Estandarización y validación de una PCR multiplex para el diagnóstico de Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae y Legionella pneumophila en pacientes con neumonía adquirida en la comunidad (NAC) que requiere hospitalización

Mariana Herrera-Díaz^1,3, Yudy Aguilar-Pérez¹, Zulma Rueda-Vallejo¹, Lázaro A Vélez-G^1,2

1 Grupo Investigador de Problemas en Enfermedades Infecciosas (GRIPE), Universidad de Antioquia. Medellín (Antioquia), Colombia.

2 Sesión de Enfermedades Infecciosas, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia. Medellín (Antioquia), Colombia.

3 Correo electrónico: marianah8@hotmail.com.

Financiación: Fundación Rodrigo Arroyave y Fundación Investigando en Salud y Enfermedades Infecciosas.

Un estudio previo en Medellin (Antioquia), Colombia, demostro evidencia de infeccion reciente por bacterias atipicas en aproximadamente 24% de los pacientes adultos hospitalizados con neumonia adquirida en la comunidad (NAC) (Legionella pneumophila 1,9%, Chlamydophila pneumoniae 8,7% y Mycoplasma pneumoniae 13,8%). Esta investigacion busco estandarizar localmente una PCR casera para el diagnostico de la NAC causada por una cualquiera de estas bacterias atipicas, en una sola reaccion, con el fin de proporcionar un diagnostico confiable y oportuno que facilite el tratamiento especifico del germen involucrado. Para estandarizar la PCR se utilizo ADN de las bacterias y cebadores previamente registrados en la literatura, los cuales amplifican el gen de la citoadhesina p1 de M. pneumoniae, el gen potencializador de la infeccion de macrofagos (mip1) de L. pneumophila y el gen PstI de C. pneumoniae. Se estandarizaron la temperatura de alineamiento, tipo de buffer utilizado, concentracion de cebadores y de Taq polimerasa. La reaccion final de la PCR multiplex contiene 2 µl de ADN, y una concentracion final 2,5 mM de MgCl₂, 1 µM de cada uno de los cebadores y 0,05 U/µl de Taq polimerasa en un volumen total de 25 µl. Se utilizo un control negativo en cada reaccion de PCR. El revelado de los productos de la PCR se efectuo por electroforesis en gel de agarosa al 2% corridos a 70 V/1h, tenidos con EZ-VISION®. Se realizaron pruebas de sensibilidad analitica utilizando diluciones seriadas de plasmidos conteniendo el inserto de interes, y pruebas de especificidad analitica utilizando ADN de 11 patogenos respiratorios (8 especies bacterianas y 3 hongos). Para la validacion de la prueba, se utilizaran 80 muestras de aspirado nasofaringeo conservadas a -80 °C, y 100 muestras de hisopado nasofaringeo recolectadas prospectivamente en personas con y sin diagnostico de NAC, evaluadas conjuntamente con serologia pareada para cada una de las bacterias estudiadas, y antigeno urinario para L. pneumophila serogrupo 1.