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INTRODUCCIÓN
La Agatisflavona y Amentoflavona son biflavonoides presentes en la parte aéreas (hojas, corteza y frutos) de varias especies vegetales entre ellas la Selaginella moellendorffii, Selaginella sinensis, Agathis robusta, Rhus coriaria y Rhus succedanea, la Punicalina (tanino hidrosoluble) se encuentra presente principalmente en el tejido externo del fruto de Punica granatum (Abu-Reida et al., 2014; Islam et al., 2019; Lin et al., 1999; Singh et al., 2018; Yu et al., 2017). Varios estudios demostraron las actividades antivirales de la Agatisflavona contra los virus DENV2 y DENV3 (virus del Dengue), el virus de la Influenza A y B, VIH-1 (virus de Inmunodeficiencia Humana 1) (de Freitas et al., 2020; de Sousa et al., 2015; Islam et al., 2019; Lin et al., 1997, Lin et al., 1999).
También se ha descrito efectos antivirales de la Amentoflavona contra virus como el HSV (virus Herpes Simplex) (Li et al., 2019), virus del Dengue (Coulerie et al., 2012), SARS-CoV (Ryu et al., 2010), VIH (Lin et al., 1997) y el HCV (virus de la Hepatitis C) (Lee et al., 2018). En cuanto a la Punicalina se registró su capacidad de reducir la replicación del VIH (Nonaka et al., 1990) e inhibir la producción de moléculas de cccADN (ADN circular cerrado covalentemente) del HBV (Virus de la Hepatitis B) (Liu et al., 2016).
Suručić et al. (2020), en una investigación in silico han descrito que la Punicalina presenta interacciones con la glicoproteína S del SARS-CoV-2 (E=-7,406 kcal.mol-1), la proteína ACE2 (enzima conversora de angiotensina 2) (E=-7,353 kcal.mol-1), la furina (E=-9,725 kcal.mol-1) y la TMPRSS2 (proteasa transmembrana serina 2) (E= -8,168 kcal.mol-1), siendo sugerida por los autores como candidata para estudios in vitro por su potencial actividad inhibitoria.
Muchos virus como el VIH-1, DENV, HSV, virus de la Influenza A y B, y otros virus de ARN poseen como parte del ciclo replicativo una fase dependiente de la translocación de proteínas al núcleo de la célula hospedera para cumplir funciones como la inserción del genoma viral y la transcripción del mismo. Por otra parte, también se han descrito proteínas virales capaces despojar y tomar el control de la maquinaria de la síntesis proteica a modo de asegurar dicho evento a favor de la replicación del virus (Frieman et al., 2007; Nieto et al., 1994; Timani et al., 2005; Wulan et al., 2015).
El tráfico núcleo-citoplasmático de proteínas es mediado principalmente por heterodímeros conformados por importinas α y β1. La importina α la que posee un sitio activo (sitio mayor de unión) que interacciona con secuencias SLN (Secuencia de Localización Nuclear) presentes en las proteínas que deben ser transportadas al interior del núcleo de la célula (Chook & Blobel, 2001; Mosammaparast & Pemberton, 2004). Varios virus, como el de la Influenza A, DENV y SARS-CoV, emplean esta vía de transporte para translocar sus proteínas al interior del núcleo de la célula hospedera y de esta manera cumplir funciones como (Melén et al., 2003; Tay et al., 2013; Timani et al., 2005). Debido a la importancia del proceso para el éxito replicativo de varios virus de importancia médica, la importina α es empleado para la búsqueda de moléculas tanto de origen natural como de origen sintético, que puedan interaccionar con los sitios activos de dichas proteínas con la finalidad de interferir con la formación de los complejos importina α-proteína viral y de esta manera inhibir el transporte de la proteína viral al interior del núcleo celular (Caly et al., 2020; Janković, 2020; Yang et al., 2020).
El objetivo principal de este estudio fue determinar y caracterizar mediante análisis computacionales los sitios de interacción de la Agatisflavona, Amentoflavona y Punicalina en las importinas α1 humanas mediante estudios de acoplamientos moleculares y simulaciones de dinámica molecular a fin de conocer el potencial inhibitorio de estas moléculas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Pruebas de acoplamiento molecular
Las estructuras químicas en formato bidimensional de las Agatisflavona, Amentoflavona y Punicalina fueron obtenidas de la base de datos PubChem (Kim et al., 2016) (Tabla 1). La estructura molecular de la proteína humana Importina α1 (PDB: 4WV6) fue obtenida de la base de datos Protein Data Bank RCSB (Trowitzsch et al., 2015). Se utilizó como testigo negativo del estudio a la molécula de Aspirina, ya que es conocido que el mismo no posee como blanco de interacción a la importina α1 (Vane & Botting, 2003).
Tabla 1: Energía libre de unión de los complejos resultantes de los acoplamientos.
| Moléculas | PubChem CID | Complejo Ligando-Proteína | Dominio proteico de interacción† | ΔG b (kcal.mol-1) |
|---|---|---|---|---|
| Aspirina* | 2244 | Aspirina-Imp.α1 | ARM 8-ARM 9 | -5,2 |
| Agatisflavona | 5281599 | Agatisflavona-Imp.α1 | ARM 2-ARM 5 | -8,8 |
| Amentoflavona | 5281600 | Amentoflavona-Imp.α1 | ARM 2-ARM 5 | -9,1 |
| Punicalina | 5388496 | Punicalina-Imp.α1 | ARM 2-ARM 5 | -8,8 |
*Testigo; Imp.α1: importina α1. †Dominio de la importina α1.
Para llevar a cabo las pruebas de acoplamiento molecular primeramente fueron proporcionadas a todas las estructuras cargas parciales considerando a todos los átomos presentes en las mismas. Estas pruebas se realizaron entre los ligandos (Agatisflavona, Amentoflavona y Punicalina) y la proteína Importina α1, para ello se emplearon cuadrículas de acoplamiento con dimensiones de 47x77x81 Å3 utilizando el programa AutoDock Vina v.1 (Trott & Olson, 2010).
Los modelos de acoplamiento resultantes que presentaron valores de energía libre de interacción menores a -8,00 kcal.mol-1 fueron seleccionados como complejos de interacciones favorables. La visualización y análisis de estos modelos se realizaron empleando el programa Discovery Studio Visualizer v. 20 (Dassault Systèmes, Vélizy-Villacoublay, Francia).
Simulaciones de dinámica molecular
Las simulaciones de dinámica molecular se realizaron por triplicados a modo de reducir los artefactos generados mientras se logra la estabilidad de los sistemas simulados esto es fundamental para verificar la estabilidad y el rendimiento energético de los ligandos en unión a la importina α1 (Alazmi & Motwalli, 2021), para ello se emplearon los programas NAnoscale Molecular Dynamics NAMD 2.14 (Phillips et al., 2005) y Visual Molecular Dynamics VMD 1.9.3 (Humphrey et al., 1996). Se utilizó el campo de fuerza CHARMM36 (Vanommeslaeghe et al., 2010) tanto para ligandos (Agatisflavona, Amentoflavona y Punicalina) como para la importina α1. Los datos topológicos de los ligandos fueron realizados empleando CHARMM-GUI (Brooks et al., 2009; Jo et al., 2008; Seonghoon Kim et al., 2017; Lee et al., 2016).
Los complejos fueron solvatados con moléculas de H2O TIP3P en una cuadrícula cúbica con una distancia de entre 2-100 nm entre los complejos y borde del cubo de solvatación (Jorgensen et al., 1983). Se añadieron iones sodio (Na+) y cloruro (Cl-) al sistema para neutralizar cargas (Liang et al., 2020).
Las simulaciones se realizaron por un tiempo de 200 ps con intervalos de tiempo (time-steps) de 2 fs. Estas fueron isotérmicas e isobáricas a temperatura de 310 K, la presión de 1,02 bar y periodo de oscilación de 150 fs, con generaciones aleatorias de velocidades acorde a la distribución de Maxwell (Mohamed, 2011). Como constante dieléctrica del solvente se empleó el valor de 1.
Análisis estadístico
Se verificó la estabilidad de las interacciones en el tiempo simulado estimando los valores de RMSD (raíz de la desviación cuadrática media) de cada complejo. También se determinaron los valores de RMSF (raíz de la fluctuación cuadrática media) y ΔRMSF (variación de la raíz de la fluctuación cuadrática media) de cada uno de los residuos de la Importina α1 en los complejos formados en el transcurso de tiempo simulado, para ello se empleó el programa Visual Molecular Dynamics VMD 1.9.3 (Humphrey et al., 1996).
Los valores de energía libre de Gibbs de unión (ΔG b ) de cada complejo fueron determinados mediante el método de LIE (Energía de Interacción Lineal) empleando los parámetros α=0,18, β=0,5, γ=0 (Åqvist et al., 1994; Hansson et al., 1998) utilizando el programa CaFE (Liu & Hou, 2016).
Los valores de ΔG b fueron analizados mediante el test de ANDEVA y el test post-hoc de Tukey (95% nivel de significancia), para ello se empleó el programa Past v. 4.03 (Hammer et al., 2001). Las representaciones gráficas se realizaron con el programa MS Excel 2016 (Microsoft Windows, EEUU).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las pruebas de acoplamiento molecular revelaron valores de energía libre de unión (ΔG b ) favorables para las interacciones registradas con los ligandos analizados. La interacción con la Agatisflavona demostró una ΔG b =-8,8 kcal.mol-1, la Amentoflavona ΔG b =-9,1 kcal.mol-1 y la Punicalina ΔG b =-8,8 kcal.mol-1. La Aspirina registró una ΔG b igual a -5,2 kcal.mol-1 en unión con la importina α1, sin embargo, las interacciones fueron con residuos de los dominios ARM8-ARM9, dominios no implicados en el reconocimiento e interacción con las secuencias SLN de las proteínas (Chook & Blobel, 2001; Pumroy & Cingolani, 2015) (Tabla 1).
En la Figura 1 se puede observar los complejos formados en las pruebas de acoplamiento molecular en representaciones bidimensionales, donde se pueden identificar los residuos activos involucrados directamente en la formación de los complejos y los residuos que se encuentran presentes en los bolsillos de interacción.
Figura 1: Representación bidimensional de las interacciones y residuos activos implicados en la formación de los complejos con las Importinas α1. A. Agatisflavona. B. Amentoflavona. C. Punicalina.
Los residuos activos involucrados en la formación del complejo Agatisflavona-Importina α1 fueron W231, D192 y D270. En el complejo se pudo registrar la formación de puentes de hidrógeno convencionales entre la Agatisflavona y el residuo D192, interacciones no convencionales de enlaces de hidrógeno entre el residuo W231 y el núcleo aromático de la molécula Agatisflavona, interacciones hidrofóbicas mediadas por orbitales Pi (π) de la cadena lateral del residuo W231 y la Agatisflavona. También se pudo registrar la formación de interacciones electrostáticas con el residuo D270 (Figura 1.A).
Los residuos activos involucrados en la formación del complejo Amentoflavona-Importina α1 fueron W231, W184, N235, D270, W273 y E266. Las interacciones registradas en el complejo fue la formación de puentes de hidrógenos entre la Amentoflavona y los residuos W184, N235, W273 y E266, interacciones electrostáticas con el residuo D270 e interacciones hidrofóbicas mediadas por orbitales Pi (π) de los grupos aromáticos de la Amentoflavona y del residuo W231 (Figura 1.B).
Los residuos activos presentes en el complejo Punicalina-Importina α1 fueron N188, A148, N235, W231 y D270. Las fuerzas intermoleculares registradas en el complejo fueron la formación de puentes de hidrógeno con los residuos N188, A148 y N235, interacciones no convencionales de puentes de hidrógeno mediada por orbitales Pi (π) de la Punicalina y el hidrógeno del residuo W231. También se registraron interacciones electrostáticas con el residuo D270, e interacciones hidrofóbicas con el residuo W231 (Figura 1.C).
Las regiones de acoplamiento registradas fueron específicamente entre los dominios armadillo ARM 2-ARM 5, correspondiente al sitio mayor de reconocimiento e interacción con las secuencias SLN presentes en todas las proteínas que deben ser transportadas al interior del núcleo celular (Chook & Blobel, 2001; Mosammaparast & Pemberton, 2004; Pumroy & Cingolani, 2015). Es importante resaltar que los residuos triptófano (W) y asparagina (N), registradas como residuos activos en los complejos, son aminoácidos con funciones claves en el sitio mayor de unión de la importina α1, ya que participa activamente en el reconocimiento de las secuencias SLN de las proteínas que serán transportadas al núcleo (Chook & Blobel, 2001).
En la Figura 2 se demuestran los resultados obtenidos en las simulaciones de dinámica molecular de los complejos que fueron obtenidos en las pruebas de acoplamiento molecular y la importina α1 en su conformación de apoproteína.
Figura 2: A. Raíz de la desviación cuadrática media (RMSD) de los complejos. B. Raíz de la fluctuación cuadrática media (RMSF) de los complejos formados. C. Variación de la raíz de la fluctuación cuadrática media (ΔRMSF) de los complejos. D. Energía libre de Gibbs de unión (ΔG b ) de complejos en las simulaciones.
Los valores de RMSD describen específicamente la estabilidad de los complejos formados en el tiempo en el que dura la simulación realizada (Liang et al., 2020). El análisis de los valores de RMSD reveló en el caso de la apoproteína (proteína nativa, sin ligandos) un valor promedio de 0,947 Å. El complejo Agatisflavona-Importina α1 demostró una estabilidad en los primeros 160 ps, los 40 ps posteriores evidenció un ligero aumento en los valores de RMSD, con un valor promedio fue de 1,038 Å.
El complejo Amentoflavona-Importina α1 registró un promedio de RMSD de 1,157 Å, se observó una inestabilidad inicial los primeros 100 ps y posteriormente los valores de RMSD demostraron una reducción. Esto nos indica que el complejo podría haber alcanzado cierta estabilidad por los reordenamientos estructurales generados en la simulaciones (Liang et al., 2020) (Figura 2.A).
El complejo formado entre la molécula de Punicalina y la Importina α1 presentó una constante inestabilidad, valores de RMSD que iban en aumento durante el tiempo simulado, con un promedio de 1,264 Å. Este valor de RMSD registrado nos sugiere que la interacción simulada presenta cierta inestabilidad en el tiempo simulado y que los reordenamientos estructurales no fueron suficientes para alcanzar la estabilidad. De igual manera, la simulación con la Aspirina reveló que el complejo presenta inestabilidad los primeros 120 ps, posterior a este tiempo los valores de RMSD se reduce hasta ser semejante a los obtenidos en la apoproteína, el valor promedio registrado fue de 1,085 Å (Figura 2.A).
Los valores de RMSF en los complejos proteína-ligando describen la flexibilidad de la proteína con respecto a su posición promedio durante el tiempo simulado, así también los valores de ΔRMSF, nos ofrece la misma información con la sustracción de los valores RMSF de la importina α1 en su estado nativo (Liang et al., 2020; Shahraki et al., 2018).
Los valores de RMSF del complejo Agatisflavona-Importina α1 revelaron una mayor fluctuación en el residuo P282, la misma información fue obtenida en los valores calculados de ΔRMSF, es importante destacar que este residuo se encuentra localizado específicamente en el sitio de acoplamiento de la Agatisflavona. El complejo conformado por la Amentoflavona y la importina α1 presentó una mayor fluctuación en los residuos S88, D132 y T151, de igual modo la ΔRMSF evidenció como residuos con mayores valores de RMSF al D132, T151 y G469 (Figura 2.B,C).
El complejo Punicalina-Importina α1 presentó un mayor número de residuos con altos valores de RMSF, estos fueron la G193, S219, N241, D263, S305, P347, K432, G455 y S497. Sin embargo, los valores de ΔRMSF evidenciaron mayores fluctuaciones específicamente en los residuos G193, S219, E206, P347 y K432, lo cual nos indica una mayor flexibilidad de estos residuos (Shahraki et al., 2018).
Los complejos Agatisflavona-Importina α1 y Amentoflavona-Importina α1 revelaron valores de energía libre de Gibbs de unión (ΔG b ) de -18,60 ± 0,35 kcal.mol-1 y -22,55 ± 2,41 kcal.mol-1 respectivamente, estos valores reflejan que la unión entre estos ligandos y el sitio mayor de reconocimiento de las importina α1 fueron favorables durante el tiempo simulado (Brandsdal et al., 2003; Liang et al., 2020).
Estos valores energéticos fueron significativamente favorables (P<0,001) en comparación con los obtenidos en las simulaciones de los complejos Punicalina-Importina α1 y Aspirina-Importina α1 los cuales fueron de -5,33 ± 1,72 kcal.mol-1 y -5,62 ± 0,09 kcal.mol-1 respectivamente, es importante destacar que entre estas últimas no se registraron diferencias estadísticas (Figura 2.D).
En el complejo Agatisflavona-Importina α1 se revelaron contribuciones energéticas promedios de -65,08 ± 4,66 kcal.mol-1 y de -82,90 ± 9,43 kcal.mol-1 por energías provenientes de interacciones de van der Waals y de interacciones electrostáticas respectivamente (Tabla 2).
Tabla 2: Contribuciones energéticas registradas en los complejos.
* Media ± desviación estándar (kcal.mol-1); Imp. α1: Importina α1.
A su vez, en el complejo Amentoflavona-Importina α1 se registraron aportes promedios de energía de van der Waals de -57,36 ± 4,76 kcal.mol-1 y de energía electrostática de -96,66 ± 10,42 kcal.mol-1.
Sin embargo, el complejo Punicalina-Importina α1 evidenció contribuciones de energía de van der Waals en promedio de -55,57 ± 5,94 kcal.mol-1 y de energía electrostática de -145,49 ± 22,31 kcal.mol-1.
Numerosos estudios han descrito que los biflavonoides Agatisflavona y Amentoflavona, y el tanino hidrosoluble Punicalina, presentan actividades antivirales, principalmente por la capacidad que poseen estas moléculas de unirse a proteínas inhibiendo sus funciones debido a que interaccionan con los residuos presentes en los sitios activos (Bais & Abrol, 2015; Islam et al., 2019; Lin et al., 1999; Yu et al., 2017). De Freitas et al. (2020), describen que la molécula Agatisflavona posee la capacidad de inhibir a la proteína Neuraminidasa del virus de la Influenza, inclusive registraron que es capaz de inhibir variantes mutantes de la Neuraminidasa. También de Sousa et al. (2015), en sus estudios detallan que la Agatisflavona presenta actividades inhibitorias de la proteasa NS2B-NS3 del virus del Dengue de los serotipos 2 y 3 (DENV 2 y DENV 3), esto por la probable unión a sitios alostéricos.
Ryu et al. (2010), describen que la Amentoflavona presenta actividad inhibitoria de la proteína 3CLPro del virus SARS-CoV. También Coulerie et al. (2012), y Coulerie et al. (2013), describen que la Amentoflavona fue capaz de presentar actividades inhibitorias de la enzima RNA polimerasa dependiente de RNA (NS5 RdRp) del virus del Dengue serotipo 2, afectando así a la replicación viral. Wilsky et al. (2012), describen que la Amentoflavona presenta una inhibición de la enzima sintetasa de ácidos grasos (FAS) durante el proceso infectivo del virus Coxsackievirus B3 (CVB3), lo que desencadena en una reducción del ciclo replicativo viral.
Lin et al. (1997), en un estudio realizado con varias estructuras de moléculas entre las que se encontraban la Amentoflavona y la Agatisflavona, evidenciaron que ambas presentaban actividades antivirales apreciables contra el VIH-1, mediante acciones moderadas contra la enzima transcriptasa reversa con una IC50 igual a 119 μM. Li et al. (2019), empleando la Amentoflavona registraron actividades antivirales contra el HSV-1 (Herpes Simplex virus 1) así como contra cepas resistentes al aciclovir del HSV, demostraron que este biflavonoide afecta a la reorganización de la actina, los autores sugieren también que el posible mecanismo de acción de la Amentoflavona es la interrupción temprana de eventos cruciales durante la infección viral, como el proceso de translocación nuclear de proteínas virales.
Los antecedentes mencionados demuestran que estas moléculas son capaces de interactuar con proteínas virales, así como también con proteínas de la misma célula hospedera (Li et al., 2019). En este estudio, se logró demostrar que la Agatisflavona y la Amentoflavona presentan interacciones in silico favorables con la importina α1, lo cual se refleja no solo en los valores de energía libre de Gibbs calculada sino también en la estabilidad determinada computacionalmente en los complejos mediante las simulaciones de dinámica molecular.
Los ligandos han registrado interacciones in silico con el sitio mayor de unión de las importinas α (dominios ARM 2-ARM 5), región de suma importancia ya que es la responsable del reconocimiento de las secuencias SLN presentes en las proteínas que deben ser transportadas al núcleo para cumplir sus funciones (Chook & Blobel, 2001; Mosammaparast & Pemberton, 2004; Pumroy & Cingolani, 2015).
CONCLUSIONES
Los resultados hallados en este estudio computacional demuestran que los biflavonoides Agatisflavona y Amentoflavona interaccionan in silico de forma significativamente favorable con el sitio mayor de reconocimiento de las importinas α1 formando complejos relativamente estables entre sí, esto en comparación a lo registrado con el tanino Punicalina. Se recomienda llevar a cabo pruebas in vitro como el ensayo de desplazamiento térmico celular a modo de confirmar las interacciones detectadas en este estudio in silico, también se sugiere seguir estudiando a fondo a estos biflavonoides (Agatisflavona y Amentoflavona) como potenciales inhibidores del tráfico núcleo-citoplasmático de proteínas virales.
