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Introducción
Las enfermedades nosocomiales o más recientemente conocidas como infecciones asociadas a hospitales o HAIs (por sus siglas en inglés hospital associated infections), corresponden a infecciones que le ocurren a un paciente durante su estado de hospitalización o cuando entra en contacto con un establecimiento de atención de salud1 . Entre los microorganismos relacionados con los HAIs, las bacterias y los virus son los agentes patógenos más comunes, respecto a estos, las bacterias son consideradas como los agentes nosocomiales de mayor importancia, ya que son responsables del 90% de las HAIs2 .
Este tipo de infecciones han sido ampliamente estudiadas en hospitales humanos, donde hoy en día son el foco de investigación para la búsqueda y desarrollo de estrategias de prevención y control, debido a los altos costos económicos y de vidas humanas que representan, donde, se estima que un 5% de los pacientes hospitalizados desarrollan una infección hospitalaria, produciendo la muerte de 75.000 pacientes al año en todo el mundo3,4.
La problemática de las HAIs en medicina veterinaria puede llegar a ser más crítica, debido a factores como largos tiempos de hospitalización, uso prolongado de tratamientos complejos, amplio uso de inmunosupresores, gran cantidad de pacientes en estado crítico, uso indiscriminado de antibióticos y las limitaciones en el espacio de las instalaciones, los cuales inducen la transmisión e infección de estos agentes en clínicas de pequeñas especies (perros y gatos), sin considerar la escaza implementación de programas dirigidos a la identificación, prevención y control de HAIs en las clínicas veterinarias5 .
Reportes de brotes en animales y humanos se han publicado principalmente en países desarrollados6-10. En 38 hospitales veterinarios universitarios de Estados Unidos y Europa, se reportó que el 82% habían presentado brotes de HAIs en los 5 años anteriores al estudio11. Sin embargo, en Latinoamérica la información sobre las HAIs es escasa. Un estudio realizado en una clínica veterinaria en Brasil reportó la prevalencia de las HAIs encontrando únicamente un gato positivo12, en otro estudio realizado en Costa Rica, se aislaron agentes relacionados con HAIs en 26.5% de las superficies muestreadas13. En Colombia solo hay dos reportes publicados a la fecha, uno realizado en Bogotá, donde se evaluó el comportamiento de algunos antibióticos de uso común veterinario en cepas de Pseudomonas aeruginosa aisladas de centros clínicos animales14 y otro estudio realizado en 10 clínicas veterinarias de la ciudad de Ibagué donde se encontraron bacterias potencialmente patógenas multirresistentes en todos los sitios de muestreo15.
Algunos estudios han reportado que ciertos agentes nosocomiales pueden sobrevivir por periodos prolongados en el ambiente y continuar infecciosos16, lo cual sugiere que los ambientes hospitalarios puede ser importantes reservorios de estos microorganismos13. Entender el papel que juegan los equipos hospitalarios y el ambiente con respecto al mantenimiento de infecciones nosocomiales y la transmisión es crucial. En este contexto, es indispensable hacer vigilancia a las infecciones asociadas a clínicas veterinarias, por lo cual se plateó el objetivo de identificar la presencia de bacterias asociadas a infecciones hospitalarias en ambientes y superficies de una clínica veterinaria universitaria del Área Metropolitana del Valle de Aburrá, Antioquia-Colombia.
Materiales y métodos
Diseño del estudio
Se realizó un estudio observacional descriptivo, en una clínica veterinaria ubicada en el municipio de Caldas al sur del área Metropolitana del Valle de Aburrá. Las muestras fueron obtenidas en septiembre de 2016 y abril de 2017.
Toma de muestras
Se incluyeron en el estudio ocho áreas de muestreo correspondientes a dos consultorios veterinarios, dos cuartos de infecciosos, un quirófano, un cuarto de preparación-recuperación, una zona de hospitalización y una de urgencias. Dentro de cada área se tomaron muestras de ambientes y superficies, las cuales fueron obtenidas en horas de la mañana, durante la jornada laboral y sin previo aviso al personal médico. Para los análisis de ambientes, se empleó la metodología de sedimentación, que consiste en la exposición durante 15 minutos de cajas de Petri con medios de cultivos selectivos y diferenciales en cada una de las áreas y para superficies se evaluaron los mesones y las jaulas (las jaulas se encontraban en las áreas de hospitalización y preparación-recuperación), a través de la metodología de hisopado, empleando hisopos médicos multiusos estériles con los cuales se realizó el barrido de las superficies. Posteriormente, se almacenaron en agua peptona buferada (2-4h) y se sembraron en agares selectivos y diferenciales. De otro lado, se tomaron muestras de las manos del personal médico que se encontraba laborando en el momento de los muestreos, empleando para ello la metodología de lavado (introducir las manos del personal en medio de cultivo). Los recipientes fueron rotulados y codificados para garantizar la trazabilidad de los análisis y posteriormente, almacenadas en neveras de polipropileno, bajo condiciones de refrigeración (5+/-3°C) hasta su llegada al laboratorio.
Aislamiento e identificación de microorganismos
Para cada área se emplearon ocho medios de cultivo. Los agares nutritivos, Mac-Conkey, Baird-Parker, Manitol sal, EMB y Cetrimide, se incubaron a 35+/-2°C, en tanto que los agares M17 y sangre (sangre de caballo al 5%) se incubaron en condiciones de anaerobiosis a 37°C+/-2°C, con lecturas a las 24 y 48 horas. Las cajas que no reportaron crecimiento se dejaron en incubación durante 48 horas más, con seguimiento de los cambios aparentes en el medio, con el fin de minimizar el reporte de falsos negativos. Para el caso de microorganismos esporulados como Clostridium sp. y Bacillus sp., se tomó una porción de todas las muestras de hisopado para cada área y fueron sometidas a calentamiento 10 minutos a 80°C, para eliminar biota acompañante, finalmente se inocularon 100uL de la muestra por siembra en superficie en agar sangre y agar nutritivo, e incubados en las condiciones descritas anteriormente.
En cada cultivo se realizó una identificación de la morfología típica de las colonias teniendo en cuenta forma, tamaño, color, textura, elevación y formación de halo. Posteriormente, se seleccionó una colonia tipo para cada descripción morfológica y se sometió a un proceso de purificación a través del método de agotamiento en placa empleando agar nutritivo, se hicieron lecturas a las 24 y 48 horas. Finalmente, se realizó una tinción diferencial para establecer las características microscópicas propias de la colonia como forma de la célula (bacilos, cocos, coco-bacilos y espirilos) y tipo de Gram (-positivo o -negativo).
La identificación de las colonias purificadas fue confirmada a través de test bioquímicos comerciales como el API 20 E para bacilos Gram-negativos (108 especies) y el API 50 CHB/E para bacilos Gram-positivos. En ambos casos se siguieron los protocolos recomendados por el fabricante (BioMérieux SA, Francia). La identificación de especies fue realizada a través del software de identificación api web. Finalmente, las colonias aisladas e identificadas fueron conservadas con glicerol a -80°C, con el fin de garantizar su pureza, viabilidad y estabilidad en el tiempo.
La identificación de los cocos Gram-positivos asociados a HAIs (Micrococcus sp., Staphylococcus sp. Streptococcus sp. y Enterococcus sp.) se realizó a través de pruebas bioquímicas convencionales siguiendo los protocolos previamente descritos17.
Evaluación de la susceptibilidad a antibióticos
Para la evaluación de la susceptibilidad a antibióticos, se incluyeron los siguientes patógenos por su importancia relativa a las HAIs encontrados en la clínica veterinaria, como Pseudomonas sp. Staphylococcus sp. Klebsiella sp. y Streptococcus sp. en los cuales se empleó la metodología de difusión por disco propuesta por Kirby-Bauer18. La preparación del inóculo se realizó en caldo BHI a partir de dos o tres colonias seleccionadas de una placa de cultivo no selectivo de 24 horas de incubación, dicha suspensión fue ajustada a una concentración de 0.5 Mc Farland (1 x 108 UFC/mL). Una vez elaborado el inóculo se procedió a sembrar las placas de M. Hinton con un hisopo estéril, el cual fue trapeado sobre el medio sólidos en tres direcciones rotando la caja 60° cada vez para asegurar la correcta distribución del inóculo. Para los Staphylococcus y los Bacillus se empleó el agar Müller-Hinton y para los Streptococcus y Enterococcus el agar Müller-Hinton Sangre. Posteriormente, se dejó reposar la muestra con el fin de minimizar el exceso de humedad superficial que pueda interferir con el análisis y se dispusieron entre 6 y 7 sensidiscos por aislado, los cuales se seleccionaron de acuerdo con las recomendaciones de la CLSI de 2017 para cada microorganismo en particular. Una vez ubicados los sensidiscos en las cajas, estas fueron llevadas a incubación durante 24 horas a 37°C y las cajas de agar Müller-Hinton Sangre fueron incubadas con un 5% de CO2. Después de 24 horas de incubación se examinaron las cajas y se midieron los diámetros (mm) de las zonas de inhibición, para calcular así el grado de susceptibilidad de cada aislado frente a la batería de antibióticos evaluada.
Resultados
Durante los dos muestreos realizados (septiembre de 2016 y abril de 2017), se evidenció la presencia de microorganismos viables y con potencial nosocomial en ambientes y superficies de las ocho áreas evaluadas en la clínica veterinaria. En total, se obtuvieron 95 aislados (61 del primer muestreo y 34 del segundo), los cuales fueron seleccionados a través de aislamientos sucesivos y caracterizados macroscópica y microscópicamente. Lo anterior, permitió establecer que el 47% de los organismos cultivados correspondían a bacterias Gramnegativas y el 53% a bacterias Gram-positivas. A través del API y de pruebas bioquímicas se pudo identificar 28 de los morfotipos aislados como microorganismos potencialmente nosocomiales, los cuales se encontraron distribuidos en las diferentes áreas de la clínica como se muestra en la tabla 1.
Tabla 1: Distribución de las bacterias con potencial nosocomial, identificadas en los diferentes sitios de muestreo de la clínica veterinaria
Se observó que algunos de los organismos aislados y relacionados con infecciones nosocomiales, como son Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis y Bacillus cereus, persistían en varias de las áreas evaluadas. Adicionalmente, se identificó que al menos un agente con potencial nosocomial fue aislado en cada sitio de la clínica veterinaria. Los lugares donde se aislaron con mayor frecuencia este tipo de microorganismos fueron: el cuarto de preparación-recuperación (10 aislados), consultorio veterinario 1 (8 aislados), hospitalización (7 aislados) y consultorio veterinario 2 (6 aislados), en tanto que la zona de cirugía y personal (manos) reportaron los porcentajes más bajos (Tabla 2).
Tabla 2 Número y porcentaje de microorganismos potencialmente nosocomiales aislados en las diferentes áreas de la clínica veterinaria.
Al realizar los análisis bioquímicos con el API 20E, se identificaron grupos taxonómicos potencialmente nosocomiales con coincidencias superiores al 80% como Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas luteola, Serratia odorifera, Proteus penneri, Proteus vulgaris y taxones con coincidencias menores al 80% como, Pseudomonas fluorescens, Pasteurella pneumotropica, Aeromonas salmonicida, Burkholderia cepacia y Ochrobactrum anthopi. Los grupos no definidos fueron categorizados como Proteus mirabilis y Klebsiella oxytoca.
Los análisis bioquímicos con el API 50 CHB/E, permitieron la identificación de Bacillus licheniformis, Bacillus circulans y Bacillus cereus con coincidencias superiores al 90%. Así mismo se identificaron Bacillus lentus y Bacillus mycoides con coincidencias de 84 y 83% respectivamente.
A través de pruebas bioquímicas convencionales, se realizó la identificación de las colonias caracterizadas como cocos Gram-positivos, encontrando en las muestras Micrococcus luteus, Enterococcus faecalis, Staphylococcus sp., Streptococcus pneumoniae y Streptococcus mitis, todos ellos asociados a infecciones nosocomiales. Los microorganismos con asociación nosocomial que fueron encontrados con mayor frecuencia dentro de las ocho áreas de la clínica fueron, Pseudomonas aeruginosa (en 6 de las 8 áreas), Proteus sp. (en 5 de las 8 áreas) y Bacillus cereus (en 3 de las 8 áreas).
Con respecto a los antibiogramas se observa que el aislado de Streptococcus sp. obtenido en el área de hospitalización y en las manos de un operario de la clínica fue sensible solo a 2 de los 7 antibióticos usados (Amikacina (AN) y Tetraciclina (TE)). Por otro lado, los aislados de Pseudomonas aeruginosa obtenidos en varias áreas de la clínica, incluyendo cirugía, el consultorio 1 y urgencias, presentaron un patrón de resistencia a antibióticos similar, con resistencia a Amoxacilina con ácido clavulánico (AmC) y la Ampicilina sulbactam (SAM); solo el aislado obtenido en el área de cirugía fue resistente además a Trimetropim sulfa (SXT). Klebsiella oxytoca solo presento una resistencia intermedia para Enrofloxacina (ENR) y el aislado de Staphylococcus sp. fue resistente solo a Cefalexina (CL), de igual forma Pseudomonas fluorescens solo presento resistencia a Trimetropim sulfa (SXT) (Tabla 3).
Table 3: Perfiles de susceptibilidad antimicrobiana de los microorganismos relacionados con resistente a antibióticos aislados de la clínica veterinaria.
Los antibióticos se usaron según lo descrito por el CLSI 2017 para los siguientes fármacos antimicrobianos: Amikacina (AN), Tetraciclina (TE), Enrofloxacina (ENR), Amoxacilina clavulonico (AmC), Gentamicina (CN), Ampicilina sulbactam (SAM), Cefaloperazone (CFP), Penicilina G (P), Florfenicol (FFC), Trimetropim sulfa (SXT), Cefalotina (KF con ácido) y Cefalexina (CL). R: resistente, I: intermedio y S: sensible
Discusión
Los agentes bacterianos asociados a infecciones hospitalarias, comúnmente corresponden a patógenos oportunistas presentes habitualmente de forma estable en el ambiente o en animales sanos, lo cual dificulta el control del ingreso de estos agentes a las diferentes áreas de las clínicas veterinaria2 . Hasta la fecha, son pocos los estudios que han explorado la diversidad de bacterias en ambientes y superficies de clínicas veterinarias6,10,15. En Latinoamérica, la distribución de los patógenos oportunistas por la clínica puede cobrar mayor importancia, debido a las limitaciones de espacio, ocasionando que un paciente tenga acceso a diferentes áreas durante su ingreso a las instalaciones. Adicionalmente, la escasez de personal puede llegar a promover que el médico veterinario circule por toda la clínica sirviendo como vehículo para estos patógenos. Lo anterior, permite explicar porque en el presente estudio todas las áreas evaluadas presentaron por lo menos, una bacteria con características de un agente patógeno oportunista e incluso que algunos sitios compartieran el mismo agente como es el caso de Pseudomonas aeruginosa.
Algunos estudios han permitido establecer las zonas en las clínicas veterinarias con mayor riesgo de infección por este tipo de agentes, indicando que los puntos críticos de transmisión corresponden a la unidad de cuidados intensivos y el cuarto de recuperación, los cuales coinciden con áreas donde los animales permanecen por tiempos relativamente largos10,19. En este estudio se observó que la mayor frecuencia de agentes potencialmente asociados a HAIs, se encuentran en las áreas de preparación-recuperación y hospitalización, con porcentajes de 35,71% y 25,00%, respectivamente. Cabe destacar que dentro de los sitios donde se aisló con mayor frecuencia HAIs se encuentra un sitio considerado de paso rápido para los pacientes, como lo es “el consultorio veterinario 1” el cual presento una frecuencia de 28.57%.
Al igual que con otros estudios, donde se determina que la menor frecuencia de agentes relacionados con HAIs, se encuentra en el área de cirugía (1,6% - 9,8%) 10,19, se encontró que para nuestro caso correspondía al 3,57%. A pesar de la baja frecuencia manifiesta, en medicina humana se considera un punto crítico, ya que las infecciones en el sitio quirúrgico junto con las infecciones del tracto urinario, la neumonía y las infecciones del torrente sanguíneo representan aproximadamente el 80% de todas las HAIs2 , donde entre el 2 y 5% de los pacientes que se les hace un procedimiento quirúrgico presentan una infección asociada al sitio de cirugía1 . Con respecto a veterinaria, las tasas de infección para procedimientos quirúrgicos limpios son muy cercanos a los presentados en medicina humana (3.6% al 5.8%)20, lo cual sugiere que este tipo de sitios son igual de importantes en veterinaria, teniendo en cuenta que la infección pos-operatoria puede afectar el éxito de la intervención quirúrgica inicial, retrasar la cicatrización e incurrir en costos adicionales para los propietarios.
Se registró el crecimiento de Pseudomonas aeruginosa en seis de los ocho sitios muestreados (75%), siendo la bacteria más persistente. Se destaca la importancia de esta bacteria debido a los frecuentes reportes de resistencia a antibióticos encontrados alrededor del mundo, tanto en hospitales humanos como en clínicas veterinarias1,9,21,22, lo cual, ha generado que Pseudomonas sp. sea incluida en la lista publicada por el CDC como “amenazas graves de resistencia a los antibióticos”. En el presente trabajo, se encontró que las cepas de P. aeruginosa aisladas son resistentes a múltiples fármacos, lo que sugiere que la presión selectiva creada por el uso persistente y posiblemente inadecuado de estos antimicrobianos en la práctica clínica veterinaria, sea uno de los factores determinantes para la aparición de dicha resistencia23. Para Colombia, se tiene un reporte de resistencia en Pseudomonas aeruginosa para una clínica veterinaria en Bogotá, donde se obtuvieron 10 aislados provenientes del ambiente y muestras clínicas, con resultados que demostraron multiresistencia para algunos de los 18 antibióticos empleados en los antibiogramas14. Las infecciones asociadas a hospitales con este patógeno se relacionan principalmente con pacientes inmunocomprometidos. En animales de compañía, se ha relacionado a Pseudomonas sp. con infecciones en piel, sistema urinario y oído2,24.
Las bacterias del género Proteus sp. (P. mirabilis, P. penneri y P. vulgaris) fueron el segundo grupo más reportado en este estudio (5 de 8 áreas), presentando una frecuencia del 62.5%. Estos agentes usan como ruta de penetración los catéteres, lo cual, determina que las infecciones por estos organismos se relacionen con el tracto urinario y el torrente sanguíneo, sitios donde se usa frecuentemente este tipo de equipamiento1,25. Cabe resaltar que, aunque solo se obtuvo un aislado de Staphylococcus aureus (consultorio veterinario 1), este microorganismo cobra importancia debido a que algunas cepas, como las meticilino -resistentes (MRSA) constituyen un problema significativo en los hospitales por su frecuencia, gravedad y dificultad en el tratamiento2 , sin embargo, en nuestro estudio no se pudo determinar si la cepa asilada era resistente a la meticilina, aunque fue resistente a la cefalexina (CL).
Si bien, durante el estudio se obtuvieron 28 aislados potencialmente nosocomiales en todas las áreas muestreadas, una de las limitaciones que se presentaron al momento de los análisis, está relacionada con la ausencia de información en relación con la presencia de factores de virulencia o genes relacionados con resistencia a antibióticos. Sin embargo, este estudio constituye un primer acercamiento a los agentes nosocomiales que pueden estar circulando en la clínica veterinaria y promueve estudios futuros enfocados a establecer la prevalencia, los factores de riesgo y la dinámica de estos agentes en la clínica.
A pesar de la importancia de este campo, actualmente, el conocimiento respecto a la epidemiología de agentes multi-resistentes a antibióticos y de patógenos asociados a infecciones en hospitales veterinarios son limitados. Posiblemente, lo anterior se debe a la escasa implementación de programas de vigilancia, prevención y control dentro de las instalaciones, los cuales permitirían tener una reducción entre el 10- 70% de las HAIs1 , generando un impacto positivo sobre la salud del paciente, los costos y la satisfacción del propietario y el médico veterinario.
