una caja de petri (55 mm) con 6 ml de la suspensión de esporas de cada uno de los tratamientos (1x10 e² a 1x10 e⁶ esporas por mL^-1 ). Las semillas se incubaron por 72 h, luego se sembraron en charolas de 72 cavidades (capacidad 120 ml de sustrato c/u) con una mezcla de suelo agrícola y perlita en relación 3:1v/v. Se realizó la evaluación de biomasa producida (medida como peso seco de raíz, follaje y peso total) a los 15 y 30 días después de la siembra. Para el análisis estadístico se utilizó la comparación de medias, se obtuvo la diferencia mínima significativa con el programa de cómputo de Olivares (1994) y se graficó con el programa Microsoft Excel XP® y GraphPad Prism 4.0®.

Resultados

Identificación molecular

Las muestras permitieron el aislamiento de 4 cepas de Trichoderma spp, las cuales fueron codificadas como HK701, HK702, HK703 y HK704. Las 3 primeras fue-ron obtenidas de la rizósfera de Helianthus annus L. y la HK704 de la rizósfera de Pinus cembroides Zucc. Se realizó la asignación de la especie comparando las secuencias obtenidas para cada aislado y se alinearon empleando las bases de datos del NCBI y del TricOkey. Las especies identificadas corresponden a T. hamMatum; T. koningiopsis; T. asperellum y a Trichoderma sp respectivamente. En este caso, solo la HK704 tuvo un nivel de correspondencia con secuencias reportadas para otras especies, inferior al 60%, razón por la cual se reporta solo como Trichoderma sp.

Los aislados HK702 y HK703 fueron depositados en el ARS Culture Collection (NRRL, http://nrrl.ncaur.usda.gov) donde quedaron protegidos para procedimientos de patentes con los códigos NRRL 50190 y NRRL 50191 respectivamente.

Pruebas de antagonismo

Los resultados obtenidos de las pruebas de desarrollo in vitro de los aislamientos muestran que el HK702 de Trichoderma koningiopsis tiene un crecimiento vegetativo más rápido que los otros dos, T. hammatum (HK701) y T. asperellum (HK703), todos obtenidos de Helianthus annus L., y que Trichoderma sp (HK704), aislado de Pinus cembroides Zucc., los cuales tienen un crecimiento similar entre sí (gráfica 1a).

En las pruebas de antagonismo, el crecimiento de Trichoderma spp es variable; frente a M. phaseolina el HK702 tiene una mayor velocidad de crecimiento que los otros tres (HK701, HK703 y HK704), lo cuales tienen una velocidad similar entre sí en las primeras 48 h. En el caso del HK704, este disminuye su velocidad de crecimiento al aproximarse a M. phaseolina (gráfica 1b). En cuanto a las tasas de crecimiento de las colonias de Trichoderma spp. frente a F. oxysporum , se detectó que el aislado HK702 tiene mayor crecimiento que los otros tres aislados, los cuale tienen un comportamiento similar entre ellos (gráfica 1c).

En cuanto al crecimiento de M. phaseolina, en comparación al testigo, se observa que a las primeras 24 h crece más cuando está frente a Trichoderma spp que cuando está solo (gráfica 2a). Los aislados HK701, HK703 y HK704, a las 48 h mostraron un desarrollo significativamente menor en comparación al testigo (gráfica 2b). A las 72 h HK702 disminuyó su tasa de crecimiento, mientras que HK704 la incrementó y fue similar al testigo.

En las pruebas de antagonismo de los 4 aislados d Trichoderma spp contra F. oxysporum , se observó qu el primero no afectó la velocidad de crecimiento de F. oxysporum , pero sí limitó su desarrollo una vez que entraron en contacto (gráfica 2b).

El contacto entre las colonias de Trichoderma spp y M. phaseolina se observó en el caso del aislado HK702 a partir de las 48 h y a las 72 h con los otros tres aislados. El sitio donde los dos hongos hacen contacto es caracterizado por una ligera variación en coloración, lo cual indica la incompatibilidad que existe entre ellos. Como se puede observar en la figura 2a, en la parte superior el aislamiento HK704 presenta una franja color crema o beige amarillenta, igual se presenta con los aislados HK701 y HK703. En la parte inferior de la figura 2a se observa que el medio de cultivo no presentó cambios de coloración cuando entran en contacto T. koningiopsis (HK702) y M. phaseolina, por lo que se estima que no hay antibiosis. Sin embargo, algo muy interesante fue observado, T. koningiopsis sigue creciendo sobre las colonias de ambos fitopatógenos F. oxysporum y M. phaseolina (figura 2b). Este fenómeno es importante, ya que muestra un hiperparasitismo que debe ser considerado entre los parámetros relevantes para evaluar su uso potencial en agricultura para el control biológico de fitopatógenos.

A nivel individual, en la interacción entre los aislados de T. koningiopsis y M. phaseolina se observó a nivel microscópico que el primero enrolla a la hifa de M. phaseolina. En el caso de F. oxysporum se puede observar como las hifas de T. koningiopsis crecen y se desarrollan adheridas a las hifas del fitopatógeno (figura 3).

El ANOVA mostró diferencias significativas para tratamientos en los tres parámetros analizados (peso folla-je, peso raíz y peso total), no ocurrió lo mismo para la fuente de variación de bloques en ningún parámetro de peso de plántulas de maíz (Pionner 30P49®) tratadas con T. asperellum (HK703) (Tabla 1 ).

En cuanto a la comparación de medias (DMS), el tratamiento de la concentración 1x10 exp ⁴ esp/mL^-1 mostró un efecto promedio más alto en el caso del peso seco de follaje, con diferencias significativas con las otras cinco concentraciones analizadas y con el tratamiento testigo. En cuanto al peso de raíz, el tratamiento de la concentración de 1x10 exp⁴ esp/mL^-1 fue donde se obtuvieron los valores más altos, seguido por la concentración de 1x10 exp3 esp/mL^-1 . Finalmente, los tratamientos de 1x10 exp² y 1x10 exp5 esp/mL^-1 mostraron un comportamiento igual que el testigo. Con respecto al peso seco total, sigue siendo la concentración de esporas 1x10 exp⁴ esp/mL^-1 donde se observan las mayores diferencias entre tratamientos (gráfica 3).

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