INTRODUCCIÓN
La malaria continúa siendo una de las mayores causas de morbilidad y mortalidad en países tropicales y subtropicales del mundo, se estima que alrededor de 3,3 billones de personas se encuentran en riesgo de contraerla (Centers for Disease Control and Prevention [CDC], 2017). esta enfermedad es causada por parásitos del género Plasmodium, que se transmiten al humano a través de la picadura de mosquitos hembras infectadas del género Anopheles (World Health Organization [WHO], 2019). Ocho especies de Plasmodium spp. son las causantes de la malaria en los humanos, P. brasilianum, P. cynomolgi, P. falciparum, P. knowlesi, P. malariae, P. ovalae, P. simium y P. vivax (Brasil et al., 2017; Lourenço-de-Oliveira y Deane, 1995), siendo P. falciparum y P. vivax los más comunes.
En Colombia, durante el año 2019 se registraron 78.513 casos de malaria; Antioquia ocupó el cuarto lugar después de los departamentos de Choco, Nariño y Córdoba, con 7076 casos, registrándose un aumento significativo con respecto al año 2018 donde se reportaron 5415 casos (Instituto Nacional de Salud [INS]-SIVIGILA, 2019).
El género Anopheles incluye 8 subgéneros y 472 especies descritas (CDC, 2017), de las cuales 41 son consideradas vectores de malaria en el mundo (Sinka et al., 2012). En Colombia hay presencia de cinco subgéneros (Harbach, 2018) y entre ellos hay aproximadamente 47 especies de Anopheles (González y Carrejo, 2009). Doce especies son consideradas vectores de malaria: An. (Nys.) nuneztovari, Gabaldon, 1940; An. (Nys.) albimanus, Wiedemann, 1920; An. (Nys.) darlingi, Root, 1926 (Herrera et al., 1987; Montoya-Lerma et al., 2011; Olano et al., 2001), An. (An.) pseudopunctipennis, Theobald, 1901; An. (Ker.) neivai, Howard, Dyar y Knab, 1913; An. (Nys.) rangeli Gabaldon, Cova-García y López, 1940; An. (An.) calderoni Wilkerson, 1991; An. (An.) neomaculipalpus Curry, 1931; An. (Nys.) oswaldoi Peryassu, 1922; An. (An.) punctimacula Dyar y Knab 1906; An. (Ker.) pholidotus Zavortink, 1973, An. (Nys.) benarrochi (Harrison et al., 2012; Herrera et al., 1987; Olano et al., 2001; Orjuela et al., 2013; Quiñones et al., 2006; Rosero et al., 2013; Ruiz-López et al., 2012).
En Colombia, debido a estudios morfológicos y moleculares principalmente, las siguientes seis especies se consideran complejos de especies: An. nuneztovari (Conn et al., 1993; Foster et al., 2013; Mirabello y Conn, 2008; Scarpassa et al., 2016; Sierra et al., 2004), An. oswaldoi (Ruiz-López et al., 2013), An. albitarsis (Ruiz-Lopez et al., 2012; Wilkerson et al., 2005), An. triannulatus (Moreno et al., 2013; Silva-do-Nascimento et al., 2006), An. pseudopunctipennis (Coetzee et al., 1999; Estrada-Franco et al, 1993a, 1993b) y An. benarrochi (Ruiz-Lopez et al., 2012).
De acuerdo con la información suministrada por Secretaría Seccional de Salud y Protección Social de Antioquia [DSSA] (2001), en el departamento de Antioquia se registran 23 especies de Anopheles, la mayoría de ellas en Urabá, y Bajo Cauca. En el municipio de Turbo hay 13 especies registradas (González y Carrejo, 2009), de las cuales ocho especies son consideradas vectores (González y Carrejo, 2009). Además de la presencia de cuatro miembros de complejos de especies: An. oswaldoi s.l., An. nuneztovari s.l., An. pseudopunctipennis s.l. y An. triannulatus s.l. (González y Carrejo, 2009).
El objetivo de esta investigación fue determinar las especies de Anopheles spp. presentes en las áreas endémicas de transmisión de malaria en Turbo, Antioquia y evaluar su infección natural con Plasmodium spp.
MATERIALES Y MÉTODOS
Zona de estudio y recolectas entomológicas de adultos
El estudio se realizó en la zona rural del municipio de Turbo, en las veredas El Olleto (8°22´03,5´´ N, 76°32´59,4´´ W) y La Islita (8°20´37,4´´ N, 76°33´05,8´´ W) (Figura 1). El muestreo entomológico consistió en cuatro recolectas realizadas cada tres meses, incluyendo temporadas secas y lluviosas (septiembre y noviembre de 2015; marzo y junio de 2016), tres días por cada vereda, en dos viviendas por día; cada vivienda se monitoreaba durante 4 horas, lo que significó un esfuerzo de muestreo de 96 horas. En cada recolecta, las capturas de mosquitos adultos se realizaron en el intradomicilio y peridomicilio, con cebo humano protegido, utilizando un aspirador bucal. Así mismo, se utilizaron trampas de luz tipo CDC, de las 18:00 a las 06:00 horas. Adicionalmente, entre las 18:00 y las 22:00 horas, se recolectaron mosquitos sobre animales de corral: ganado vacuno, cerdos y gallinas. Todos los mosquitos fueron sacrificados en frio, depositados de manera individual en tubos Eppendorf de 0,5 ml con la tapa perforada, guardados en bolsa hermética con sílica gel y rotulados con hora, fecha y sitio de recolecta, para posteriormente ser transportados al laboratorio del ICMT-CES.
Recolectas entomológicas de estadios inmaduros y descripción de criaderos
Todos los criaderos (cuerpos de agua) ubicados alrededor de las viviendas, en un radio de 200 m, fueron georreferenciados. Se tomaron muestras con cucharones, diez cuchareadas por cada m2 de superficie, según la metodología de la WHO (1975). Esta actividad se realizó entre las 07:00 y las 10:00 horas. Además, cada cuerpo de agua (jagüey) fue clasificado según el tamaño en: pequeños (<10 m²), medianos (10-100 m²) y grandes (>100 m²). Las larvas recolectadas fueron depositadas en viales Eppendorf de 0,5 ml, en alcohol al 95%, debidamente rotuladas y guardadas en bolsas selladas para ser transportadas al laboratorio del ICMT-CES.
Identificación morfológica
Todos los ejemplares adultos y estados inmaduros recolectados se identificaron con las claves morfológicas disponibles para Colombia (Faran, 1980; Faran y Linthicum, 1981; González y Carrejo, 2009).
Técnicas moleculares
Los mosquitos recolectados posterior a la identificación morfológica, fueron disectados en dos partes: el abdomen para la identificación molecular de cada organismo y la cabeza-tórax para evaluar infección natural con Plasmodium spp. (Álvarez et al., 2011; Ruiz-López et al., 2010). La extracción de ADN de los mosquitos que fueron identificados mediante el método de código de barras (barcoding), se realizó con el kit de extracción DNeasy Blood & Tissue Kit disponible comercialmente (QIAgen®, EE. UU.) usando el protocolo de tejido animal. La extracción de ADN para las pruebas de infectividad, se realizó con el protocolo de extracción de Chelex® (Murillo et al., 2019). El ADN extraído con ambas metodologías se almacenó a -20 ˚C en el laboratorio hasta ser utilizado.
PCR para la región COI
La amplificación del fragmento de 710 pb COI se realizó usando el par de cebadores LCO1490 y HCO2198, descritos por Folmer et al. (1994) y los parámetros y condiciones de la PCR descrita por Ruiz-Lopez et al. (2010). El producto de PCR se visualizó en gel de agarosa al 1% con 0,5 mg/ml de bromuro de etidio.
PCR para infección natural con Plasmodium spp.
El material obtenido después de extracción, se amplificó mediante PCR anidada, usando los cebadores específicos del género Plasmodium (rPLU1 y rPLU5) y (rPLU3 y rPLU4), desarrollados por Snounou y Singh (Singh et al., 1999; Snounou et al., 1993), con las condiciones de PCR previamente estandarizadas (Gutiérrez et al., 2008; Monsalve-Restrepo, et al., 2011). El producto de PCR se visualizó por medio de una electroforesis en gel de agarosa al 1%, teñido con 0,5 mg/ml bromuro de etidio.
Las muestras se enviaron a purificar y secuenciar a Macrogen (Corea del Sur) en ambas direcciones. Los cromatogramas se editaron en Sequencher 5.2.4. Las secuencias obtenidas en este estudio se compararon con las secuencias disponibles en GenBank, usando BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) y la base de datos de BOLDSYSTEMS (http://www.boldsystems.org). La diversidad de las secuencias encontradas en esta investigación, se calculó en MEGA 6.06, usando el modelo Kimura 2 Parámetros - K2P (Kimura, 1980). Con el fin de validar las identificaciones morfológicas de las especies recolectadas en esta investigación, se descargaron 240 secuencias de GenBank y se analizaron con las secuencias de esta investigación. Se generó un árbol de NeighborJoining - NJ (Saitou y Nei, 1987), usando un Bootstrap de 1000 pseudoréplicas; para dilucidar el estatus taxonómico de los complejos de especies encontradas vs secuencias en GenBank, se realizó un análisis Bayesiano en Geneious v. 10.0.9.(www.geneious.com) (Huelsenbeck y Ronquist, 2001).
RESULTADOS
Identificación morfológica de adultos
En total 121 especímenes fueron recolectados en el peridomicilio, en cebo humano protegido y en corrales de animales (vacas, cerdos y gallinas); no hubo recolectas en las trampas CDC (Tabla 1). Se identificaron por morfología cuatro especies: An. albimanus, An. triannulatus s.l., An. pseudopunctipennis s.l. y An. apicimacula s.l. Tres de la cuales pertenecen a complejos de especies y su estatus taxonómico no se encuentra claramente definido (Harbach, 2013). La especie más abundante fue An. albimanus (n=117, 96,7% del total de mosquitos identificados). Las otras tres especies presentaron muy bajas densidades: An. pseudopunctipennis s.l. (n=2), An. triannulatus s.l. (n=1) y An. apicimacula s.l. (n=1) (Tabla 1).
Especie | Número de mosquitos adultos recolectados | ||||
---|---|---|---|---|---|
El Olleto | La Islita | Total | |||
n | % | n | % | ||
An. albimanus | 56 | 48 | 61 | 52 | 117 |
An. triannulatus | 1 | 100 | - | - | 1 |
An. pseudopunctipennis | - | - | 2 | 100 | 2 |
An. apicimacula | - | - | 1 | 100 | 1 |
Total | 57 | - | 64 | - | 121 |
La mayoría de los mosquitos adultos se recolectaron entre las 18:00 y las 19:00 horas, seguido de los mosquitos recolectados durante las 19:00 y las 20:00 horas y las 20:00 y las 21:00 horas, respectivamente. Anopheles albimanus fue recolectado en las dos veredas de estudio, mientras que An. triannulatus s.l. y An. apicimacula s.l. solo fueron recolectados en una de las dos veredas evaluadas (Tabla 2).
Localidad/Año | Mes | N° total mosquitos recolectados | Hora de recolección | N° mosquitos colectados | Especie |
El Olleto/2015 | Sept | 57 | 18:00-19:00 | 21 | An. albimanus |
19:00-20:00 | 17 | An. albimanus | |||
20:00-21:00 | 12/1 | An. albimanus / An. triannulatus | |||
21:00-22:00 | 6 | An. albimanus | |||
Nov | 0 | No recolecta | 0 | (-) | |
El Olleto/2016 | Mar | 0 | No recolecta | 0 | (-) |
Jun | 0 | No recolecta | 0 | (-) | |
La Islita/2015 | Sept | 0 | No recolecta | 0 | (-) |
Nov | 42 | 18:00-19:00 | 15/2 | An. albimanus / An. pseudopunctipennis | |
19:00-20:00 | 4 | An. albimanus | |||
20:00-21:00 | 15 | An. albimanus | |||
21:00-22:00 | 6 | An. albimanus | |||
La Islita/2016 | Mar | 4 | 18:00-19:00 | 4 | An. albimanus |
19:00-20:00 | 0 | (-) | |||
20:00-21:00 | 0 | (-) | |||
21:00-22:00 | 0 | (-) | |||
Jun | 18 | 18:00-19:00 | 10 | An. albimanus | |
19:00-20:00 | 7/1 | An. albimanus / An. apicimacula | |||
20:00-21:00 | 0 | (-) | |||
21:00-22:00 | 0 | (-) |
Secuencias
COI
Se obtuvieron 31 secuencias (23 haplotipos) pertenecientes a cuatro especies y dos subgéneros: An. albimanus (n=28), An. triannulatus s.l. (n=1), An. pseudopunctipennis s.l. (n=2) y An. apicimacula s.l. (n=1). El fragmento amplificado fue de 658 pb; todas las secuencias fueron depositadas en el GenBank con los siguientes números de acceso: An. albimanus: KY921762-73, KY921776-83, KY921785-92, An. pseudopunctipennis: KY921775, An. apicimacula: KY921774 y An. triannulatus: KY921784.
La distancia intraespecífica en An. albimanus fue de 0,004 (n=28; 21 haplotipos) y de An. pseudopunctipennis s.l. fue 0,076 (n=2). Debido al tamaño tan heterogéneo encontrado en las secuencias del GenBank, todas las secuencias se recortaron a un tamaño consenso de 516 pb. para su respectivo análisis (Figura 2).
Las secuencias de esta investigación se compararon con las secuencias disponibles en el GenBank; An. albimanus y An. triannulatus s.l. mostraron una identidad de 98-99% con secuencias pertenecientes a mosquitos del departamento de Córdoba (Ahumada et al., 2016). Anopheles pseudopunctipennis s.l. mostró una identidad de 98% con secuencias de mosquitos del departamento de Córdoba (Herrera et al., 2014). Finalmente, An. apicimacula s.l. mostró una identidad 98-99% con secuencias del departamento de Córdoba y del municipio de Necoclí del Urabá antioqueño (Gómez et al., 2015) (Figura 2).
Recolección e identificación morfológica de inmaduros
Se recolectaron 65 larvas de anofelinos, que correspondieron a An. Albimanus (n=58), An. Triannulatus s.l. (n=1) y An. Apicimacula s.l. (n=6). En la vereda El Olleto se recolectaron 19 larvas, que correspondieron a An. Albimanus (n=18) y An. Triannulatus s.l. (n=1), y en la vereda La Islita, se recolectaron 46 larvas correspondientes a An. Albimanus (n=40) y An. Apicimacula s.l. (n=6). No se recolectaron larvas de An. Pseudopunctipennis s.l. en ninguna de las veredas.
Identificación de los sitios de cría para Anopheles spp.
En la vereda La Islita se encontraron siete jagüeyes (3 positivos) y en El Olleto cuatro (3 positivos), todos permanentes y creados por la comunidad para poder proveerse de agua, tanto para ellos como para los animales (Figura 3). La profundidad máxima fue de 3 m y un área aproximada entre 50 - 200 m2.
Todos los estanques estaban expuestos al sol y tenían vegetación emergente de Hydrilla spp. o estaban cubiertos por hojarasca de la vegetación circundante (Tabla 3); de los 11 jagüeyes, solo en seis, tres en cada vereda, se obtuvieron larvas de mosquitos.
Infección natural con Plasmodium spp.
Ningún espécimen de los 121 mosquitos evaluados fue encontrado infectado con Plasmodium spp, en las veredas estudiadas.
Localidad | Distancia a vivienda más cercana | Temperatura del agua (C°) | pH | Conductividad | Oxígeno disuelto | N° de larvas |
El Olleto | 210 | 32,2 a 34,1 | 8,43 | 157,3 us/cm | 8,93 mg/L | 5 An. albimanus |
100 | 32,2 a 32,6 | 7,91 | 150 us/cm | 6,52 mg/L | 10 An. albimanus | |
80 | 25,8 a 32,1 | 7,66 | 155,8 us/cm | 6,94 mg/L | 3 An. albimanus, 1 An. triannulatus | |
La Islita | 100 | 28,2 a 28,6 | 7,4 | 307 us/cm | 7,29 mg/L | 16 An. albimanus, 6 An. apicimacula |
50 | 33,3 a 34,1 | 7,4 | 259 us/cm | 7,91 mg/L | 6 An. albimanus | |
85 | 35,9 a 36,2 | 7,6 | 165,3 us/cm | 6,28 mg/L | 18 An. albimanus |
DISCUSIÓN
Anopheles albimanus, considerado uno de los principales vectores de malaria en la Américas (Scarpassa et al., 2016), posiblemente sea el responsable de la transmisión en las veredas estudiadas. Esta especie se registró en todos los meses de recolecta, siendo la más abundante en ambas veredas (96,6%); las mayores densidades se presentaron en época de lluvia entre septiembre y noviembre, y se recolectó picando al hombre en el peridomicilio entre las 18:00-20:00 horas.
Algunos autores han demostrado la presencia de An. albimanus en altitudes bajas y áreas costeras, en criaderos de aguas salobres (Coetzee et al., 1999; Estrada- Franco et al., 1993; Niño et al., 2016); sin embargo, otras investigaciones han dado cuenta de la presencia de esta especie al interior del país, en altitudes superiores a las de las costas Atlántica y Pacífica (Linley et al., 1996), sugiriendo que esta especie se puede adaptar a condiciones diferentes de las reportadas usualmente (Kitzmiller et al., 1973). Las localidades estudiadas en esta investigación se encuentran aproximadamente a 26 km del Océano Atlántico, confirmando los estudios anteriormente descritos; los criaderos encontrados fueron de aguas dulces, alejados de zonas costeras, utilizados para consumo humano y animal.
Con relación a An. triannulatus, aunque su importancia como vector en la transmisión de la malaria no es muy clara, esta es basada en la identificación de la proteína del circumsporozoíto de Plasmodium vivax, P. falciparum y P. malariae en hembras (Galardo et al., 2007; Sinka et al., 2010); sin embargo, en Colombia no se considera vector de malaria (Scarpassa et al., 1996) a pesar de haberse encontrado infectado en Antioquia y Córdoba (Naranjo-Díaz et al., 2013; Rosero et al., 2013). Anopheles triannulatus tiene hábitos antropofílicos (Peyton, 1993), alimentándose de las personas por fuera de las viviendas (Rubio-Palis, 2000); no obstante, otros estudios indican que esta especie tiene hábitos zoofílicos (Foster et al., 2013; Klein et al., 1991). En este estudio no se hallaron evidencias que puedan concluir su verdadero papel como vector en las veredas estudiadas.
Anopheles pseudopunctipennis es reconocido como uno de los principales vectores de malaria en América (Conn et al., 2002; Povoa et al., 2006). En Colombia, se ha encontrado infectado con Plasmodium, siendo catalogado como vector local de malaria (Forattini, 1962). En estudios realizados en Brasil se ha establecido que esta especie es de hábitos zoofílicos (Forattini, 1962). En estas localidades, las casas están cerca de los corrales de cerdos y ganado vacuno y las personas descansan fuera de las viviendas después de las actividades diarias, por lo que es posible que An. pseudopunctipennis se alimente sobre humanos en estas localidades de manera accidental.
Anopheles apicimacula s.l. no ha sido incriminado como vector de malaria en las Américas; en Puebla-México fue catalogado como sospechoso de la transmisión de malaria en el estudio de Martínez-Palacio (1960), citado en Rodríguez et al. (1996). Esta especie es catalogada por Fajardo y Barreto (1983) como muy zoofílico y, en lugares donde los animales domésticos son pocos, esta especie puede verse obligada a alimentarse de los humanos de manera accidental.
Complejos de especies*
Durante el desarrollo de este trabajo se encontraron cuatro especies de Anopheles: An. albimanus, An. apicimacula s.l., An. triannulatus s.l. y An. pseudopunctipennis s.l. De las especies recolectadas solo An. albimanus se considera una especie claramente definida taxonómicamente (Gutiérrez et al., 2009); las especies restantes hacen parte de complejos de especies, donde su estatus taxonómico no está correctamente definido (Harbach, 2013) (Figuras 2 y 4).
Recientes estudios han demostrado que An. triannulatus es un complejo de especies formado por An. triannulatus s.s., An. halophylus y An. triannulatus C (Moreno et al., 2013). El espécimen recolectado en este estudio presentó las características morfológicas típicas de An. triannulatus s.s. en hembras adultas, reportado en las claves disponibles (González y Carrejo, 2009; Sallum et al., 2020); sin embargo, no podríamos decir que este es An. triannulatus s.s, debido a que no encontramos secuencias de las localidades tipo de estas especies en el GenBank para su comparación (Figura 2). Este espécimen se alineó con secuencias procedentes de mosquitos del departamento de Córdoba, Colombia (Moreno et al. 2013). Como se puede observar, el estatus taxonómico de An. triannulatus no es claro para el país, sin embargo, hay evidencia que apunta que al noroccidente del país probablemente haya un grupo genéticamente relacionado con An. triannulatus s.s. (Rosero et al., 2012).
Actualmente se reconoce que An. pseudopunctipennis es un complejo de al menos tres especies A, B, C (considerando estudios con isoenzimas y citogenéticos). Los estudios que se han realizado en Colombia (Ahumada et al., 2016) no han concluido a qué especies del complejo pertenecen, solo se hace referencia que pertenecen a las poblaciones de An. pseudopunctipennis s.l. del grupo norte o de la región del Pacífico Colombiano. El espécimen recolectado en esta investigación hace parte del grupo norte de Colombia, agrupándose con secuencias presentes en el GenBank de los departamentos de Córdoba y La Guajira-Colombia (Ahumada et al., 2016; Herrera-Varela et al., 2014) (Figura 4). De acuerdo con los estudios que se han realizado en el país, en Colombia se encuentra An. pseudopunctipennis s.l. (Ahumada et al., 2016).
Anopheles apicimacula en Colombia abarca por lo menos dos especies, An. apicimacula linaje C, presente en el Caribe Colombiano y An. apicimacula P, del Pacífico Colombiano, reconocidos como linajes evolutivos independientes (Ahumada et al., 2016). El árbol de inferencia Bayesiana muestra cuatro clados de An. apicimacula s.l. (Figura 4), uno de ellos en Buenaventura, otro en Nuquí-Buenaventura, uno más en Tumaco y el otro en la zona de Urabá. El espécimen hallado en esta investigación se agrupó con secuencias de mosquitos de la región de Urabá, An. apicimacula linaje C (Ahumada et al., 2016).
Criaderos
El tamaño de los jagüeyes fue variable entre 50 - 200 m2, todos con producción larvaria muy homogénea; estos estanques tienen un objetivo en la comunidad, el cual es proveer de agua para el baño y dar de beber a los animales. Los jagüeyes presentan vegetación flotante lo que ayuda a convertir estos espacios como nichos protectores de larvas de Anopheles contra la depredación (González y Martínez, 2006). Otro factor determinante es que en los criaderos se encontraron insectos perteneciente los órdenes de Hemíptera (Noctonectidae) y Odonata, los cuales pueden actuar como depredadores de larvas de mosquitos (González, 2005; Hoyos et al., 2014) y estar desarrollando un control biológico importante en la zona.
En el caso de las especies encontradas en las dos localidades, la variación de las condiciones biológicas de cada estanque (Tabla 3) pudo haber ocasionado competencia intraespecífica, manifestándose en la variación de densidades en los diferentes estanques evaluados (González, 2005). Es importante anotar que, la Secretaría Seccional de Salud y Protección Social de Antioquia, llevo a cabo un programa de prevención y control en las veredas conocido como “Papá Luis” aplicando Bacillus sphaericus en los jagüeyes y rociando insecticidas casa a casa, como medidas para disminuir el riesgo de contraer malaria; por lo anterior, futuros estudios serán necesarios para evaluar si las bajas densidades encontradas de Anopheles spp. están relacionadas con la implementación de este programa en la región.
CONCLUSIONES
En este estudio se evidenció la presencia de cuatro especies de Anopheles: An. albimanus, An, triannulatus s.l, An, pseudopunctipennis s.l. y An, apicimacula s.l. Anopheles albimanus podría ser el principal vector de malaria en las localidades estudiadas, debido a sus densidades encontradas y su gran capacidad vectorial reportada en Colombia. Posiblemente, An. pseudopunctipennis s.l. puede jugar un papel en la transmisión de malaria en presencia de personas infectadas y con altas densidades.
Si las comunidades de estas regiones siguen desarrollando sus vidas en condiciones socioeconómicas precarias, como viviendas improvisadas, ausencia de acueducto y alcantarillado, viéndose en la obligación de construir jagüeyes, siempre va a existir el riesgo de contraer malaria, solo faltaría la presencia de personas infectadas (población migrante), para que se inicie un brote de malaria en la región.