Aislamiento e identificación de morfotipos fúngicos

Se tomaron muestras de suelo de cultivos de plátano convencionales, ubicados en los municipios de Jardín (Finca El Silencio: Altitud 1870+/-13m, N °5°35.118' - W 75°48.036', Datum: WGS84) y Andes (Finca La Camélida: Altitud 1225,7 +/- 11m, N 05°41.900' - W 75°54.390', Datum: WGS84), que no hayan sido sometidos recientemente a algún tipo de control para nematodos. Las muestras fueron transportadas al laboratorio de Biocontrol y Microbiología Ambiental (BIOMA) de la Universidad de Antioquia, donde fueron procesadas bajo la metodología de ^{Barron (1977)}, la cual consiste cajas Petri con agar-agua al 2%, donde se esparce 1 gramo de suelo y se añade un cebo de nematodos. Los hongos aislados se conservaron en el medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) y fueron utilizadas claves morfológicas de ^{Seifert y Gams (2011)} para la identificación de los diferentes morfotipos obtenidos. Se trabajó con 10 aislados provenientes del mismo sitio (Finca El Silencio).

Características metabólicas

Se realizó una evaluación cualitativa con la metodología de halos de degradación en medio sólido (^{Hankin y Anagnostakis, 1975}) con el objetivo de observar si los aislados producen producir enzimas extracelulares, determinando la capacidad quitinolítica, proteolítica o lipolítica, mediante la degradación de diferentes sustratos. En todos los medios se utilizó un medio base, el cual consistió de agar-agar (1%), NaCl (0,3 g*L^-1), MgSO₄*7H₂O (0,3 g*L^-1), K₂HPO₄ (0,3 g*L^-1).

Capacidad quitinolítica: Se determinó la capacidad de degradar quitina mediante el método de ^{Esteves et al. (2009)}, con modificaciones. El cual consistió en medio base adicionado de quitina coloidal (0,5%) (en base a la metodología de ^{Castro et al. (2011)}, y se ajustó el pH a 7,0 con NaOH 1N.

Capacidad proteolítica: Para observar esta capacidad, se determinó por un lado la degradación de caseína mediante un medio comercial Agar Glucosa-Peptona de caseína® (Merck), el cual posee un indicador de pH (púrpura de bromocresol). También se utilizó un medio con gelatina, con la metodología propuesta por ^{Olivares (1999)} con modificaciones, y el medio consistió en un medio base y gelatina (1%).

Capacidad lipolítica: Para determinar esta capacidad, se utilizó la metodología propuesta por ^{Olivares (1999)} con modificaciones, preparando dos medios que consistían en medio base, gelatina (0,1%), CaCl₂*2H₂O (0,2 g* L^-1), y Tween 20 (1%) o Tween 80 (1%). El sustrato y el medio fueron esterilizados aparte y mezclados al momento de servir.

Cada capacidad metabólica fue evaluada tres veces, con tres repeticiones en cada montaje, los diez aislados se sembraron en los diferentes medios de cultivo e incubaron durante 8 días a 25±2°C bajo condiciones de oscuridad. La presencia de halos alrededor de la colonia se consideró como resultado positivo de la degradación del sustrato. Además, se clarificó el halo mediante la adición de ácido tricloroacético al 35% (TCA) (^{Medina y Baresi, 2007}), y en el medio de quitina también se utilizó Lugol de Gram (^{Verma y Garg, 2018}); debido al hecho de que en algunos medios no era posible observar los halos de forma clara. Por su parte, en los medios de Tween, se analizó la presencia de cristales precipitados en el medio.

Cultivo de nematodos de los géneros Radopholus y Meloidogyne

Los nematodos del género Meloidogyne fueron aislados de plantas de banano de un predio ubicado en la vereda La Casiana del municipio de Jardín (Antioquia), mediante la metodología de ^{Ortiz-Paz et al. (2015)}, multiplicados en plantas de tomate (Solanum lycopersicum variedad Santa Clara) de 20 días a partir de la germinación y sembradas en un sustrato esterilizado con Basamid a 50 g*m², con riego día por medio; se verificó la ausencia de nematodos después de la aplicación del Basamid. Las plantas se cosecharon a los 45 días de crecimiento y el procedimiento se repitió para obtener huevos de nematodos y juveniles (J₂) de Meloidogyne sp., en este caso se esterilizaron en una solución de cloranfenicol y sulfato de estreptomicina a 100 ppm durante 5 minutos, y se lavaron tres veces con agua destilada estéril. Por último, se realizó el conteo y se ajustó la concentración a 150 nematodos en 100 microlitros (^{Castillo-Russi et al., 2010}).

En el caso del género Radopholus, los nematodos se aislaron de raíces de plátano provenientes de una finca ubicada en la vereda San Bartolo en el municipio de Andes (Antioquia), mediante la metodología de ^{Jenkins (1964)}, y se multiplicaron en plantas de banano con un mes de establecimiento en suelo esterilizado con Basamid, se regaron día por medio; se verificó la ausencia de nematodos después de la aplicación del Basamid. Después de 4 meses de incubación, se cosecharon las plantas, y se extrajeron los nematodos, esterilizando con una solución de cloranfenicol y sulfato de estreptomicina a 100 ppm durante 5 minutos, y lavados con agua destilada estéril (tres veces). Finalmente, los nematodos se contaron y se ajustó su concentración a 150 nematodos en 100 microlitros (^{Vergara-Alzate et al., 2012}). Los nematodos se identificaron mediante la clave de ^{Mai y Mullin (1996)}.

Inóculo y filtrado fúngico

Se prepararon suspensiones de conidias a una concentración de 10⁶*L^-1 para el inóculo fúngico utilizando la metodología de ^{Aminuzzaman et al. (2013)}. el cual consiste en recuperar conidias de cultivos de ocho días de crecimiento en agua destilada estéril. Este procedimiento se realizó para los 10 aislados. En el caso del filtrado fúngico se utilizó la metodología de ^{Singh y Mathur (2010)}. Este procedimiento se realizó para 9 aislados, debido a que no fue posible filtrar el contenido del aislado Lec28. Se trabajó entonces con 10 suspensiones de conidias y 9 filtrados.

Potencial nematicida

La caracterización de los aislados requirió de un primer ensayo cualitativo, con el fin de determinar su capacidad de infectar o colonizar estadios de Meloidogyne sp. Se realizó la metodología de ^{Castillo et al. (2010)}, utilizando cajas de Petri de 6 cm de diámetro, en las que se añadió 900 microlitros (µL) de agua destilada estéril más 100 microlitros de la suspensión de conidias a una concentración de 10⁶*L^-1, y se añadieron por separado 10 huevos o 10 individuos del estadio J₂ del género Meloidogyne. Los montajes se incubaron durante 24 horas a 25±2°C en oscuridad. Pasado este tiempo, mediante el microscopio compuesto (Marca Carl Zeiss, modelo Axiostar), se determinó la capacidad de infectar o colonizar huevos o juveniles de este género de cada uno de los aislados mediante el crecimiento del micelio fuera y dentro del blanco. Este experimento se realizó una sola vez y se tuvo en cuenta un tratamiento control con huevos o nematodos en agua destilada estéril con Tween 20.

Para la evaluación cuantitativa, con el fin de establecer la capacidad de control de los hongos o su filtrado, se utilizó un montaje en platos de 24 pozos. En cada pozo se añadió 1 mL del filtrado o de la suspensión de conidias a la concentración 10⁶*L^-1 y 100 µL de la suspensión de nematodos con 150 nematodos; como controles se utilizó PDB estéril o agua destilada estéril con Tween 20 al 0.1%, respectivamente y para cada género de nematodo. Los montajes se incubaron a 25±2°C en oscuridad durante 72 h (^{Aminuzzaman et al., 2018}). Posteriormente, se realizó la lectura del experimento en un microscopio invertido Zeiss, y se confirmó la viabilidad de nematodos añadiendo 100 µL de NaOH 1N en cada pozo (^{Xiang y Lawrence, 2016}). Se realizó el conteo de 100 nematodos, determinando si estaban vivos (aquellos que presentaban movilidad) o muertos (si no presentaban movilidad), con o sin presencia de micelio colonizando los tejidos.

Los platos multipozo fueron separados por género de nematodo (Meloidogyne o Radopholus) y en cada plato se analizaron dos réplicas de cada hongo y del control distribuidos completamente al azar (dejando dos pozos con agua destilada estéril), teniendo 11 tratamientos en el caso de los hongos y 10 para los filtrados; este procedimiento se repitió tres veces, y en cada ocasión se realizaban tres montajes para cada género nematodo.

Análisis estadístico

Para analizar el efecto de los hongos aislados o su filtrado sobre la mortalidad de los nematodos, se separaron los tratamientos en cuatro grupos. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía (α=0.05) en cada grupo. Para observar cuál tratamiento mostró diferencias estadísticamente significativas respecto al control y al resto de los tratamientos dentro de cada grupo, se realizó una prueba Tukey (α=0.05). Los grupos fueron: Hongo vs Meloidogyne (HvsM), Hongo vs Radopholus (HvsR), Filtrado vs Meloidogyne (FvsM) y Filtrado vs Radopholus (FvsR). Los análisis se realizaron con el apoyo del software R-Studio.

Aislado e identificación de morfotipos fúngicos

Se obtuvieron trescientos aislados de las 2 muestras de suelo, de los cuales se descartaron aquellos morfotipos que se presentan como contaminantes, habitantes comunes del suelo o de poco interés comercial, así como los morfotipos de géneros como Trichoderma o Gliocladium, lo cual también ha sido reportado por ^{Eapen et al., (2005)}, reportando que algunos de estos hongos pueden cumplir funciones de descomposición, más que de biocontrol ante un estadio de algún nematodo. Por tal motivo, se seleccionaron 10 morfotipos de géneros reportados previamente como nematófagos, Pochonia (Poc01), Lecanicillium (Lec28), Arthrobotrys (Art40), Metarhizium (Met79) y Paecilomyces (Pae07, Pae22, Pae26, Pae48, Pae67, Pae70), donde, Lec28 y Art40 provenían de la Finca La Camélida, y el resto de la Finca El Silencio.

Caracterización metabólica

Los resultados de la actividad metabólica (tabla 1) permitieron establecer que el 90% de los aislados eran capaces de degradar Tween 80, seguido de un 80% para caseína y gelatina, 60% con Tween 20 y en menor medida en un 40% con quitina; además, un 30% de los aislados presentaron formación de cristales en ambos medios de Tween.

Se observó que los aislados Poc01, Pae07 y Pae48 presentaron degradación de los cinco compuestos evaluados en medios sólidos. Pae22 que degradó cuatro compuestos. Pae26, Lec28, Pae67, Pae79 y Met79 degradaron tres compuestos y Art40 solo degradó uno de los compuestos evaluados. Esta metodología permite determinar si un microorganismo presenta o no una enzima específica (^{Hankin y Anagnostakis, 1975}), además, algunos autores han reportado que, la producción de enzimas in vitro está fuertemente correlacionado con el proceso de infección o colonización de huevos o nematodos por parte de un aislado (^{Esteves et al., 2009}; ^{Wei et al., 2009}; ^{Ng’ang’a et al., 2011}). A continuación, se describen los resultados de las diferentes capacidades metabólicas evaluadas.

La capacidad quitinolítica se presentó en cuatro aislados que presentaron halos en las placas de Petri con quitina, los cuales correspondieron a géneros previamente reportados con dicha capacidad metabólica, como Pochonia (^{Esteves et al., 2009}) y Paecilomyces (^{Binh et al., 2019}). En la mayoría de los aislados fue posible observar halos sin la adición de TCA o Lugol de Gram, aunque se encontró que ambos compuestos ayudaban a visualizar el halo (figura 1). La formación de halos de degradación en medios con quitina sugiere que el aislado en la placa es capaz de hidrolizar la quitina a compuestos más simples mediante la expresión de enzimas quitinasas (^{Wei et al., 2009}). Y la presencia de quitinasas en hongos nematófagos es importante debido a que, la quitina es uno de los principales constituyentes de la cutícula de nematodos y de la cubierta de huevos de estos (^{Bird, 1968}).

Figura 1 Halos de degradación de quitina en medio sólido por los aislados Poc01 (superior) y Met79 (inferior), revelados con TCA (izquierda) y Lugol de Gram (derecha). 

Se encontró que el halo de degradación para determinar la capacidad lipolítica fue visible después de la adicción de TCA, lo cual se dio en la mayoría de los aislados, lo cual se ha reportado previamente en géneros como en Pochonia y Lecanicillium (^{Olivares, 1999}) o Paecilomyces (^{Ali y Moharram, 2014}). Se ha reportado que la degradación de los ácidos grasos genera precipitados de sales de calcio, como cristales visibles alrededor del sitio de inoculación, lo que se evidenció en los aislados Lec28, Poc01 y Pae22 (figura 2) (^{Hankin y Anagnostakis, 1975}; ^{Kumar et al., 2012}).

Figura 2 Precipitado en medio con Tween 20 del aislado Lec28 y cristales observados en microscopio invertido (40X). 

Para la capacidad proteolítica evaluada en los medios con gelatina (figura 3), no fue posible observar halos de degradación sin el TCA. En cuanto al medio de caseína, el viraje del color del medio se presentó en aquellos hongos que podían degradar la caseína. Además, la capacidad proteolítica es de gran interés, debido a que la cutícula de los nematodos y la cubierta de sus huevos está compuesta en su mayoría por proteínas (principalmente colágeno) (^{Binh et al., 2019}), la capacidad proteolítica es de interés. Incluso, se ha sugerido que varias proteasas extracelulares están implicadas en la parálisis y la mortalidad de diferentes nemátodos, siendo estos compuestos el principal componente activo de los filtrados fúngicos (^{Ng’ang’a et al., 2011}). Se ha reportado esta actividad en géneros como Pochonia, Paecilomyces y Lecanicillium (^{Olivares, 1999}), aunque, esta es una característica que depende del aislado, como lo reportaron ^{Mustafa y Kaur (2009)}, quienes encontraron aislados de Metarhizium anisopliae que podían degradar gelatina o caseína, ambos, uno o ninguno de estos.

Figura 3 Aislado Pae48 en medio de cultivo con gelatina, antes de la aplicación del TCA (izquierda) y después de la aplicación del TCA (centro) resultado positivo, y resultado negativo en el aislado Met79 después de la aplicación del TCA (izquierda). 

Al evaluar el potencial nematicida, se encontró que a las 24 horas el 70% de los 10 aislados podían infectar o colonizar huevos de Meloidogyne sp., representados en los aislados Paecilomyces (Pae07, Pae22, Pae48, Pae67), Pochonia (Poc01), Lecanicillium (Lec28) y Metarhizium (Met79), mientras que, el 30% restante podían infectar o colonizar J₂, representados en los géneros Paecilomyces (Pae26, Pae70) y Arthrobotrys (Art40). Es necesario evaluar la capacidad de control de un organismo frente a un blanco determinado para conocer y utilizar su potencial de manera eficiente. Por ejemplo, en el estudio de ^{Eapen et al. (2005)}, encontraron que, de 110 aislados, 69 podían parasitar hembras de Meloidogyne spp., y solo tres aislados de los géneros Paecilomyces, Trichoderma y Verticillium presentaron porcentaje de mortalidad significativo. También, de 149 aislados, ninguno afectó J₂ de Meloidogyne spp. y 115 fueron capaces de colonizar la matriz gelatinosa de las masas de huevos, pero sólo 30 de éstos últimos podían colonizar e infectar huevos.

Conforme a la mortalidad de los hongos y su filtrado, en la figura 4 se presenta mediante diagramas de cajas el porcentaje de mortalidad de los nematodos por parte los hongos (H vs N) y sus filtrados (F vs N) frente a los nematodos de los géneros Meloidogyne y Radopholus.

Figura 4 Porcentaje de mortalidad ocasionada por los hongos y filtrados en los géneros Meloidogyne y Radopholus. 

De acuerdo con el análisis de ANOVA, se encontró que para cada uno de los grupos existe al menos un tratamiento cuya media es diferente a la media del tratamiento control (p<0.01). Por su parte, la prueba de comparaciones de medias Tukey mostró que cada tratamiento en cada grupo tenía diferencias estadísticamente significativas frente al control, por lo que, se analizaron las diferencias estadísticamente significativas entre pares de combinaciones de los diferentes grupos (p<0.05), con el fin de hallar los tratamientos con mayores porcentajes de mortalidad:

De manera general, en la mayoría de los aislados los porcentajes de mortalidad fueron superiores al 79%. Y los géneros más representativos fueron Pochonia y Paecilomyces, aunque nuestros resultados difieren de otros autores. Como con ^{Ortiz-Paz et al. (2015)}, quienes reportaron que el porcentaje de mortalidad oscilaba alrededor de 50% en juveniles de M. incognica y M. mayaguensis con un aislado de P. chlamydosporia y otro de P. lilacinum, bajo una concentración de 10⁷*L^-1 conidias por mililitro, y un tiempo de evaluación de 168 horas. O lo reportado por ^{Vergara-Alzate et al. (2012)}, quienes encontraron un aislado de P. lilacinum que controló el 62% de los juveniles de R. similis, mientras que P. chlamydosporia controló el 66%de los juveniles de R. similis.

Finalmente, en los filtrados analizados, los porcentajes de mortalidad fueron superiores al 90% frente a Meloidogyne sp. y superiores al 80% frente a Radopholus sp. Puntualmente, algunos autores han reportado porcentajes de mortalidad sobre Radopholus sp. de entre 76,4 y 100% con aislados de Fusarium oxysporum endófitos (^{Athman et al., 2006}), o del 90% con aislados de Trichoderma sp. (^{Cañizares-Monteros 2003}). Mientras que, con Meloidogyne sp. se han reportado porcentajes de mortalidad del 100% con un aislado de P. lilacinus frente a M. graminicola (^{Gapasin et al., 2011}); los anteriores ejemplos son similares a los resultados obtenidos en este trabajo, aunque difieren a lo reportado por ^{Singh y Mathur (2010)}, quienes obtuvieron un porcentaje de mortalidad del 39% con un aislado de P. lilacinus y de 33,8% con uno de P. chlamydosporia frente a M. incognita tras 24 horas de evaluación y 24 horas de más en la confirmación de mortalidad, un total de 48 horas.