ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN

doi: 10.17533/udea.acbi.v38n105a01

Actividad antiplasmodial y antibacterial in vitro de extractos de la corteza de Erythrina fusca Lour. (Fabaceae)

Antiplasmodial and antibacterial in vitro activity from extracts the bark of Erythrina fusca Lour. (Fabaceae)

Donys Jiménez-Acosta^1,4, Rita Márquez-Vizcaíno^1,5, Catalino de la Rosa-Torres², Adriana Pabón-Vidal³

1 1 Grupo de Investigación en Productos Naturales (GIPNUS), Departamento de Biología, Facultad de Educación y Ciencias, Universidad de Sucre. Sincelejo (Sucre), Colombia.

2 Grupo de Investigación Fitoquímica (GIF), Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad del Atlántico. Barranquilla (Atlántico), Colombia. catalinodelarosa@mail.uniatlantico.edu.co

3 Grupo de Investigación Malaria, Universidad de Antioquia. A. A. 1226. Medellín (Antioquia), Colombia. adriana.pabon@udea.edu.co

Correos electrónicos: 4 dja141@yahoo.es; 5 fitorita@yahoo.es.

Recibido: agosto 2015; aceptado: marzo 2016 (Received: August 2015; accepted: March 2016).

Resumen

El tamizaje fitoquímico del extracto en etanol de la corteza seca de Erythrina fusca Lour. (Fabaceae), determinó la presencia de alcaloides, flavonoides, terpenos y quinonas. Las fracciones en cloroformo y acetona del extracto en etanol de la corteza seca de E. fusca, presentaron actividad antiplasmodial in vitro en las cepas NF54 y FCB-2 de Plasmodium falciparum, con concentración inhibitoria (IC₅₀) de 12,95, 18,02, 16,60 y 28,36 μg/ml y porcentajes de inhibición promedio máximo de 70,72, 69,74, 87,07 y 85,73%, respectivamente. El extracto en etanol mostró efecto antibacteriano in vitro a la concentración de 20 mg/ml sobre la cepa de Staphylococcus aureus y la fracción en cloroformo a la misma concentración sobre Bacillus subtilis, Pseudomona aeruginosa y Staphylococcus aureus.

Palabras clave: Bacillus subtilis, Erythrina fusca , Plasmodium falciparum, Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus.

Abstract

The phytochemical screening of ethanol extract of the dried bark of Erythrina fusca Lour. (Fabaceae), determined the presence of alkaloids, flavonoids, terpenes, and quinones. The chloroform and acetone fractions of ethanol extract of the dried bark of E. fusca, presented a moderate antiplasmodial activity in NF54 and FCB-2 strains of Plasmodium falciparum with IC₅₀ of 12.95, 18.02, 16.60, and 28.36 μg/ml, and a percentages inhibition of maximum average 70.72, 69.74, 87.07, and 85.73%, respectively. The ethanol extract showed inhibition at the concentration of 20 mg/ml for the strain of Staphylococcus aureus and chloroform fraction at the same concentration on Bacillus subtilis, Pseudomona aeruginosa, and Staphylococcus aureus.

Key words: Bacillus subtilis, Erythrina fusca , Plasmodium falciparum, Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus.

INTRODUCCIÓN

La Organización Mundial de la Salud (OMS), registró que en el año 2013 se presentaron a nivel mundial 198 millones de casos clínicos de malaria, de los cuales 584.000 fueron mortales. Además, informó que 3.200 millones de personas viven en regiones de alto riesgo para su transmisión, lo que hace de esta enfermedad la principal causa de morbilidad y mortalidad en más de 90 países ubicados en las regiones tropicales y subtropicales del mundo, especialmente en la región al sur del Sahara en África, el sudeste de Asia y Latinoamérica (WHO 2014). Esta enfermedad infecciosa es producida por parásitos del género Plasmodium; su tratamiento ha sido realizado con diversos medicamentos que actúan sobre los estadíos eritrocíticos del parásito, entre los cuales se encuentra la quinina, un alcaloide aislado a partir de especies del género Cinchona (Rubiaceae) y otros derivados sintéticos desarrollados posteriormente que han mostrado ser más efectivos, menos tóxicos y de bajo costo (Arango et al. 2006).

La resistencia de los Plasmodium a los fármacos comúnmente utilizados para el tratamiento, se constituye en uno de los principales obstáculos para el control de la enfermedad en muchas partes del mundo (Carrillo y Díaz 2005). Por ello, es necesario desarrollar nuevas sustancias con mayor efectividad antiparasitaria y con menos efectos adversos, recurriendo de esta manera a la investigación en productos naturales apoyada en los conocimientos tradicionales, que distintos grupos humanos han acumulado a lo largo de generaciones, sobre los efectos curativos de las plantas (Taborda y Cuca 2005). De esta forma, el reconocimiento y validación de la medicina tradicional con toda su carga de experiencia práctica, tradiciones, usos y costumbres, pueden conducir al desarrollo de nuevos medicamentos antimaláricos derivados de plantas. Por lo tanto, aquellas plantas que presentan mayor frecuencia de uso en la medicina tradicional por sus propiedades antimaláricas, deben ser estudiadas con el fin de determinar su eficacia y evaluar su potencial como fuente importante de nuevos medicamentos (Carrillo y Díaz 2005).

El género Erythrina (Fabaceae), ha sido ampliamente usado en la medicina tradicional para el tratamiento de varias enfermedades, especialmente infecciones microbianas (Pillay et al. 2001). Estas plantas son conocidas por ser una fuente rica de alcaloides bioactivos (Pino et al. 2004), flavonoides, flavonas, isoflavonas y pterocarpanos (Chacha et al. 2005). Algunos de estos flavonoides encontrados exponen una variedad de actividades biológicas, como antimicrobiana (Chacha et al. 2005, Sato et al. 2003, Tanaka et al. 2002, Yenesew et al. 2005), anti-inflamatoria (Njamen et al. 2003) y antiplasmodial (Andayi et al. 2006).

Por otra parte, con base en la gran diversidad de estas especies vegetales, las cuales pueden poseer amplio potencial bioquímico, es importante valorar su efecto biológico por medio de la investigación, ya que muchas plantas contienen sustancias que podrían permitir nuevos usos, especialmente en la medicina (Campos et al. 2005), en el tratamiento de muchas enfermedades como las transmitidas por vectores. La búsqueda de nuevas fuentes en estas sustancias, preferiblemente de origen vegetal, se ha convertido en un reto para la comunidad científica, porque además de aprovechar de modo razonable los recursos naturales, ayudaría a mejorar las condiciones de vida (Puertas et al. 2009).

Dada la efectividad que tienen las plantas del género Erythrina como fuente medicinal, se planteó investigar con el propósito de documentar la importancia relativa de esta especie vegetal y contribuir al conocimiento de la flora propia de la región; razón por la cual se evaluó la actividad antiplasmodial y antibacterial in vitro del extracto en etanol y fracciones de la corteza seca de Erythrina fusca Lour. contra parásitos intracelulares de Plasmodium falciparum resistentes y sensibles a cloroquina y bacterias Gram positivas Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus, y Gram negativas Pseudomona aeruginosa.

MATERIALES Y MÉTODOS

Recolección del material vegetal. El material vegetal (corteza), fue recolectado en el campus de la Universidad de Sucre sede puerta roja, área urbana de la ciudad de Sincelejo, a 212 m. s. n. m. con una temperatura media de 28 °C. La recolección se realizó durante la época de floración (enero-febrero), en horas de la tarde. La especie vegetal fue identificada como Erythrina fusca Loureiro; un ejemplar se encuentra depositado en el Herbario de la Universidad de Sucre bajo el número 364798. El material vegetal en buen estado fue seleccionado, secado a temperatura ambiente durante 15 días y posteriormente sometido a un proceso de molienda.

Proceso de extracción. Se extrajeron por percolación 500 g del material vegetal (corteza) seca y molida con etanol al 96% a temperatura ambiente durante 8 días. El extracto obtenido fue filtrado y concentrado a presión reducida y secado al vacío sin calor (Mesa et al. 2007).

Identificación cualitativa de metabolitos secundarios. El reconocimiento de los metabolitos secundarios presentes se realizó tomando 10 g de extracto seco y otros 15 g de extracto fueron sometidos a extracción sólido-líquido con cloroformo y acetona obteniéndose dos fracciones, las cuales fueron monitoreadas por cromatografía en capa delgada revelando las placas con una solución de vainillina/ H₂SO₄ (Mesa et al. 2007).

Ensayo de citotoxicidad. El extracto y fracciones fueron evaluados por el micrométodo enzimático MTT bromuro de 3-(4,5 dimetiliazol-2-il)-2-5-difeniltetrazolio en células promonocíticas humanas U-937, siguiendo la metodología descrita por Mosmann (1983), el cual revela daños celulares a nivel mitocondrial. El MTT que es de color amarillo es reducido por las células metabólicamente activas, en parte por la acción de enzimas deshidrogenasas, generando equivalente reducidos tales como NADH y NADPH que dan como resultado la formación de cristales de formazán, un compuesto de coloración violeta que es solubilizado y cuantificado por espectrofotometría a 570 nm. El ensayo fue realizado por triplicado, y los resultados se analizaron con el programa estadístico Graphpad Prisma para obtener las concentraciones citóxicas 50 (CC₅₀).

Actividad antiplasmodial. Se determinó la actividad antiplasmodial del extracto y de las fracciones de acuerdo al método de fluorescencia con SYBR GREEN (Smilkstein et al. 2004). Las cepas del parásito P. falciparum fueron cultivadas siguiendo el método descrito por Trager y Jensen (1976) y modificado por el grupo de investigación Malaria de la Universidad de Antioquia (2004). La fluorescencia se midió en un espectrofluorómetro (excitación 485 nm y emisión 538 nm). El resultado de la actividad antiplasmodial se determinó mediante el cálculo del porcentaje de inhibición del crecimiento de los parásitos para cada concentración de los extractos. La concentración inhibitoria del 50% (IC₅₀; concentración que inhibe el 50% del crecimiento de los parásitos) se calculó con el programa Graphpad Prism versión 5.0.

Evaluación de la actividad antibacterial. Una vez realizada la prueba de sensibilidad de los microorganismos Bacillus subtilis, Pseudomona aeruginosa y Staphylococcus aureus (cepas ATCC) frente a extracto y fracciones, se determinó la actividad antibacterial por el método de difusión en agar, evaluando las concentraciones de 5, 20, 40 y 60 mg/ml, usando como control negativo dimetilsulfóxido (DMSO) y amikacina (5 mg/ml) como control positivo. El porcentaje del efecto inhibitorio relativo de cada extracto respecto al control positivo se calculó de acuerdo a Márquez et al. (2005):

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los ensayos de caracterización cualitativa realizados al extracto en etanol de la corteza seca de E. fusca, indican la presencia de metabolitos secundarios tipo alcaloides, flavonoides, terpenos y quinonas, los cuales se encuentran registrados dentro de la fitoquímica del género Erythrina (Calle et al. 1997, Chacha et al. 2005). Estos compuestos, exhiben interesantes actividades biológicas como antimicrobiana (Chacha et al. 2005, Sato et al. 2003, Tanaka et al. 2002, Yenesew et al. 2005), anti-inflamatoria (Njamen et al. 2003) y antiplasmodial (Andayi et al. 2006).

La citotoxicidad y la actividad de las fracciones en cloroformo y acetona se muestran en la tabla 1. Los resultados muestran que la fracción clorofórmica es más tóxica que la fracción en acetona. Frente a la cepa NF54 de P. falciparum sensible a la cloroquina muestra porcentaje de citotoxicidad de 12,95 μg/ml que le atribuye actividad moderada de acuerdo al criterio de clasificación de Deharo et al. (2000) quienes sugieren que valores de IC₅₀ > 10 μg/ml son clasificados como moderadamente activo.

El efecto antiplasmodial in vitro de los extractos de la corteza seca de E. fusca no ha sido establecido anteriormente; estos resultados, enfatizan la importancia de evaluar nuevas drogas antimaláricas a partir de un enfoque etnobotánico, basados en el uso tradicional de las plantas medicinales. Además, contribuyen a ampliar el conocimiento de las posibles propiedades o potencialidades terapéuticas que podemos encontrar en nuestra flora para el tratamiento de algunas patologías comunes debido a que son mucho más económicas y accesibles; no existen registros que indiquen resistencia de los extractos totales de las plantas, posiblemente debido a la acción sinérgica de los diversos constituyentes; y es posible que la fitoterapia produzca menos efectos adversos que la quimioterapia (Willcox y Bodeker 2000).

La actividad antiplasmodial de algunas especies de este mismo género ha sido investigada previamente. Yenesew et al. (2004) encontraron que el extracto en acetato de etilo de la corteza de E. abyssinica mostró actividad antiplasmodial in vitro con IC₅₀ de 7,9 ± 1,1 y 5,3 ± 0,7 μg/ml en las cepas D6 (sensible a CQ) y W2 (resistente CQ) de P. falciparum, respectivamente. A partir de este extracto, lograron aislar una nueva chalcona: 20,3,4,40-tetrahidroxi-5-prenylchalcona y una nueva flavanona: 40,7-dihidroxi-30-metoxi-50-prenylflavanona. Estos compuestos parecen ser los responsables de la actividad antiplasmodial del extracto. Por otra parte, Andayi et al. (2006) encontraron que los extractos en acetona de la corteza de la raíz y del tallo de E. sacleuxii presentaron actividad antiplasmodial en las cepas D6 (para la raíz IC₅₀ = 1,34 ± 0,3 μg/ml y tallo IC₅₀ = 6,3 ± 1,4 μg/ml) y W2 (IC₅₀ = 2,2 ± 0,6 μg/ml e IC₅₀ = 3,8 ± 0,9 μg/ml) de P. falciparum. Según los investigadores, la actividad de los extractos es atribuida a los flavonoides e isoflavonoides, de los cuales, lograron aislar la 7-hidroxi-4 'metoxi-3'-prenylisoflavona.

Evaluación de la actividad antibacterial. Los resultados de la prueba de sensibilidad bacteriana revelaron que B. subtilis, P. aeruginosa y S. aureus presentaron inhibición de crecimiento en el extracto etanólico (EtOH) y la fracción en cloroformo (CHCl₃), siendo estos microorganismos y extractos seleccionados para el ensayo de difusión en agar. Las tablas 2 y 3 muestran los promedios de los diámetros del halo de inhibición y los porcentajes de inhibición relativos de las bacterias en la prueba de difusión en agar con el extracto en etanol y fracción en cloroformo.

El extracto etanólico y la fracción clorofórmica mostraron mayores halos de inhibición en S. aureus (23,29 mm) y (27,04 mm) a la concentración de 20 mg/ml y P. aeruginosa (19,63 mm) y (22,94 mm) a la concentración de 40 mg/ml, respectivamente. El análisis de varianza que se aplicó a estos resultados indica que existen diferencias altamente significativas (P ≤ 0,0001) entre los extractos y las concentraciones evaluadas. La actividad fue positiva en todos los tratamientos, teniendo mayor efecto inhibitorio la fracción clorofórmica sobre las bacterias B. subtilis, P. aeruginosa y S. aureus a las diferentes concentraciones ensayadas. Estos resultados positivos coinciden con los obtenidos por Calle et al. (1997), quienes encontraron que los extractos evaluados (etanólico, cloruro de metileno, acetato de etilo e isobutanólico), fueron activos frente a B. subtilis, K. pneumoniae, S. typhymurium y S. aureus. Se conoce que la actividad antibacteriana está relacionada con los metabolitos secundarios tipo terpenos, alcaloides y flavonoides (Prego et al. 1999); los que de acuerdo al tamizaje fitoquímico realizado al extracto de la corteza seca de E. fusca se encuentran presentes en este.

CONCLUSIONES

La fracción clorofórmica del extracto de la corteza seca de E. fusca es más toxica que la fracción en acetona. Frente a la cepa NF54 muestra porcentaje de citotoxicidad de 12,95 μg/ml que le atribuye actividad moderada frente a esta cepa de acuerdo al criterio de clasificación de Deharo et al. (2000) quienes sugieren que un valor de IC₅₀ > 10 μg/ml es clasificado como moderadamente activo. La fracción clorofórmica o de mediana polaridad presentó el mayor porcentaje de inhibición relativo sobre S. aureus (90,00%) y B. subtilis, (84,80%), a la concentración de 20 mg/ml.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue realizado con el apoyo financiero de la Universidad de Sucre y Universidad de Antioquia (a través de su programa estrategia de sostenibilidad). Los autores agradecen de forma especial a Silvia Blair Trujillo, integrante del grupo de investigación Malaria de la Universidad de Antioquia por la lectura crítica del documento.

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