La infección de la mucosa gástrica con Helicobacter pylori es una de las más frecuentes en los seres humanos y está relacionada con diferentes enfermedades gástricas como úlcera péptica, gastritis crónica, cáncer gástrico, además de algunas enfermedades cardiovasculares, autoinmunes, anemia ferropénica, urticaria y retraso en el crecimiento, entre otras (Gasbarrini et al. 1998, González-Carbajal 2002). En el departamento de Nariño (Colombia) se ha encontrado alta incidencia de infección por H. pylori y elevada asociación con desarrollo de cáncer gástrico sobre todo en la zona andina (Camargo et al. 2004 y Goodman et al. 1996). Teniendo en cuenta la importancia oncogénica de la bacteria se han implementado una serie de terapias agresivas (combinación de un inhibidor de la bomba de protones y un compuesto a base de bismutoy 2-3 antibióticos) con el fin de lograr su erradicación. Estos tratamientos ''triples o cuádruples'' han sido 80 a 90% exitosos; sin embargo, el costo y los efectos colaterales son continua causa del aborto de terapias generando una marcada resistencia a los antibióticos usados (Sherif et al. 2004, Wu et al. 2005). Por ello, se han adelantado varios estudios en busca de terapias complementarias para el control de la bacteria, tales como: prebióticos, dietas ricas en antioxidantes y extractos de diversas plantas, que ayuden a incrementar la efectividad del tratamiento convencional como lo recomienda Bergonzelli (2003). Con este propósito, el grupo de investigación de Salud Pública de la Universidad de Nariño (Pasto), Colombia, realizó un estudio con el cual se evidenció actividad anti-H. pylori in vitro del aceite esencial y el extracto acuoso de la pulpa de frutos maduros de Carica candamarcensis Hook. f. (1875) (chilacúan, papayuela de clima frío) Mena et al. (2005). La especie C. candamarcensis es originaria de los Andes de la América meridional (Colombia o Perú) y se distribuye desde Panamá hasta los Andes de Bolivia y parte de Chile, se utiliza normalmente para consumo humano y se han registrado muchas propiedades terapéuticas del látex de la planta como eliminación de hematomas y verrugas, en el tratamiento de arteriosclerosis y amigdalitis, se ha evidenciado actividad mitogénica tanto in vitro como in vivo (en recuperación de quemaduras en pacientes diabéticos), también actividad proteasa utilizada en procesos de extracción y purificación de ADN (Gomes etal. 2005, Mello et al. 2008, teixeira et al. 2008).

Para evaluar el efecto genotóxico de los extractos se siguió la metodología propuesta por Singh et al. (1988) y modificada por Rojas et al. (1999) y tice et al. (2000), denominada electroforesis alcalina de células individuales [ensayo cometa (SGCE)]; al someter a electroforesis las células expuestas a una sustancia problema, los quiebres generados en el ADN hacen que estos fragmentos se muevan desde el núcleo hacia el ánodo migrando en forma de un cometa que se puede visualizar con un colorante fluorescente afín al ADN.

MATERIALES Y METODOS

Obtención de los extractos de Carica candamarcensis. Para obtener una muestra representativa de la población vegetal de Carica candamarcensis Hook. f. (1875), la recolección de los frutos maduros se realizó siguiendo el modelo de muestreo aleatorio simple, en 15 árboles de cultivos caseros del corregimiento el Encano de Pasto (Nariño), Colombia. Se recolectaron al azar 150 frutos maduros de tamaño variable (aproximadamente, 5 por cada árbol); posteriormente se empacaron en bolsas plásticas y se almacenaron a 4 °C para su transporte. Para obtener los extractos de aceite esencial (AE) y acuoso(EA) se utilizó el método de hidrodestilación asistida por radiación con microondas (MWHD) según el protocolo estandarizado por Gómez y Moran (2005). Los frutos se lavaron con solución de hipoclorito al 2% para eliminar agentes contaminantes y se realizó la separación de la pulpa y las semillas. Se trituraron 1.500 g de pulpa junto con la cáscara y se introdujeron en un balón de 4 litros de capacidad, al que se adicionaron 200 ml de agua destilada y se acopló al sistema de hidrodestilación tipo Clevenger, con reservorio de destilación tipo Dean-Stark y calentamiento por radiación mediante un horno microondas LG, modelo MB-14VG, con una potencia de salida 2.450 MHz (7% de la potencia máxima) durante 90 min, con 1 min intermedio de pausa cada 10 min. El aceite esencial y el remanente acuoso fueron recolectados en tubos ependorff de 1,5 ml estériles, cubiertos con papel aluminio y conservados a -20 °C hasta su uso.

Análisis de citotoxicidad y determinación de concentraciones de trabajo. Para esta prueba se emplearon linfocitos humanos de sangre periférica de un donante sano, quien firmó el respectivo consentimiento para participar en este estudio, y mediante interrogatorio medico cumplió con los siguientes requisitos: ser joven, no fumador, no haber ingerido alcohol un mes antes del ensayo ni durante las pruebas. Los linfocitos se aislaron por el método tradicional en gradiente de Hystopaque^® (Boyum 1968). Para esto, se depositaron 10 ml de sangre en un tubo Vacutainer con heparina que fue tratado con buffer fosfato de sodio (PBS) e Hystopaque^®1077 de Sigma (Boyum 1968), se centrifugó durante 30 min a 2.000 rpm, se extrajo con precaución la capa de linfocitos y se transfirió a otro tubo limpio y seco. Se descartó el PBS y se agregó 1 ml de medio RPMI-1640 (sigma) suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 10%, se evaluó viabilidad inicial mediante azul de tripano, el cual se basa en que las células muertas pierden la permeabilidad selectiva y por lo tanto el colorante ingresa por difusión a ellas adquiriendo una coloración azul, en contraste las células vivas son refringentes y selectivas al colorante, posteriormente se incubó a 37 °C.

El EA puro fue considerado como la primera dosis de trabajo, a partir de la cual se realizaron 5 diluciones con agua destilada estéril desde 10^-1 a 10^-5 ml. Para el AE se preparó una solución stock agregando DMSO al 1% a 100 µl de AE puro hasta que se formó una emulsión, a partir de esta solución stock se hicieron las diluciones en DMSO al 1% hasta 10^-6 ml de extracto.

La prueba se realizó en una solución de 100.000 linfocitos y 10 µl de la solución del extracto a evaluar en cada una de las concentraciones, además de los controles respectivos con agua destilada estéril y DMSO al 1%, se cultivaron en medio RPMI suplementado con SFB al 10% en un volumen final de 250 µl. Se incubó a 37 °C y cada hora se evaluó la viabilidad mediante el método de exclusión de azul de tripano, durante 6 h.

Se calculó el porcentaje de viabilidad absoluta y los resultados se graficaron verificando su ajuste a la distribución lineal a lo largo del tiempo, se consideraron citotóxicos si alcanzaban una viabilidad igual a 0, ligeramente citotóxica entre 40-79% de viabilidad, y no citotóxicos con una viabilidad superior o igual a 80%.

Para cuantificar la mutagenicidad se utilizó el índice de mutagenicidad (IM), obtenido de los promedios de tres experimentos independientes, cada uno por duplicado. El IM se refiere a las veces que es superada la mutagenicidad del control por el tratamiento. teniendo en cuenta los criterios de Watanabe et al. (2003), se establecieron las siguientes categorías:

Análisis de genotoxicidad. Ensayo cometa. El daño en el ADN se detectó en linfocitos humanos aislados de sangre periférica. La separación de los linfocitos se hizo a partir de 5 ml de sangre con gradiente de Hystopaque^®, las células se resuspendieron en buffer fosfato salino (PBS) libre de Ca²⁺ y Mg²⁺1995 (Day 1972). Con el fin de determinar efecto de dosis, los linfocitos se trataron con 10 µl de cada dosis a evaluar de cada extracto, luego se incubaron a 37 °C durante una hora. Se determinó la viabilidad celular por microscopía, utilizando el método de exclusión con el colorante azul de tripano (0,02%) antes y después del tratamiento. El ensayo cometa se procesó según la metodología propuesta por Singh et al. (1988) y modificada por Pandrangi et al. (1995).

Análisis estadístico. Los resultados de las diferentes pruebas se analizaron usando el programa Past 2008, se empleó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis con un α=0,05 y un valor de confiabilidad del 99%, y un análisis de medias tipo tukey.

En el caso de ensayo cometa además se evaluó la presencia de heterogeneidad en los datos y de posibles valores atípicos o errores en los datos aplicando la prueba de Levene modificada.

RESULTADOS

Toxicidad en linfocitos para determinación de dosis a dosis. En el ensayo de toxicidad con linfocitos humanos, murieron todas las células en el tratamiento stock de AE de frutos maduros de C. candamarcensis por lo tanto se consideró citotóxica y se eliminó del ensayo de mutagenicidad (figura1), así las dosis de trabajo v/v se tomaron a partir de AE 10^-1 hasta 10^-6.

En el EA todos los porcentajes de viabilidad son superiores al 85% demostrando que este extracto no es citotóxico en ninguna concentración (figura 2), por lo tanto las dosis seleccionadas (v/v) para los análisis de premutagenicidad y mutagenicidad fueron desde el extracto concentrado original hasta 10^-2.

Con los resultados obtenidos se determinó que la solución stock del AE induce citotoxicidad, el resto de dosis evaluadas se consideran no citotóxicas según los estudios realizados, sin embargo se deben realizar otras pruebas de este tipo para descartar cualquier tipo de daño celular que pueda causar.

Ensayo de mutagenecidad en Salmonella typhimurium. Prueba de Ames. todas las pruebas para la confirmación del genotipo de la cepa fueron positivas, los valores de reversión espontánea observados se encontraron dentro del ámbito estandarizado en el Laboratorio de Mutagénesis de la Universidad de Antioquia. Los resultados de la prueba se presentan en la tabla 1.

Ensayo cometa. El efecto genotóxico sobre linfocitos humanos tratados con diferentes concentraciones de los extractos de AE y EA se muestra en la figura 3. En el tratamiento de 1h se observó una longitud media de cola de 14 µm para el DMSO 1% utilizado como control negativo y en el control positivo (H₂O₂ 50 µM) una longitud de cola media de 40 µm; esto permite constatar la adecuada ejecución de la técnica puesto que estas medidas superan ampliamente las obtenidas para el DMSO 1%.

La prueba kruskal Wallis, como era de esperar, indica diferencias significativas con respecto a la longitud de cola del cometa entre el control positivo y los tratamientos con un P_value = 0,15 y un α = 0,05.

DISCUSIÓN

El estudio realizado por Bakkali et al. (2008), demostró que en las células eucarióticas los AE de plantas pueden actuar como prooxidantes y, que según el tipo y la concentración estos pueden exhibir efectos citotóxicos en las células vivas, esto coincide con lo observado en el ensayo realizado con la solución stock donde se presentó una mortalidad del 100%.

Sin embargo, a partir de la dosis AE 10^-1 los porcentajes de viabilidad celular fueron superiores al 90% resultando concentraciones inocuas para el modelo celular utilizado. Ensayos fisicoquímicos in vitro han caracterizado a los AE, en su mayoría como antioxidantes y demuestran que las mezclas complejas de compuestos aromáticos presentes en aceites esenciales aislados de plantas pueden tener efectos protectores celulares actuando también como antinflamatorios (Miguel 2010). Los resultados de este estudio concuerdan con los de otras investigaciones donde aceites esenciales de plantas han sido utilizados de manera exitosa en terapias para control microbiano pues presentan de manera simultánea actividad antimicrobiana y efecto inocuo sobre el humano (Laciar et al. 2009).

La caracterización preliminar del AE de frutos maduros de C. candamarcensis obtenida por MWHD mediante cromatografía de gases indica la presencia de varias especies químicas en donde predominan los compuestos oxigenados con un 72% y el restante 28% está conformado por hidrocarburos saturados, insaturados y aromáticos, monoterpenos, sesquiterpenos y compuestos nitrogenados (Gómez y Moran 2005) Mena et al. (2005). Rompelberg et al. (1995) señalaron que estos extractos constituyen mezclas complejas en las que se pueden encontrar compuestos con actividad antimutagénica, como monoterpenos y sesquiterpenos que pueden debilitar o inhibir el efecto genotóxico potencial.

Jahangir et al. (2006) encontraron que farnesol, uno de los compuestos presentes en el aceite esencial de chilacuán, tiene propiedades quimiopreventivas ya que disminuye el daño oxidativo que causa el hierro en tejidos y órganos, previniendo la formación de tumores en modelos murinos. Este sesquiterpeno es un compuesto ampliamente utilizado en la industria farmacéutica y cosmética gracias a que presenta diferentes niveles de actividad biológica como: bactericida, fungicida y antinflamatorio como lo demostró koo (2003).

En el ensayo de genotoxicidad (ensayo cometa), tanto el EA como el AE de chilacuán no inducen efecto genotóxico en ninguna de las dosis evaluadas en el sistema de ensayo empleado. Bakkali et al. (2008), señalaron que una ventaja representativa de los aceites esenciales es el hecho que ellos por lo general son desprovistos de riesgos genotóxicos a largo plazo. Además, Bakkali et al. (2005) demostraron que algunos de ellos presentan capacidad antimutagénica muy clara que bien podría ser vinculada a una actividad anticancerígena.

Beric et al. (2008) determinaron que el linaool redujo la mutagénesis espontánea en la cepa de E. coli k12 del 27 en un 44%; las pruebas del efecto antigenotóxico fueron comparables al modelo antioxidante de la vitamina E, ya que redujeron el número de cometas inducidos por H₂O₂ entre el 45 al 70%, este efecto podría ser atribuido a sus propiedades antioxidantes.

Particularmente sobre el compuesto farnesol, Jahangir et al. (2006) han registraron los efectos protectores, la disminución del daño oxidativo y quimiopreventivo; con base en esto es posible suponer que este compuesto, o en conjunto con otros, puede haber influido en que la respuesta haya sido negativa al antagonizar cualquier efecto genotóxico que pudiera inducir algún otro compuesto presente en el extracto, situación muy común en la mayoría de las especies vegetales y que contribuye a fundamentar la inocuidad de su uso en la medicina tradicional.

De igual manera, existen registros de extractos acuosos de plantas con actividad antigenotóxica y antitumoral como el de Silva et al. (2008); es importante señalar que estudios de Mello et al. (2008) con enzimas proteolíticas obtenidas de frutos de C. candamarcesis han evidenciado un efecto protector ante la ulceración de la mucosa gástrica en modelos murinos, que probablemente este asociado a un efecto mitogénico que favorece la recuperación de la mucosa gástrica; por lo tanto, y con base en los resultados de este estudio es importante realizar estudios de antimutagenecidad con la misma prueba de Ames y antigenotoxicidad con ensayo cometa con los dos extractos evaluados , además del efecto antioxidante y quimio protector que puedan tener.

Sánchez et al. (2003) consideraron que existen tres diferentes niveles de daño al ADN que deben ser evaluados por diferentes métodos, el primer nivel, se evalúa usando ensayos que detecten específicamente daño por rupturas en el ADN, el segundo, es por mutación en los genes, y el tercero, mediante ensayos de citogenética, en este se realizaron ensayos para descartar daño en los dos primeros niveles.

En conclusión, este estudio demuestra que según las pruebas utilizadas todas las concentraciones evaluadas son seguras a nivel citotóxico, genotóxico y mutagénico. Sin embargo, se requieren estudios adicionales con otros métodos de ensayo que permitan confirmar o descartar si los extractos inducen daños relevantes sobre el ADN, si tienen efectos antigenotóxicos y antimutagénicos para contemplar, así, su posterior inclusión en el desarrollo de un fitofármaco de C. candamarcensis como tratamiento complementario en pacientes con antecedentes de infección de H. pylori.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos la financiación de este trabajo al Sistema de Investigaciones y al Centro de Estudios en Salud de la Universidad de Nariño, al Grupo de Investigación Salud Pública de la Universidad de Nariño, a Jaime Calle y al equipo de Laboratorio de Mutagénesis de la Universidad de Antioquia por su colaboración en el desarrollo del proyecto y a Jhon Jairo Calderón por sus aportes en el componente estadístico.

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