INTRODUCCIÓN
Los agaves son recursos fitogenéticos diversos y endémicos del continente Americano (Granados, 1993; García, 2007), encontrándose principalmente en zonas árida y semiáridas de México (Pérez Molphe et al., 2012). Sin embargo, estas especies se aprovechan en exceso como materia prima para la elaboración de bebidas alcohólicas y fibras naturales (Martínez-Ramírez et al., 2014), y esto ha provocado la disminución de poblaciones de varias especies (SEMARNAT, 2010). Dentro de estas plantas se encuentra Agave marmorata Roezl, cuya existencia es de forma silvestre en cerros o montañas en la Mixteca Poblana (México) donde es obtenida para uso medicinal (Flores-Maya et al., 2015) e incluirla en la gastronomía sin preocuparse por su conservación y reproducción. Además, Agave marmorata también tiene gran impacto ambiental por su capacidad en retener y conservar agua de lluvia y en reducir la erosión del suelo, siendo el estado de Puebla (México), después de Oaxaca, el estado con mayor diversidad de agaves (García, 2007). Una estrategia para recuperar, multiplicar y preservar especies vegetales es el cultivo de tejidos vegetales in vitro (Jacques, 1988; Madrigal et al., 1990; Pierik, 1990), y ya existen algunos procedimientos de micropropagación y aclimatación de agaves como Agave inaequidens Koch (Aureoles-Rodríguez et al., 2008), A. salmiana (Ramírez et al., 2008), A. fourcroydes Lem. (Garriga et al., 201 0), A. tequilana Weber (Portillo et al., 2007; Ramírez et al., 2008; Angeles-Espino et al., 2012), A. grijalvensis B. Ullrich (Santíz et al., 2012), A. americana variedad oaxa-cansis (Luna et al., 201 3; Cruz-García et al., 201 7) A. angustifolia Haw. (Monja-Mio et al., 2015; Ríos-Ramírez et al., 2017), A. potatorum Zucc (Luna-Luna et al., 201 7). No obstante, se carece de información sobre la propagación in vitro de Agave marmorata Roezl y su aclimatación. Por ello, el objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de 6-Bencil-adenina (BA) con ácido indol-3-acético (AIA) para la micropropagación de Agave marmorata Roezl in vitro y estimar el porcentaje de sobrevivencia de plantas en aclimatación bajo diferentes sustratos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Origen del material vegetal
La presente investigación se llevó a cabo de en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales de la Universidad Tecnológica de Izúcar de Matamoros, Puebla, a partir de la obtención de brotes a través del cultivo in vitro de ápices de plantas de Agave marmorata R, colectadas en Tehuitzingo, Puebla, lugar ubicado a una altitud promedio de 1060 msnm en las coordenadas 18° 19' 55" N, 98° 16' 32" O.
Condiciones de cultivo
Los brotes obtenidos fueron cultivados en un medio de cultivo básico de Murashige y Skoog (1962) al 100 %, suplementado con 3 % de azúcar de mesa, 1 00 mg-L-1 de myo-inositol, 0.7 % agar, 0.40 mg-L-1 de tiamina-HCl y pH de 5.7 ± 0.1. Se adicionaron por separado cinco concentraciones de ácido indolacético (AIA) (0.0, 0.3, 1.0, 3.0 y 10.0 mg-L-1) y cinco de 6-benzyladenina (BA) (0.0, 0.3, 1.0, 3.0 y 10.0 mg-L-1) efectuándose un diseño de tratamientos completamente al azar con arreglo factorial 5x5. Después de diluir el agar en el medio nutritivo, se vertió en frascos de 20 mL por frasco y se cubrieron con tapas de polipropileno para esterilizarse por 20 minutos en autoclave de vapor de agua tipo horizontal a 121 oC y 1.5 kg/cm2 de presión. Una vez cultivados los explantes in vitro se mantuvieron en condiciones de 24 horas con luz artificial mediante lámparas de luz blanca y a una temperatura de 26 ± 2 °C en el área de incubación. Para las respuestas se evaluó: número y longitud (cm) de brotes y de raíces a las diez semanas de cultivo in vitro. Para ello, se retiraron las vitroplantas de los recipientes de cultivo en campana de flujo laminar y con ayuda de hojas milimétricas estériles y una regla de aluminio se tomaron los datos de cada variable.
Aclimatación de plantas obtenidas in vitro
Las condiciones ambientales donde se llevó a cabo la aclimatación de las plantas de Agave marmorata obtenidas in vitro fueron las del área de incubación del Laboratorio de cultivos tejidos vegetales. Los recipientes de cultivo se trasladaron al área de lavado para extraer las vitroplantas y retirarles el agar de las raíces con agua potable. Posteriormente, se colocaron en una solución de fungicida Manzate® (1 g-L-1) por cinco minutos, se decantó el fungicida y se procedió a colocar las plantas de Agave marmorata en diferentes sustratos. Los sustratos empleados para realizar el proceso de aclimatación fueron: agrolita®, peat most (Cosmopeat®), tezontle, arena de río, peat most con agrolita® (1:1) y peat most con arena de rio (1:1). Antes de llenar una charola de unicel de 200 cavidades con cada uno de los sustratos, estos se humedecieron a capacidad de campo únicamente con agua. Después de colocar una planta por cavidad, se cubrieron con plástico transparente para conservar la humedad por espacio de tres semanas, pasado ese tiempo, se retiró el plástico para tomar el porcentaje de sobrevivencia de plantas.
Análisis estadístico
Para el análisis de los resultados in vitro se consideraron 10 repeticiones por tratamiento tomando un tubo de ensaye como unidad experimental con un brote de A. marmorata cada uno y registrando las observaciones durante 10 semanas. Los datos se sometieron a análisis de varianza y se aplicó la prueba de Tukey (p=0.05) para determinar la diferencia entre los efectos medios de los tratamientos. El paquete estadístico empleado fue Minitab 17.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Formación de brotes in vitro en Agave marmorata R.
Los resultados obtenidos de organogénesis directa son similares a los reportados para A. fourcroydes (Robert et al. (1987), A. sisalana (Das, 1992) y A. schidigera (Rodríguez et al., 1996) al obtener nuevos brotes directamente del explante sin la formación de callo, pero sólo cuando las concentraciones de AIA eran sumamente elevadas con respecto a BA, resultados que difieren con Domínguez et al. (2008) al obtener 10.5 y 6.9 brotes en A. cupreata con 1.5 mg-L-1 y con 1.0 mg-L-1 de BA, y 6.4 brotes en A. difformis, 6.1 brotes en A. karwinskii, 4.7 brotes en A. obscura y 5 brotes en A. potatorum con 1.0 mg-L-1 de forma directa. Sin embargo, cuando las concentraciones de BA eran mayores (10.0, 3.0 y 1.0 mg-L-1) con respecto a AIA (3.0, 1.0, 0.3 y 0.0 mg-L-1), T24, T18, T12 y T5, respectivamente, sí se formó callo. Posteriormente, a partir de los callos se formaron pequeños brotes poco diferenciados, pero a las tres semanas de su formación presentaron hojas con puntas secas. Sin embargo, los resultados obtenidos a partir de organogénesis indirecta en A. marmorata, señalan que la presencia de BA es fundamental para la formación de callo como se demuestra en A. sisalana (Hazra et al., 2002; Nikam, 1997) al obtener brotes adventicios a partir de callos con 6.0 mg-L-1 de BA, y también como manifiesta Reyes-Zambrano et al. (2016) en A. americana L. obteniendo un máximo de 74 plantas por callo mediante el uso de 2.26 p:M (0.5 mg-L-1) de 2,4-D y 38.2 mM (8.6 mg-L-1) de BA.
En el presente trabajo, el mejor tratamiento de forma estadísticamente significativa (Tukey, p=0.05) para la proliferación de brotes fue T25 con 41 ± 3.2 brotes nuevos, seguido de los tratamientos: T24 y T23 con 36.18 ± 3.12 y 31.85 ± 4.15 brotes respectivamente (tabla 1), resultados superiores a los obtenidos por Luna et al. (2014) en A. americana al obtener 21 brotes con 6.0 mg-L-1 de BA. Se halló, que cuando AIA y BA se encuentran en igual concentración (T7, T13, y T19) con respecto a 10-0 mg-L-1 de BA (T5) ó 10-0 mg-L-1 de AIA (T21), la multiplicación de brotes se ve favorecida, esto indica que en Agave marmorata in vitro la presencia de AIA es indispensable para la formación de nuevos brotes combinado con BA tal como sugiere Siddique et al. (2015) exponiendo el máximo número de brotes en Cassia angustifolia Vahl (Fabaceae) con 5 mM (1.1 mg-L-1) de BA más 0.5 mM (0.9 mg-L-1) de AIA en un medio MS, por lo tanto, los resultados sugieren que concentraciones mayores a 3.0 mg-L-1 de BA sin AIA, y viceversa, inhiben la multiplicación in vitro de Agave marmorata, resultados que coinciden con Ramírez et al. (2008), al obtener mejor producción de brotes en Agave spp. en concentraciones bajas de ácido indolbutírico (AIB) y BA, pero los resultados difieren con Koné et al. (2013), donde la formación de brotes en Vigna subterránea se dio en presencia de BA con o sin ácido naftalenacético (ANA), esto revela que la formación de brotes in vitro no es exclusiva de la combinación de BA y AIA o AIB en agaves, sino del tipo de especie o familia vegetal con que se trabaje. Sin embargo, Luna et al. (2014) reportan la formación de hasta cuatro brotes en A. americana con 10.8 cm presentando raíces adventicias sin BA. También Ramírez et al. (2008), mencionan la formación de 12 brotes axilares por explante en A. tequilana al tratar tejidos con ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Esto indica que la concentración endófita de reguladores de crecimiento puede influir en el tipo de respuestas morfogénicas obtenidas.
Longitud de brotes in vitro en Agave marmorata R.
Se destaca que la presencia de AIA tienen efecto en la diferenciación, crecimiento y desarrollo de brotes formados o neoformados in vitro en Agave marmorata R. pero sin la presencia de BA, siendo su efecto de manera más rápida con forme se incremente la cantidad de AIA (desde 0.3 mg-L-1 hasta 10.0 mg-L-1) resultando superior de manera estadísticamente significativa (Tukey, p=0.05) el T21 (AIA 10.0 mg-L-1 + BA 0.0 mg-L-1) con 2.7 ± 0.3 cm y el T16 (AIA 3.0 mg-L-1 + BA 0.0 mg-L-1) con 2.4 ± 0.1 cm por brote (tabla 1), ambos tratamientos a partir de los primeros siete días evidenciaron resultados para esta variable pero son inferiores a los obtenidos por Luna et al. (2014) en A. americana logrando 6.5 cm por brote con 6.0 mg-L-1 de BA y 40 g-L-1 de sacarosa, esto indica que aún hay otros factores a considerarse para obtener las respuestas morfogénicas deseadas. Por otra parte, el T25 (AIA y BA 10.0 mg-L-1) fue de los tratamientos que al inicio empezó muy rápido a facilitar la longitud de los brotes formados, no obstante, al ser el tratamiento que originó mayor cantidad de brotes, su capacidad para favorecer la longitud se redujo conforme transcurrieron los días de cultivo in vitro llegando a estabilizarse a partir de la sexta semana, resultados similares en los tratamientos T24, T23, T22, T20, T19, T18, T17, T13 y T9, donde se encuentra presente BA y AIA en concentraciones que favorecen la formación de brotes pero también la longitud (tabla 1), lo que puede crear sinergia para formar brotes, resultados similares a lo obtenido por Ríos-Ramírez et al. (2017), pero también antagonismo para favorecer la longitud (cm) de brotes entre los reguladores de crecimiento en esas concentraciones de acuerdo a los resultados obtenidos en A. marmorata. Por ello, se puede afirmar que los resultados de los tratamientos para la variable longitud (cm) de brotes son relativos con respecto a los tratamientos para la multiplicación de brotes, es decir, a mayor multiplicación de nuevos brotes in vitro de Agave marmorata, la longitud (cm) de ellos se ve reducida y viceversa, a menor número de brotes por la ausencia de BA y mayor concentración de AIA, la longitud de brotes es promovida al igual que el vigor general de brotes y raíces.
Formación de raíz en brotes in vitro de Agave. marmorata R.
A partir de la primera semana de cultivo in vitro, los tratamientos T6 (AIA 0.3 mg-L-1 + BA 0.0 mg-L-1), T11 (AIA 1.0 mg-L-1 + BA 0.0 mg-L-1), T16 (AIA 3.0 mg-L-1 + BA 0.0 mg-L-1) y T21 (AIA 10.0 mg-L-1 + BA 0.0 mg-L-1) favorecieron la diferenciación de brotes y formación de raíces. Esto parece estar relacionado por el tipo de regulador de crecimiento vegetal que es una auxina (AIA) similar a lo que reporta Enríquez-del Valle et al. (2016) en la aparición de raíces en A. potatorum, entre 10 y 14 días de cultivo in vitro empleando 1.0 mg-L1 de AIB, pues al originar raíces a los brotes, éstos tienen mayor capacidad de absorber nutrientes, lo que favorece un mayor crecimiento y desarrollo, resultados que igualmente coinciden con Luna et al. (2013), en brotes de A. americana variedad oaxacansis, llegando a la conclusión que la adición de AIB en 0.5 ó 1.0 mg-L-1 al medio de cultivo estimula no sólo mayor cantidad de raíces, sino también el crecimiento de brotes en menor tiempo. También se observó en A. marmorata que la presencia de BA inhibió el efecto de AIA para formar raíces a medida que aumenta su concentración en los medios de cultivo (tabla 1), resultados similares a los obtenidos por Luna et al. (2014) en A. marmorata con BA, la cual inhibió la formación de raíces, pero en ausencia de BA sí hubo presencia de raíz, resultado que también coincide en este estudio con A. marmorata para T1 (AIA y BA 0.0 mg-L-1) (tabla 1). Por otra parte, varios autores reportan que las sales inorgánicas MS al 50 % de su concentración son suficientes para inducir la aparición de raíces como lo menciona Martínez y Pacheco (2006) logrando el 100 % de brotes con raíz in vitro después de 30 días de cultivo en un medio MS modificado y suplementado con AIA, AIB o en ausencia de reguladores de crecimiento vegetal. Así mismo, Siddique et al. (2015) reporta la eficiencia del medio MS 50 % para el enraizamiento de brotes de Cassia angustifolia Vahl pero adicionado con 2.0 p:M (0.4 mg-L-1) de AIB. De igual forma, Santacruz et al., (1999) reporta el enraizamiento de brotes in vitro en Agave parrasana al emplear un medio MS sin reguladores de crecimiento, lo que coincide con Powers y Backhaus (1989) y con este trabajo para T1 (control) con únicamente sales MS al 100 % para favorecer la presencia de raíces en Agave marmorata in vitro (1.88 ± 0.82 bc) pero estadísticamente no significativo (Tukey, p=0.05) comparado con T6 (4.11 ± 1.09 ab), T16 (3.95 ± 0.45 ab) y T21 (4.98 ± 1.12 a), resultado esperado también para T11 ya que tiene 1.0 mg-L-1 de AIA (tabla 1), sin embargo, 1.0 mg-L-1 de AIA en Agave marmorata in vitro parece ser menos eficaz que 1.0 mg-L-1 de AIB (Enríquez-del Valle et al., 2005). También es importante resaltar que 70 días de cultivo in vitro de Agave marmorata fue suficiente para considerar que el efecto de los reguladores de crecimiento y las sales inorgánicas MS fuera eficaz según Nikam (1997), quien recomienda un periodo de 21 a 35 días para lograr el enraizamiento usando diferentes combinaciones de BA, ANA, AIA y 2,4-D.
Longitud de raíz en brotes in vitro de A. marmorata R.
La longitud de raíces formadas estuvo determinada estadísticamente significativa (Tukey, p=0.05) por los tratamientos que contenían 3.0 y 10.0 mg-L-1 de AIA (T16 y T21) con 8.2 ± 0.6 cm y 9.3 ± 0.7 cm, respectivamente, seguidos por el tratamiento control (T1) y por 0.3 mg-L-1 de AIA (T6) con 6.4 ± 0.16 cm y 6.7 ± 0.4 cm, respectivamente, con relación a los demás tratamientos (tabla 1). Un dato interesante de mencionar es el hecho de que 1.0 mg-L-1 de AIA para Agave marmorata in vitro sólo parece tener efecto en la formación de brotes nuevos al combinarse con 1.0 mg-L-1 de BA, pues para favorecer la longitud de raíces fue superado estadísticamente significativa (Tukey, p=0.05) por 0.3 y 0.0 mg-L-1 de AIA (tabla 1). También, la forma de raíz que se formó dependió de los tratamientos con únicamente AIA, donde aparecieron raíces ramificadas (T1 y T6) y raíces tipo pivotante cada vez más vigorosas conforme aumentaba la concentración de AIA (T11, T16 y T21) pero sin raíces secundarias como en T1 y T6. Estos resultados facilitan tomar decisiones a la hora de elegir el medio de cultivo, regulador de crecimiento y concentración si el siguiente paso del cultivo in vitro de Agave marmorata es la aclimatación. Sin embargo, los resultados distan mucho de lo mencionado por Enríquez-del Valle et al. (2005) en A. angustifolia con 1.0 mg-L-1 de AIB y a lo mencionado por Enríquez-del Valle et al. (2016) en A. potatorum. Como se puede observar en la tabla 1, 1.0 mg-L-1 de AIA (T11) es el tratamiento que menos favoreció la presencia y longitud (cm) de raíces (2.18 ± 0.2) en Agave marmorata siendo superado por el tratamiento control (T1) y por T6 con 0.3 mg-L-1 de AIA de manera estadísticamente significativa (Tukey, p=0.05). A pesar de, los resultados de este estudio con A. marmorata muestran que a mayor concentración de AIA en el medio de cultivo, la presencia y longitud de raíces se ve favorecida de forma estadísticamente significativa (T16 y T21) con respecto a T6 (0.3 mg-L-1 de AIA) y T1 (control) (tabla 1).
Respuestas de brotes in vitro de Agave marmorata R., por tratamiento. Los tratamientos que tienen la misma letra, no son estadísticamente diferentes (Tukey, p = 0.05).
Aclimatación de plantas obtenidas in vitro
La supervivencia de las plantas a condiciones ambientales fue del 100 % en los sustratos a base de peat most con agrolita y peat most con arena de rio. Sin embargo, agrolita®, arena de rio y tezontle mostraron menor supervivencia de plantas de A. marmorata obtenidas in vitro en un 38.7 %, 35.7 % y 72.4 % de sobrevivencia respectivamente, resultados similares a los obtenidos por Domínguez et al. (2008) en Agaves mexicanos ( Agave cupreata, A. difformis, A. karwinskii, A. obscura y A. potatorum) logrando un porcentaje de sobrevivencia del 53, 73, 60, 100 y 73 %, respectivamente, en un suelo comercial para macetas y arena (1:1). Esto indica que el sustrato peat most y arena de río es una buena alternativa para la aclimatación de plantas de Agave marmorata obtenidas in vitro, reduciendo costos al sustituir la arena de río a otro sustrato comercial. También, Siddique et al. (201 5), reporta el 80 % de supervicencia de plantas de Cassia angustifolia Vahl aclimatadas en macetas con suelo de jardín, entendiendo que un sustrato con buena retención de humedad, aireación y buen drenaje son ideales para favorecer la supervivencia de plantas ex vitro. No obstante, los resultados obtenidos por Cruz-García et al. (2017), mostraron que el sustrato y la disponibilidad de nutrientes influyen durante la aclimatación de plantas de A. americana var. oaxa-cansis, por lo tanto, es importante seguir evaluando diferentes sustratos para cada especie propagada in vitro y que se pretenda aclimatar con éxito para ser llevada a campo.
CONCLUSIONES
Se logró propagar in vitro la especie Agave marmorata Roezl y se determinó que los mejores sustratos para la aclimatación de plantas de Agave marmorata obtenidas in vitro son las mezclas de peat most más agrolita y peat most más arena de río. También se encontró que la multiplicación y diferenciación in vitro de brotes de Agave marmorata Roezl es favorecida cuando las concentraciones de AIA y BA se adicionan al medio de cultivo MS en iguales concentraciones.
La realización de la presente investigación in vitro permite contar con información confiable para desarrollar un proyecto de micropropagación y aclimatación de Agave marmorata ya que se tiene el protocolo para cada una de las etapas del cultivo de tejidos vegetales in vitro de dicha planta.