¹Centro de Investigaciones Biomédicas, Universidad del Quindío, Armenia, Colombia

²Laboratorio de Salud Pública, Secretaría de Salud de Bogotá, Bogotá, D.C., Colombia

³Laboratorio Salud Pública de Santander, Bucaramanga, Colombia

⁴Universidad del Norte, Barranquilla, Colombia

⁵Hospital Erasmo Meoz, Cúcuta, Colombia

Recibido: 07/01/2011; Aceptado: 08/06/2011

Resumen

Objetivos. Evaluar y determinar el punto de corte para la detección de IgM anti-Toxoplasma por el método ELISA, en muestras de sangre de cordónumbilical, mediante dos ensayos comerciales diferentes, y correlacionar los resultados obtenidos con el diagnóstico de toxoplasmosis congénitarealizado por seguimiento serológico y los datos clínicos.

Métodos. Se evaluó la prueba IgM anti-Toxoplasma ELISA de Vircell®, frente a los resultados por Western blot e IgM ELISA de Labsystems®. Seestudiaron 105 muestras de cordón umbilical de niños colombianos, obtenidas de seis ciudades diferentes por Western blot y seguimiento clínico yserológico en aquellos positivos. Se obtuvo una curva receptor-operador (ROC) para la prueba ELISA IgM anti-Toxoplasma de Vircell® y de Labsystems®. Se analizó la concordancia entre pruebas en 105 sueros obtenidos de cordón umbilical.

Resultados. El mejor desempeño para la prueba Vircell® fue con un punto de corte de índice 8 y la prueba de Labsystems® con un punto de cortede 16 inmunounidades enzimáticas. Frente al Western blot, la prueba Vircell® tuvo una sensibilidad de 100 % (IC 95%; 71,8-100) y una especificidadde 78 % (IC 95%; 69-85,7), la prueba Labsystems® tuvo una sensibilidad de 100 % (IC95%; 71,8-100) y una especificidad de 100 % (IC95%; 96-100). Laconcordancia entre ambas pruebas (Labsystems® y Vircell®) fue de 80 %, con un índice kappa de 0,45.

Conclusiones. Un punto de corte de un índice 8 para la prueba ELISA IgM anti-Toxoplasma de Vircell® y un punto de corte de 16 inmunounidadesenzimáticas por Labsystems®, permiten identificar infecciones congénitas en sangre de cordón umbilical en niños colombianos.

Palabras claves: toxoplasmosis, IgM, tamización, recién nacidos.

Abstract

Objectives: To evaluate and validate the detection of anti-Toxoplasma IgM ELISA in umbilical cord blood by means of two different commercialassays and to correlate the results with the diagnosis of congenital infection in children by serological follow up and clinical data.

Materials and methods: We evaluated the commercial anti-Toxoplasma IgM ELISA kitÔ from Vircell (Granada, Spain) compared to the results of Toxoplasma IgM Western blotÔ (LDbio, Lyon, France) and IgM ELISA testÔ from Labsystems (Finland). We obtained the receptor-operator curve (ROC) for the IgMELISA assay form Vircell and Labsystems. We studied 105 umbilical cord blood serum samples from Colombian children from six different cities by Westernblot, and clinical and serological follow up for positive cases. The kappa agreement index was determined for the 105 sera obtained from umbilical cords.

Results: The Vircell assay showed a better performance with a cut-off index of 8 against a 16 for Labsystems for enzyme immunounits (EUI). Whenthe results were evaluated against the Western blot assay, the Vircell IgM assay had a sensitivity of 100% (IC95%: 71.8-100) and a specificity of 78%(IC95%: 69-85.7), the IgM assay from Labsystems had a sensitivity of 100% (IC95%; 71.8-100) and a specificity of 100% (IC95%; 96-100). Agreement between both tests (Labsystems and Vircell) was 80% and had a kappa index of 0.45.

Conclusions: A cut-off point of 8 for the anti-Toxoplasma IgM ELISA assay from Vircell and 16 EIU for the Labsystems assay allow the identificationof congenital infections in umbilical cord blood samples from Colombian children.

Keywords: Toxoplasmosis, diagnosis, ELISA, Western blot, ROC curve, sensitivity, specificity, newborn, umbilical cord, screening.

Introducción

Toxoplasma gondii es un parásito cosmopolita,intracelular obligado, que puede causar grandescomplicaciones al feto en formación cuando lamujer adquiere una infección durante la gestación⁽¹⁾. La infección aguda en mujeres embarazadas no se evidencia en alrededor de 90 % delos casos⁽¹⁾. En general, los signos y los síntomasde infección aguda pasan desapercibidos parala mayoría de mujeres gestantes, pero las consecuencias pueden ser graves para el feto⁽¹⁾.

Dado que un programa de detección durante elembarazo puede ser muy costoso y no se encuentra legislado en muchos países, se ha planteado que uno de tamización neonatal es unaopción para detectar los casos de toxoplasmosiscongénita⁽²⁾. Entre las ventajas de un programade tamización neonatal se encuentra que:

I. es menos costoso que la tamización prenatal;

II. es posible efectuar tratamiento posnatal conbeneficios, y

III. algunas madres no asisten a control prenatal(10 % de las mujeres gestantes en Colombia) y el parto es la única oportunidad para detectar estos casos.

Esta estrategia se puede hacer en conjunto conla detección de otras enfermedades metabólicas, tales como el hipotiroidismo.

Los métodos estándar para la detección de anticuerpos anti-Toxoplasma pueden detectar losanticuerpos IgM e IgA neosintetizados por elneonato, con la cual se puede llegar a diagnosticar hasta el 90 % de los casos⁽³⁾. En estos programas se ha utilizado la detección de IgM e IgAen muestras de sangre tomadas al nacimientoen papel filtro o en sangre de cordón umbilical. Si se utiliza sólo IgM, se detecta hasta 75 a 80 %de los niños infectados. En Polonia se incluyó ladetección de IgA, lo cual permite detectar algunos casos que no presentan IgM a pesar de tener la infección congénita⁽⁴⁾. En Colombia se hanllevado a cabo dos estudios piloto de tamizaciónneonatal, los cuales encontraron una prevalenciade 1 caso por cada 200 recién nacidos^(5,6).

En la mayoría de los estudios de tamización neonatal se han utilizado técnicas fluorométricaspara la detección de IgM anti-Toxoplasma ⁽⁷⁾ y, una vez aplicadas estas técnicas en programasde tamización, se reportaron 61,5 %⁽⁸⁾ , 78,6 %⁽⁹⁾ y 91 %⁽¹⁰⁾ de falsos positivos. Una alta proporción de resultados falsos positivos es aceptadageneralmente para las pruebas de tamización, especialmente en poblaciones con baja prevalencia de la enfermedad. No existen reportes devalidación de pruebas que determinen el puntode corte que permita detectar el mayor númerode casos con las pruebas basadas en inmunoensayos (pruebas ELISA) para la detección de IgManti-Toxoplasma en cordón umbilical.

Los métodos ELISA han demostrado versatilidady son accesibles a los laboratorios de baja y mediana complejidad, y durante la planificación delestudio nacional sobre toxoplasmosis neonatalse encontró que los laboratorios participantescontaban en su mayoría con equipos para ELISAy no con equipos para fluorometría. La estrategia de usar muestras de cordón umbilical enlugar de muestras recolectadas en papel filtro,fue tomada dado que en un estudio previo enColombia se encontró que, de 322 muestras tomadas en papel filtro, 106 (25 %) fueron insuficientes y se debieron tomar nuevas muestras⁽⁵⁾ .

El presente trabajo tuvo como objetivos los siguientes:

1. Evaluar y determinar la sensibilidad, la especificidad y el punto de corte de mejor desempeñopara la detección de IgM anti-Toxoplasma de laspruebas ELISA de Vircell® y de Labsystems®,para su uso en muestras de cordón umbilical. La prueba de Western blot fue utilizada comoensayo de referencia para definir la presencia oausencia del “analito” (IgM anti-Toxoplasma) enla sangre de cordón umbilical⁽¹²⁾ .

2. Analizar y validar, con seguimiento clínico yserológico, el desempeño de las pruebas conrespecto al desenlace de presencia o ausencia de infección congénita.

La validación con seguimiento clínico y serológico se hizo por dos razones: primero, en la toxoplasmosis congénita la presencia de IgM en elcordón umbilical puede deberse a la transferencia de sangre materna durante el parto⁽³⁾ y, porlo tanto, no siempre indica infección congénita y toda muestra positiva en sangre de cordón umbilical debe confirmarse con una nueva muestratomada el día 10 de vida⁽³⁾ , y, segundo, puedeocurrir que los niños con infección congénita notengan IgM anti-Toxoplasma por agotamiento inutero, sobre todo en infecciones ocurridas durante los primeros trimestres de embarazo ⁽³⁾ .

Materiales y métodos

Definición de sueros verdaderos negativos ysueros verdaderos positivos.

Se recolectaron 105 muestras de suero de cordón umbilical durante el periodo de marzo de2009 a marzo de 2010, en seis ciudades de Colombia, dentro del primer estudio multicéntricocolombiano de toxoplasmosis neonatal.

Se seleccionaron 12 sueros que fueron positivos por la prueba de referencia Western blotIgM anti-Toxoplasma de LDbio® (Lyon, Francia) y, por lo tanto, fueron los verdaderos positivosy 93 muestras consecutivas negativas por estamisma prueba y, por lo tanto, fueron los verdaderos negativos.

Estas últimas pruebas, a su vez, se dividieronen sueros positivos y sueros negativos para IgGanti-Toxoplasma negativo. Sólo las pruebas quefueron negativas para IgM, tanto por Westernblot como por una prueba IgG anti-Toxoplasma,se utilizaron para calcular el punto de corte.

En todas las muestras se buscó IgG anti-Toxoplasma con dos estuches comerciales: Human®(Alemania) y Vircell® (España), siguiendo las recomendaciones de los fabricantes.

Prueba Western blot para IgM anti-Toxoplasma.

Se utilizó la prueba comercial de LDBio® (Lyon,Francia) previamente validada para detección deIgM anti-Toxoplasma en sangre de cordón umbilical⁽¹²⁾. Se utilizaron 25 μl de los sueros diluidos en 1,2 ml de solución diluyente e incubados por 90 minutos en cubetas independientessobre bandas de nitrocelulosa (sobre las cualesse había corrido previamente antígeno total deToxoplasma y que eran suministradas con el estuche). Esta incubación se hizo en un agitadorhorizontal a 10 ciclos por minuto y a 25 °C. Siexisten anticuerpos contra el parásito, se unen alas proteínas y, en un paso subsiguiente, los anticuerpos no unidos son eliminados por lavadostres veces con 2 ml de solución, de las cuales,las últimas dos veces se dejan en agitación porcinco minutos.

Posteriormente, las bandas se incubaron con1,2 ml de un conjugado anti-IgM humana unida a fosfatasa alcalina durante 60 minutos a 18°C, también en agitación a 10 ciclos por minuto. Luego se repitió la misma serie de lavadosy se diluyó de nuevo la banda en 1,2 ml de unsubstrato de nitroazul de tetrazolio con fosfatode 5-bromo-4-cloro-3-indoleil (NBT/BCIP), quedetecta el complejo de unión al precipitar y daruna banda de color violeta.

El revelado se detiene lavando con agua destilada al aparecer la banda. La lectura se hacevisualmente y se considera específica la aparición de cualquier banda por debajo de 120 kDa,excepto por una banda de aspecto tenue de 37kDa, la cual se ha reconocido como un artefactoproducido durante el proceso de fabricación⁽¹²⁾ .

Prueba ELISA para IgM anti-Toxoplasma deVircell (Granada, España)

Es un método basado en el principio de captura. Las placas de poliestireno están recubiertas porun anticuerpo anti-IgM humano. Las inmunoglobulinas no unidas son eliminadas en el proceso de lavado.

La muestra de suero se diluyó a 1/20 en un volumen de 100 μl de diluyente compuesto por unasolución tampón de fosfatos y el estabilizante de proteínas Proclin®) y se incubó una hora a 37 °C. Luego de cinco lavados con solución tampón de fosfatos más Tween 20, se usaron 100 μl de antígeno total de Toxoplasma conjugado con peroxidasa, que reacciona con las IgM capturadas y el que no se une, se elimina en los lavados.

El revelado se hace con 100 μl de substrato tetrametilbenzidina que da coloración azul para cambiar a amarillo tras la adición de la substancia de parada (ácido sulfúrico, 0,5 M). La lectura se hace en un espectrofotómetro a 450 nm y con filtro de referencia de 630 nm. Los resultados se expresan en índice de acuerdo con las densidades ópticas (DO) de los sueros problema y sueros control de punto de corte: DO de la muestra/media de la DO del suero control de punto de corte.

Prueba ELISA para IgM anti-Toxoplasma de Ani-Labsystems (Vantaa, Finlandia)

También es un método basado en el principio de captura. Este estuche fue desarrollado para usarlo con muestras de sangre en papel filtro.

En nuestro trabajo se utilizó una variante, diluyendo las muestras de suero a 1/30 en un volumen de 150 μl del diluyente compuesto de una solución de anticuerpo anti-IgM humano y luego se incubaron 30 minutos en un agitador horizontal para placas a 850 rpm. Luego de cuatro lavados con 400 μl de solución de lavado, se añadieron 150 μl de antígeno total de la cepa Rh de Toxoplasma conjugado con peroxidasa y se incubó una hora a 37 °C en un agitador horizontal a 800 rpm. Se lavó cuatro veces con 400 ml de solución de lavado y se añadieron 150 μl de substrato tetrametilbenzidina. Se incubó 20 minutos en oscuridad sin agitación y se adicionaron 100 μl de la substancia de parada (ácido sulfúrico, 0,45 M).

La lectura se hace en un espectrofotómetro a 450 nm y con filtro de referencia de 630 nm. Los resultados se expresan en inmunounidades enzimáticas con la fórmula basada en los valores de absorbancia (Abs): (Abs muestra- Abs control negativo) / (Abs calibrador- Abs control negativo) x RVC (valor relativo del calibrador).

Definición de casos con infección congénita, incluyendo niños con IgM anti-Toxoplasma y sin ella

La presencia de IgM en el cordón umbilical puede ocurrir por transferencia de sangre materna al momento del parto y, por otro lado, la ausencia de IgM en la sangre del cordón umbilical no permite descartar la infección congénita.

Por estas razones, para validar clínicamente el desempeño de las pruebas, fue importante incluir la definición de presencia o ausencia de infección por seguimiento clínico y serológico posnatal, tanto en los casos positivos por Western blot como en los casos de niños con historia de infección en el embarazo. Esto permite revelar cuántos niños pueden ser detectados por cualquiera de los ensayos.

En estos casos se consideró confirmado el diagnostico de infección congénita por la aparición de una prueba IgM anti-Toxoplasma por dos pruebas comerciales ELISA (Vircell® y Human®) o IgA específica positiva por ISAGA en la muestra de sangre del niño tomada luego del día 10 de vida o por la persistencia de IgG anti-Toxoplasma luego del mes 12 de vida, de acuerdo con los criterios de la red europea de toxoplasmosis congénita ⁽¹³⁾.

La ausencia de infección congénita se estableció por la desaparición de los IgG anti-Toxoplasma en el seguimiento posnatal en ausencia de tratamiento.

Análisis estadístico

Los datos y gráficas se organizaron en Excel® y el análisis estadístico se hizo con el programa  SPSS®, versión 14 (SPSS Inc., Chicago, USA) y Epi Info, versión 3.5.1 (CDC, Atlanta). Se calculó un punto de corte con muestras negativas estimando el promedio del índice o las unidades inmunounidades enzimáticas, según la prueba, más tres desviaciones estándar. Se calculó la sensibilidad y la especificidad de diferentes puntos de corte a través de una curva operadorreceptor (ROC) y se estimó la concordancia entre ambas pruebas ELISA y el índice kappa. La prueba de referencia fue el Western blot para IgM anti-Toxoplasma. Se calcularon los intervalos de confianza a 95 % alrededor de los porcentajes de sensibilidad y especificidad.

Resultados

Establecimiento de un punto de corte con sueros negativos para la infección

Se calculó un punto de corte para cada prueba con 53 sueros que fueron negativos tanto por la prueba Western blot IgM anti-Toxoplasma como por la prueba IgG anti-Toxoplasma en las muestras de cordón umbilical. Para la prueba Vircell®, el punto de corte estimado fue de 8 (figura 1), y para la prueba Labsystems®, fue de 10,3 (figura 2). No se incluyeron 40 muestras negativas por Western blot para IgM, porque tenían presencia de IgG anti-Toxoplasma.

Curva ROC de acuerdo con la sensibilidad y especificidad frente al Western blot

En 105 muestras la curva ROC (figura 3) muestra que un punto de corte de índice 8 para la prueba Vircell® tenía una sensibilidad de 100 % (IC 95% 71,8-100) y la mejor especificidad, con un 78,5 % (IC 95% 69-85,7). La prueba de Labsystems®, con un punto de corte de 16 unidades inmunoenzimáticas, tenía una sensibilidad de 100 % (IC 95% 71,8-100) y una especificidad de 100 % (IC 95% 96- 100). La concordancia entre las pruebas ELISA de Vircell® y de Labsystems® fue de 80 % y, el índice kappa, de 0,45 (IC 95% 0,24-0,67), lo cual muestra una fuerza de asociación moderada.

Resultados del seguimiento clínico y serológico

De los 12 casos con prueba positiva para IgM anti-Toxoplasma por Western blot, se confirmó la infección congénita en ocho niños (66 %) por diversos criterios (tabla 1). Todas las madres de estos niños fueron positivas para IgG anti-Toxoplasma. Entre estos niños con infección congénita confirmada, cuatro fueron sintomáticos y dos de ellos fallecieron antes del primer mes de vida.

Entre los sueros negativos se confirmó un caso de infección congénita no sintomática; la madre recibió tratamiento con espiramicina durante el embarazo y la infección sólo pudo ser diagnosti cada por el criterio de persistencia de los niveles de IgG durante el seguimiento postnatal.

Discusión

Para el presente estudio se utilizó la prueba de Western blot como referencia, la cual ha sido evaluada previamente por nosotros en programas de tamización en sangre de cordón umbilical ⁽⁵⁾ . Las limitaciones para su aplicación en programas de tamización son su costo y la laboriosidad en su realización e interpretación ⁽⁵⁾ .

El punto de corte para las pruebas de toxoplasmosis neonatal en cordón umbilical o sangre de talón sobre papel filtro, se ha determinado anteriormente con muestras negativas de pacientes adultos donantes de sangre ⁽⁷⁾ o por comparación entre el suero materno y el suero del niño ⁽¹⁴⁾ . En nuestro caso el punto de corte se definió con sueros de cordón umbilical que fueron negativos para IgG e IgM anti-Toxoplasma.

Al comparar el punto de corte obtenido con sueros negativos con el determinado por una curva ROC, se encontró que el estimado con sueros negativos de Vircell® era el mismo que en la curva ROC y demostró que permitía la detección del 100 % de los casos con IgM anti-Toxoplasma, aunque con una baja especificidad (78 %).

Con el estuche de Labsystems®, el punto de corte estimado con sueros negativos (10 inmunounidades enzimáticas) se encontraba bien abajo del óptimo, según la curva ROC, y daba una especificidad de 81 %, la cual se volvía de 100 % con el punto de corte a 16 inmunounidades enzimáticas.

Tal vez la manera de calcular las inmunounidades enzimáticas en el estuche de Labsystems® permite intervalos de valores en los resultados mucho más precisos que en el estuche Vircell®. Esto se aprecia con valores muy altos de inmunounidades enzimáticas en niños bastante sintomáticos (por ejemplo, 670 inmunounidades enzimáticas, caso 6) y valores cercanos al punto de corte determinado por ROC en niños sin síntomas (por ejemplo, 17 inmunounidades enzimáticas, caso 5), lo cual es menos evidente con los resultados en el índice de Vircell®.

La concordancia entre ambas pruebas fue moderada, según el índice kappa; esto se debió principalmente a la gran cantidad de falsos positivos en la prueba Vircell®. Por lo tanto, esta prueba debe ser mejorada para disminuir el número de falsos positivos. Esto podría hacerse, por ejemplo, incluyendo sueros calibradores en sus controles que permitan obtener valores más precisos en sus índices. Es necesario anotar que no existe un suero patrón para IgM en toxoplasmosis, como sí ocurre en IgG, por lo cual la estandarización entre pruebas comerciales adolece por ahora de grandes dificultades ⁽¹⁵⁾ .

Es importante resaltar la fortaleza del presente estudio; nuestra serie de casos positivos es representativa del amplio espectro clínico de la infección congénita, que va desde casos graves, con fallecimiento inclusive, a casos asintomáticos e infectados, o madres que tuvieron IgM anti-Toxoplasma pero que no transmitieron la infección.

Esta última situación es bien conocida en el caso de la estrategia de tamización de recién nacidos Figura 3. Curva ROC para las pruebas de IgM anti-Toxoplasma para toxoplasmosis congénita; todos los casos po sitivos en cordón umbilical deben ser confirmados con nueva muestra al día 10, tanto de la madre como del niño. La presencia de IgM anti-Toxoplasma en cordón umbilical puede significar el traspaso de esta inmunoglobulina materna al momento del parto; por esta razón, la confirmación siempre se debe hacer con una muestra posnatal.

En la presente muestra de casos positivos en cordón umbilical, el 24 % de los positivos para IgM positiva anti-Toxoplasma en cordón umbilical se debió a esta situación, y se pudo confirmar la ausencia de infección en estos casos por el resultado negativo para IgG anti-Toxoplasma en el niño, durante el seguimiento.

Las dos pruebas evaluadas permitieron diagnosticar el 100 % de los casos de infección congé- nita que presentaban IgM anti-Toxoplasma en la muestra de cordón umbilical. Sin embargo, es bien conocido que algunos casos de infección congénita pueden no ser diagnosticados con la búsqueda de IgM anti-Toxoplasma y se requiere buscar IgA anti-Toxoplasma o hacer seguimiento posnatal. Uno de estos casos estaba incluido en la muestra estudiada y ninguna prueba fue positiva para IgM anti-Toxoplasma. El niño tuvo el antecedente de tratamiento de la madre en el embarazo y se ha reportado que esto puede reducir la presencia de marcadores diagnósticos al nacimiento ⁽¹⁶⁾.

Conclusiones

Un punto de corte de 8 para la prueba ELISA de Vircell® y de 16 inmunounidades enzimáticas para la prueba de Labsystems®, permite detectar el 100 % de los casos con IgM anti-Toxoplasma en muestras de cordón umbilical de recién nacidos colombianos.

Declaración sobre conflictos de interés

Los autores declaran no conocer ningún tipo de conflicto de interés durante la realización de este trabajo. Los autores no han recibido salarios ni beneficios de parte de las empresas distribuidoras o fabricantes de los estuches utilizados en este estudio.

Financiación:

Correspondencia: Jorge Enrique Gómez Marín, Centro de investigaciones biomédicas, Universidad del Quindío, Avenida Bolívar 12N, Armenia, Colombia, Telefax: (+57 67) 460-168. Dirección electrónica: gepamol2@uniquindío.edu.co

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