ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN

DEPENDENCIA MICORRÍCICA DE BARCINO
(CLUSIACEAE: CALOPHYLLUM BRASILIENSE CAMBERS)

MYCORRHIZAL DEPENDENCE OF BARCINO
(CLUSIACEAE: CALOPHYLLUM BRASILIENSE CAMBERS)

Jorge A. Sierra-Escobar¹; Dagoberto Castro-Restrepo²; Walter Osório-Vega³

1 Grupo de estudios florísticos. Universidad Católica de Oriente. A. A. 050956 Rionegro. Rionegro (Antioquia), Colombia. jsierra@uco.edu.co.

2 Grupo de estudios florísticos. Universidad Católica de Oriente. A. A. 050956 Rionegro. Rionegro (Antioquia), Colombia. dcastro@uco.edu.co.

3 Grupo de Microbiología de suelos. Universidad Nacional de Colombia sede Medellín. Medellín (Antioquia), Colombia. nwosorio@unal.edu.co.

Recibido: febrero 2012; aceptado: octubre 2012.

Resumen

Se realizó un experimento en invernadero, cuyo objetivo fue determinar la dependencia micorrícica de barcino (Calophyllum brasiliense Cambers). Para lo cual se utilizó un diseño experimental completamente al azar. Los tratamientos tuvieron un arreglo factorial 3 x 2 con cinco repeticiones, que consistieron en la combinación de tres concentraciones de fósforo (P) en la solución del suelo (0,002, 0,02 y 0,2 mg l^-1) con 2 niveles de inoculación micorrizal de Glomus agreggatum Schenck y Smith, modificado por Koske (inoculado y no inoculado). Se emplearon como variables respuesta el contenido de P foliar en función del tiempo. Al momento de la cosecha, se determinaron la masa seca aérea (MSA), el P total absorbido (PTA) en la parte aérea, la colonización micorrizal y la dependencia micorrizal (DM). Los resultados indican que el contenido de P foliar no tuvo variaciones significativas en relación a la inoculación micorrizal. El contenido de P total absorbido no varió al igual que la masa seca aérea. No se presentó colonización micorrizal en ninguno de los tratamientos. Finalmente, no hubo dependencia micorrizal con G. agreggatum de barcino, ubicando a esta especie dentro de la categoría independiente, al menos en las condiciones del estudio.

Palabras clave: dependencia micorrizal, fósforo, Calophyllum brasiliense, Glomus agreggatum.

Abstract

A greenhouse bioassay was carried out to determine the mycorrhizal dependency of barcino (Calophyllum brasiliense Cambers), using a completely randomized experimental design. Treatments were arranged in a 3 x 2 factorial design with five repetitions, that consisted of combinations of three concentrations of phosphorus (P) in the soil solution (0.002, 0.02, and 0.2 mg l^-1), with two levels of mycorrhizal inoculation with Glomus agreggatum Schenck and Smith, modified by Koske (inoculated and not innoculated). Leaf P content as a function of time was the response variable. Shoot dry matter (MSA), shoot P content (PTA), mycorrhizal colonization of roots, and mycorrhizal dependency (DM) were measured at harvest. The results indicated that foliar P content did not vary significantly with micorrizal inoculation. The total P content absorbed did not vary, nor did aerial dry mass. Micorrizal colonization with G. agreggatum was not documented in any of the treatments. Finally, barcino showed no mycorrhizal dependence to G. aggreggatum, placing this species in the independent category, at least under the conditions of this study.

Key words: mycorrhizal dependency, phosphorous, Calophyllum brasiliense, Glomus agreggatum.

INTRODUCCIÓN

Las micorrizas son asociaciones simbioticas beneficas entre las raices de las plantas y algunos hongos del suelo, se cree que estos hongos forman mutualismos con el 95% de las plantas terrestres (Sanchez 1999). Existen varios tipos de hongos micorricicos (ectomicorrizas, endomicorrizas y ectendomicorrizas) que se diferencian entre si por sus caracteristicas morfo-anatomicas, y por las plantas hospederas que colonizan (Brundrett 2002, Silvia et al. 2005). Las endomicorrizas o hongos micorrizo arbusculares (HMA), son el grupo mas representativo formando asociaciones con el 80% de las especies de plantas, principalmente tropicales (Schusler et al. 2001, Silvia et al. 2005). Son varios los beneficios para las plantas derivados de la simbiosis, por ejemplo, se incrementa la captacion de nutrientes por parte de la planta, especialmente P, Cu, y Zn (Bolan 1991, Johansen et al. 1993, Jakobsen et al. 1992b, Sieverding 1991), se mejora la estructura del suelo, se aumenta la resistencia de la planta al estres biotico y abiotico, se favorece las interacciones con otros microorganismos beneficos (Barea et al. 2002, Elsen et al. 2003, Haselwandter y Bowen 1996, Johansson et al. 2004, Mansfeld et al. 2002, Sieverding 1991). Pero no todas las plantas reciben estos beneficios debido a que no realizan simbiosis con los HMA, o pueden hacerlo con diferente intensidad. En este sentido, Plenchette et al. (1983) determinaron que la dependencia micorrizal (DM) varia para cada especie, definiendo asi DM como el grado en el cual una especie de planta es dependiente sobre la condicion micorrizal para producir su maximo crecimiento o rendimiento con un nivel de fertilidad de suelo dado. Numerosos estudios de DM se han realizado utilizando la formula de Plenchette et al. (1983), en Colombia se registran algunos articulos con especies de plantas nativas e introducidas como Coffea arabiga (Jaramillo y Osorio 2009), Ocotea sp. (Sierra et al. 2009), Persea americana (Montoya y Osorio 2009) y Solanum quitoense (Gonzalez y Osorio 2008). A pesar de su reconocida importancia, es poco lo que se conoce sobre DM en especies arboreas nativas, este dato seria fundamental si queremos profundizar en el manejo efectivo de las especies autoctonas, como por ejemplo para usos en restauracion, conservacion ex situ, enriquecimiento de bosques entre otros. En este sentido, se escogio para el estudio de DM a la especie Calophyllum brasiliense Cambess., arbol perteneciente a la familia Clusiaceae, de gran importancia ecologica y etnobotanica, que se encuentra en el interior de bosques maduros o secundarios muy maduros hasta los 2.100 m de altitud, su uso y tala la han llevado a un dramatico descenso de sus poblaciones (Vargas 2002), siendo prioritario su repoblamiento. Por tal motivo, el objetivo principal del presente estudio fue determinar la dependencia micorricica de barcino (C. brasiliense).

MATERIALES Y METODOS

Sitio de estudio. El experimento de dependencia micorrizal (DM) se realizo en el invernadero de la Universidad Catolica de Oriente, Rionegro (Antioquia), Colombia (6° 9' 15,2'' N, 75° 22' 10,4'' O y altitud de 2.112 m). El sitio presenta, una temperatura promedio de 17 °C y una precipitacion anual de 1.700 mm y se ubica en la zona de vida bosque humedo montano bajo (Holdridge 1978).

Metodologia. Suelo. El suelo utilizado para el experimento correspondio a una muestra del horizonte subsuperficial (Bw) de un andisol de la estacion experimental Piedras Blancas (6° 15' 38'' N, 75° 30' 23'' O; altitud 2.484 m), para reducir la influencia del fosforo (P) organico sobre el P disponible. El suelo se seco al aire y se tamizo a 4 mm y luego se analizo en el Laboratorio de Suelos de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellin. El pH del suelo se ajusto a 5,9 con 2 g de CaCO₃ por kg de suelo para evitar niveles altos de aluminio y optimizar la solubilidad de P. Para determinar el requerimiento de cal se realizo una curva de incubacion con CaCO₃ (Uchida y Hue 2000). El suelo se esterilizo con vapor a 80 °C durante una hora. La fertilizacion del sustrato consistio en la adicion de (mg kg ^-1): urea 0,17, CaSO₄ 2H₂O 0,73, MgSO₄. 7H2O 0,93, y K₂SO₄ 0,21. Asimismo, se aplico P en forma de KH₂PO₄ para obtener tres concentraciones de P en la solucion del suelo 0,002-0,02 y 0,2 mg l^-1 segun lo propuesto por Habte y Manjunath (1991). Para este fin se realizo una isoterma de adsorcion de P de acuerdo al metodo de Fox y Kamprath (1970) cuyos resultados se muestran en la (figura 1). Las cantidades de KH₂PO₄ fueron 2-3,8 y 17,6 g kg^-1. Luego, el sustrato esteril y fertilizado se trasfirio a bolsas plasticas con dimensiones de 13 cm de diametro y 19,5 cm de alto.

Cada unidad experimental recibio quincenalmente la solucion nutritiva Hogland libre de P a las siguientes dosis (mg l^-1): N 50, K 132, Mg 106, S 204, Zn 10, Cu 5, B 0,8 y Mo 0,5. El sustrato se mantuvo entre un 50-60% de la maxima capacidad de retencion de agua (39 y 47%, respectivamente), para lo cual se aplico agua corriente o la solucion nutritiva mencionada.

Muestras biologicas. La especie utilizada en el experimento fue barcino (Calophyllum brasiliense Cambess.) perteneciente a la familia Clusiaceae. Semillas de barcino fueron suministradas por Corantioquia (Programa de conservacion de flora y fauna) y se obtuvieron de una fuente semillera identificada ubicada en el municipio de Jardin (Antioquia), Colombia. Todas las semillas se lavaron con agua destilada, se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1%, se trasfirieron a bandejas de germinacion (temperatura ambiente) que contenian arena esterilizada hasta su germinacion. Una vez germinadas cada plantula de barcino se trasplanto a potes plasticos que contenian arena esteril donde permanecieron hasta alcanzar 10 o 15 cm de altura, para posteriormente pasarlas a bolsa plastica en su respectiva unidad experimental.

Se utilizo un inoculo puro de Glomus agreggatum Schenck y Smith modificado por Koske de efectividad comprobada, el cual contenia esporas, fragmentos de raices infectadas e hifas del hongo suspendidas en una matriz solida compuesta por suelo y cuarzo (1:1). El inoculo tuvo 8.500 propagulos micorrizales infectivos por kg de suelo determinado por el metodo del numero mas probable (NMP) (Porter 1979). Este hongo fue originalmente suministrado por M. Habte de la Universidad de Hawaii (Honolulu, U. S. A.) y multiplicado en raices de sorgo y kudzu (Habte y Osorio 2001). Su efectividad para incrementar la absorcion de P y el crecimiento vegetal en suelos con bajo contenido de P soluble ha sido comprobada por Gonzalez y Osorio (2008), Jaramillo et al. (2004) y Osorio et al. (2008). Al momento de la siembra, 20 g de inoculo crudo de G. aggregatum por kg de suelo se mezclaron uniformemente en cada unidad experimental. El suelo no inoculado recibio 20 g de suelo esteril por kg, ademas de filtrados de una suspension del inoculo crudo (10%) luego de remover las estructuras de los hongos con papel filtro Schleicher y Schuell (tamano de poro: 2 µm).

Tratamientos. Se utilizo un diseno experimental completamente al azar. Los tratamientos tuvieron un arreglo factorial 3 x 2 con cinco plantulas por tratamiento; los tratamientos consistieron en la combinacion de tres niveles de P (0,002-0,02 y 0,2 mg l^-1) con 2 niveles de inoculacion micorrizal de G. agreggatum (inoculado y no inoculado).

Se realizaron mediciones periodicas del contenido de P en las hojas jovenes completamente maduras (Habte y Osorio 2001). Para tal fin, una porcion circular del tejido foliar se removio con un perforador (6 mm de diametro) (figura 2). El contenido de P se expreso en terminos de µg por disco de hoja. El P fue determinado por el metodo del azul de molibdato (Murphy y Riley 1962) luego de reducir los discos de hoja a cenizas en mufla a 500 °C por 3 h. Este metodo de muestreo no destructivo fue originalmente propuesto por Aziz y Habte (1987).

Al final del periodo de crecimiento de las plantas se cosecho la parte aerea de las plantulas. Las muestras se llevaron a estufa y se secaron a 60 °C durante 72 horas. Luego se determino la masa seca aerea (MSA). EL fosforo total absorbido (PTA) en la parte aerea fue determinado al final de la cosecha como se describio anteriormente. Para esto se utilizo la concentracion de P en el disco de hoja al momento de la cosecha (Habte et al. 1987). Para la colonizacion micorrizal (CM) las raices finas de las plantas se sometieron a KOH para aclaracion de las raices (Phillips y Hayman 1970), luego se tineron con fucsina acida (Kormanik et al. 1980) y posteriormente se determino la colonizacion micorrizal siguiendo el metodo del intercepto de cuadricula propuesto por Giovannetti y Mosse (1980). Con los datos de masa seca total (masa seca aerea), se determino la dependencia micorrizal (DM) usando para ello la formula propuesta por Plenchette et al. (1983). La DM se clasifico de acuerdo a lo propuesto por Habte y Manjunath (1991):

Analisis estadistico. Los datos obtenidos se sometieron al analisis de varianza (prueba F) para determinar si existian diferencias significativas en funcion de los tratamientos. La prueba de la diferencia minima significativa (LSD) se uso para separar promedios con respecto al control no inoculado en cada uno de los niveles de P. Para los analisis estadisticos se empleo un nivel de significancia (P) ≤ 0,05 y se utilizo el paquete estadistico StatGraphics version 4.0.

RESULTADOS Y DISCUSION

El sustrato de crecimiento arrojo los siguientes resultados: arena 92%, limo 4%, arcilla 4%, textura A (Bouyucos), pH 5,7 (agua, 1:1, V:V ), materia organica 11% (Walkley y Black), calcio, magnesio y potasio, 1,7-0,1 y 0,05 cmol_c kg^-1 (acetato de amonio 1M, pH 7), respectivamente; fosforo 1 mg kg^-1 (Bray II); hierro, manganeso, cobre y zinc 64, 1,1 y 1 mg kg^-1 (Olsen-EDTA); boro no detectable mg kg^-1 (agua caliente); nitrato 3 mg kg-1 (sulfato de aluminio 0,025M) y amonio 18 mg kg^-1 (KCl 1M).

Con respecto a la inoculacion micorrizal con G. agreggatum, esta no tuvo efectos significativos sobre el contenido de P foliar en barcino en los niveles de P evaluados en la solucion de suelo y para todas las fechas de muestreo. En la figura 3, se aprecia que no existen diferencias entre los tratamientos inoculados y no inoculados cuando se compara un mismo nivel de P. Por otro lado, cuando se comparan las concentraciones diferentes de P (0,2-0,02 y 0.002 mg l^-1), la concentracion de P en la solucion del suelo de 0,2 mg l^-1 incremento significativamente el contenido de P foliar (independientemente si el tratamiento estaba inoculado) en todos los dias de muestreo con valores superiores a 2,6 µg/disco, resultado diferente de las otras concentraciones de P con valores inferiores a 1,8 µg/disco (figura 3). La concentracion de P en la solucion de suelo de 0,2 mg l^-1 reflejo incrementos significativos en el P foliar, aunque dichos incrementos no se manifestaron en el crecimiento vegetal cuando se evaluo su masa (figura 4), resultados similares fueron observados en Retrophylum rospigliosii en el mismo nivel de P (0,2 mg l^-1) que a pesar de una alta concentracion de P foliar no hubo aumento de su masa (Osorio et al. 2008).

La MSA no presento diferencias significativas entre M y MN para los diferentes niveles de P (figura 4). Sin embargo, al comparar entre niveles de P, se encontro que en la medida que P en solucion incremento, la MSA fue significativamente menor (figura 4). El fosforo total absorbido tampoco presento diferencias significativas respecto a la inoculacion (M y NM) para los diferentes niveles de P (figura 4). No se encontro colonizacion micorrizal en C. brasiliense, ya que no se detectaron estructuras de G. agreggatum en ninguno de los tratamientos evaluados. En cuanto a la dependencia micorricica de barcino con G. agreggatum se obtuvo diferencias negativas aplicando la formula de Plenchete et al. (1983) lo cual da como resultado independencia micorrizal, por lo menos en cuanto a la especie micorricia utilizada (tabla1).

Los resultados concuerdan con algunos estudios realizados en bosques humedos tropicales, en donde las especies pioneras y secundarias iniciales estan mayormente influenciadas por la simbiosis micorrizal que las especies secundarias tardias y las climax (Siqueira y Saggin-Junior 2001, Zangaro et al. 2000, 2003), es de anotar, que barcino pertenece al grupo ecologico de las climax (Kageyama y Viana 1989).

Los niveles bajo e intermedio de P disponible (0,002 y 0,02 mg l^-1) solo tuvieron ligeras variaciones sobre la MSA, lo que indica la gran adaptacion de esta especie a suelos con bajo contenido de P. Incluso, el sistema radicular vario con respecto al contenido de P, en el nivel mas alto, las raices se afectaron tanto en tamano como en numero y en vigor (figura 5).

Es explicable el crecimiento reducido en el nivel mas alto, debido a que el habitat en que crece C. brasiliense, siendo una especie de interior de bosque andino adaptada a suelos pobres en P; la cual en condiciones de P a un nivel superior al normal para la planta, pudo llevar a causar un efecto de toxicidad, afectando negativamente el crecimiento; ademas, la mayoria de las plantas toman el P inorganico del suelo, ya sea una planta micorrizada o no micorrizada sin afectar la fraccion organica (Bolan 1991), lo que permite inferir la saturacion de P al nivel mas alto (0,2 mg/l). Es bueno resaltar que, en general existe mayor incremento en el crecimiento vegetal cuando se adicionan a las plantas bajas dosis de P soluble, e incluso se manifiestan cambios cuando se aplica la misma cantidad de P soluble pero con diferente fuente de fertilizante (Bolan 1991).

En conclusion, no se presento colonizacion micorrizal en ninguno de los tratamientos, ni dependencia micorrizal con G. agreggatum en barcino, lo cual ubica a esta especie dentro de la categoria independiente, al menos en las condiciones del estudio. No se sabe aun si C. brasiliense responderia de la misma forma con otras especies de HMA, o con inoculos multiesporicos.

La informacion aqui presentada, sera de utilidad para todas las personas e instituciones interesadas en propagar masivamente a la especie C. brasiliense, ya que, define algunos aspectos de las relaciones simbioticas de la misma.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue realizado gracias a la financiacion y apoyo de la Direccion de Investigacion y Desarrollo de la Universidad Catolica de Oriente, en coordinacion con la Unidad de Biotecnologia Vegetal de la misma universidad. Ademas, se agradece muy especialmente a todos los integrantes del Grupo de Microbiologia de Suelos de la Universidad Nacional Sede Medellin, quien con su apoyo permitieron llevar a feliz termino la presente investigacion.

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