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INTRODUCCIÓN
La Malaria ha sido clasificada como una enfermedad de control epidemiológico, causada por un protozoario parasito del género Plasmodium; los miembros de esta especie que infectan al hombre son P. falciparum, P.vivax, P. ovale, P. malarie, destacándose los dos primeras en salud pública, por ser P. falciparum el más letal y P.vivax la de mayor prevalencia [1].
Esta enfermedad es endémica en gran parte del territorio nacional, se encuentra localizada en áreas por debajo de los 1500 m.s.n.m [2]. En Colombia se reporta que durante la 31 semana epidemiológica del 2014, se presentaron 295 casos de malaria, de estos 166 por P. falciparum, 123 por P. vivax [3], mostrando así una alta morbilidad en las poblaciones humanas afectadas. Un factor que impide el control de la malaria es la resistencia a drogas antimaláricas, que es comúnmente vista en infecciones por P. falciparum aunque constantemente han sido reportados casos de resistencia en P. vivax, motivo por el cual la cloroquina permanece como la droga seleccionada para el tratamiento de la malaria, resistencia que también se ha extendido a otras drogas antimaláricas [4,5,6,7].
El artesunato, entre otros medicamentos para la cura de la malaria, es un derivado de la artemisinina; un compuesto extraído de la planta Artemisia annua, la cual ha permitido la nueva búsqueda de antipalúdicos partiendo de los conocimientos de la medicina ancestral y todo lo relacionado con la curación por medio de plantas medicinales, las cuales son una de las valiosas tradiciones de muchas comunidades [8,9,10].
Según la OMS (Organización Mundial de la Salud), el 80% de la población mundial, principalmente de países en vía de desarrollo, utilizan las plantas para el cuidado de su salud y más del 50% de los fármacos, actualmente utilizados en el mundo, tienen su origen en los productos naturales y sus derivados. Además, existe un gran potencial para encontrar nuevos medicamentos, debido a que solo el 1 % de las especies tropicales han sido estudiadas para valorar su potencial farmacéutico y la proporción es mucho menor para las especies nativas de zonas lluviosas tropicales; representando una gran reserva de posibles fármacos [11]. Éstas son una fuente de recursos terapéuticos para la obtención de compuestos utilizados para el tratamiento de diversas enfermedades parasitarias como la malaria, contribuyendo en su quimioterapia, ya sea como agentes antipalúdicos o como cabezas de serie o plantillas para el desarrollo de antimaláricos más potentes [12,13].
Tumaco es un municipio que cuenta con una gran diversidad de plantas medicinales, las cuales han sido usadas por los ancestros durante muchos años para tratar sus enfermedades. De estas plantas se han reportado estudios de actividad antiplasmodial in vitro en P. falciparum, P. vivax; e in vivo en P. berghei [14,15]. En el presente trabajo, se evaluó la actividad citotóxica y antiplasmódica in vitro de extractos crudos preparados con solventes de diferente polaridad (etanol, metanol, diclorometano, acetato de etilo y hexano), a partir de las plantas Piper tricuspe, Plantago major, Solanum nudum, Gliricidia sepium usadas en la medicina tradicional de Tumaco- Nariño, para el tratamiento de malaria y fiebre relacionada a esta y lo reportado por Blair et al 2005 en su libro plantas antimaláricas de Tumaco costa pacífica colombiana.
MÉTODO
Recolección y secado de las plantas
Tomando como base los saberes etnobotánicos de algunos curanderos de Tumaco-Nariño y según lo reportado por algunos autores [16,17,18,19], fueron seleccionadas cuatro especies de plantas; distribuidas en las siguientes familias botánicas: Fabaceae: Gliricidia sepium, Plantaginaceae: Plantago major, Piperaceae: Piper tricuspe, Solanaceae: Solanum nudum. Las cuales fueron recolectadas en el corregimiento de Tangareal (Latitud: 1.73333 Longitud: -78.5), zona rural del municipio de Tumaco-Nariño, Posteriormente, el material vegetal (hojas y tallos) fue sometido a un proceso de lavado y secado en horno a una temperatura de 40°C durante 48 horas, para luego ser molido con ayuda de una licuadora.
Preparación de extractos
Para la obtención de los extractos, se tomaron 20 g del material vegetal seco y molido y se sometieron a extracción por Soxhlet [20,21], durante cuatro horas, empleando 250 mL de solvente (etanol, metanol, Diclorometano, acetato de etilo y hexano), con el fin de garantizar la mayor extracción de todos los metabolitos de interés presentes en la planta. Posteriormente, se concentraron los diferentes extractos a presión reducida en un rotaevaporador para obtener cada uno de los extractos crudos; luego se procedió a rotular cada uno de los extractos obtenidos P. tricuspe (PT), P. major (PM) S. nudum (SN), G.sepium (GS1, GS2, GS3, GS4, GS5, GS).
Análisis cualitativo
Se hizo una marcha fitoquímica de los extractos por CPF (Cromatografía en Capa Fina), con fase estacionaria de silica gel 60 F254 Merck®. Las placas cromatográficas se eluyeron en diferentes sistemas de elusiones tales como (Diclorometano-Metanol 20:1, Diclorometano-Metanol 20:2, Hexano-Acetato de Etilo 7:3 y Hexano-Acetato de Etilo 9:1). Consecutivamente, las placas fueron reveladas con lámpara ultravioleta UVGL-58 a 254 nm y con el revelador universal (ácido sulfúrico, ácido acético y agua 50:30:20), reactivo Dragendorff y Yodo [22].
Para completar la detección de los metabolitos de los extractos, se realizaron pruebas cualitativas en tubos con Magnesio en limaduras y gotas de HCl, el cual nos permite la identificación de flavonoides, Cloruro férrico para la identificación de fenoles y reactivo Dragendorff el cual permite la identificación de alcaloides [23,24,25,26].
Evaluación in vitro de los extractos
Ensayos de citotoxicidad. Con el fin de evaluar la actividad citotòxica de los extractos, se utilizaron las células HepG2 las cuales son una de las líneas celulares más usadas para la evaluación de la citotoxicidad [27,28]. Estas células se cultivaron en medio DMEN (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12), suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado, mantenidas a 37°C y CO2 al 5% [29,30].
En cámara de Neubauer se contaron las células HepG2, y se procedió a su siembra en placas de 96 pozos de fondo plano (Falcon®) 200.000 células/mL, adicionando 100μL a cada pozo [31], haciendo uso de un control para cada uno de los ensayos. Para lo anterior se evaluó una concentración de 200 mg/mL de cada extracto, por duplicado, de la cual se realizaron diluciones seriadas.
Seguidamente, fue analizada la viabilidad celular siguiendo el método MTT (Este método se fundamenta en la reducción del bromuro 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio), descrito por (Mosmann, 1983) con algunas modificaciones [32,33]. El método MTT pretende medir células viables en relativo, observar su alto rendimiento (en placas 96); determinado de esta manera la citotoxicidad de medicamentos o extractos en varias concentraciones, además de la actividad mitocondrial de las células, convirtiendo el MTT en formaciones de cristales, la cual es una reacción de oxidación del MTT mediante la actividad metabólica que realiza la mitocondria [34].
Las placas microtituladoras de 96 pozos fueron medidas en un lector de Elisa, el cual expresa la cuantificación óptica de cada pozo; estas mediciones fueron usadas para determinar la CT50de los extractos.
En aras de clasificar la citotoxicidad de los extractos, el Grupo de Malaria de la Universidad de Antioquia estableció un consenso para las muestras evaluadas: altamente toxico ≤ 5, promisorio 6-15 µg/mL, moderadamente toxico 16-30 mg/mL, baja toxicidad 31-50 µg/mL y no toxico ≥ 50.
Actividad Antiplasmodial. La evaluación de la actividad antiplasmodial de los extractos fue efectuada in vitro con cepas 3D7 (sensible a cloroquina) y FCR3 (resistente a cloroquina) de Plasmodium falciparum, las cuales fueron mantenidas a un cultivo continuo a 37°C en una atmósfera de mezcla de gases de 5% de O2 6% de CO2 y N2 balanceado, según lo descrito por Trager W, et al 1976 [35], con algunas modificaciones [36,37].
Los ensayos para la actividad antiplasmodial de los extractos se realizaron en placas de 96 pozos de fondo plano (Falcon®), evaluándose una concentración 500 μg/mL para cada extracto por duplicado, realizándose así diluciones seriadas. A modo de control del ensayo se usó la Cloroquina a una concentración de 150nM para la cepa 3D7 y 2000 nM para la cepa FCR3. Una suspensión de glóbulos rojos parasitados fue preparada con un hematocrito del 2% y una parasitemia del 1%. Con adición final de 22 μL de hipoxántina radio marcada para cada placa [38,39]. En consecuencia, el cultivo con los tratamientos fue incubado a 37°C durante 48 horas en atmósfera de 5% CO2, 5% O2 y 90% de N2. Las placas de 96 pozos fueron congeladas a -20°C durante 14 horas, generando así la hemolisis de los eritrocitos. La lectura del ensayo se realizó mediante el contador de centelleo. En aras de clasificar la actividad antiplasmodial se considera lo siguiente, un extracto activo cuando la CI50 fuese <5 µg/mL, promisorio 6-15 µg/mL, moderadamente a [40], y modificación realizadas por el grupo Malaria.
Análisis estadístico. Los datos de absorbancia de la prueba de citotoxicidad, obtenidas por el lector de Elisa, se analizaron en una hoja de cálculo electrónico para la determinación de los porcentajes de toxicidad, y el programa GraphPadPrism TM, versión 5.01, para la determinación de la concentración toxica 50(CT50). Los datos arrojados por el contador de centelleo en la evaluación de la actividad antiplasmodial de igual forma se analizaron en una hoja de cálculo electrónico para la determinación de los porcentajes de inhibición, y el programa GraphPadPrism TM, versión 5.01, para la determinación de la concentración inhibitoria 50 (CI50).
RESULTADOS
Los resultados de la marcha fitoquímica indican la presencia de flavonoides en los extractos de las cuatro plantas estudiadas, presencia de compuestos fenolicos para P. tricuspe, S. nudum y G. sepium. En cuanto a la presencia de alcaloides, se presentó poca cantidad en P. major, para la especia P. tricuspe, en la cual se observó una abundancia de estos metabolitos (véase cuadro 1).
Con respecto a la citotoxicidad, los extractos etanólicos de P.tricuspe y S.nudum (PT y SN) presentaron una baja toxicidad de 41,74 y 32,18 mg/mL respectivamente, en la línea celular HepG2, según la clasificación dada por el grupo Malaria; los extractos de P. major y de G.cepium, no tuvieron actividad tóxica sobre la línea celular trabajada a las concentraciones evaluadas, los resultados de estos extractos no se evidencia en el cuadro, debido que los investigadores consideramos no son de relevancia. (Cuadro 2).
Por otro lado, al respecto de la actividad antiplasmódica resumida en el cuadro 3, se encontró que los extractos PT y SN tuvieron actividad antiplasmodial frente a P. falciparum en las dos cepas evaluadas (FCR3 Y 3D7), con una concentración inhibitoria cincuenta (CI50) de 24,41 y 16,59 mg/mL en la cepa FCR3. En la cepa 3D7 los extractos PT y SN tuvieron una CI50 de 27,1 y 23,26 y mg/mL respectivamente; mientras que los extractos PM, GS1, GS2, GS3, GS4, GS5 Y GS no presentaron actividad antiplasmodial en ninguna de las cepas trabajadas.
A estas plantas se les ha distinguido por su gran contenido de metabolitos secundarios, como lo representa la planta P.tricuspe de la familia Piperaceae. Las plantas de esta familia se distinguen por su gran contenido de alcaloides y se ha demostrado la actividad de la especie P. tricuspe contra Plasmodium, con una actividad relativamente alta en cepa FCB-1 de P. falciparum, con un IC5O de 1,37mΜ. De igual forma ya han sido caracterizados tres compuestos de dicha especie vegetal [41], cabe resaltar que este es tercer reporte para esta planta.
Para la especie estudiada en este estudio, el extracto de tallos y hojas presento actividad antiplasmodial frente a las cepas FCR3 Y 3D7 de P. falciparum, teniendo una modera actividad con CI50 de 24,41 27,1 mg/mL. Estudios realizados por Blair et al 2005 en su libro plantas antimalaricas de Tumaco: costa pacífica Colombiana reportó actividad antiplasmodial para P.Tricuspe, en ensayo in vitro con cepa (ITG-2) de P. falciparum.
Según lo revelan las investigaciones realizadas del grupo Malaria [42,43,44], la planta S.nudum ha sido altamente estudiada. Estudios químicos de esta especie han demostrado la presencia de esteroides, que son los metabolitos, responsables de la actividad antiplasmodial, dichos esteroides fueron evaluados sobre muestras clínicas de P falciparum [45].
Las nuevas observaciones efectuadas para este reporte revelan que el extracto de S. nudum se comporta de igual manera que la reportado por el grupo Malaria, obteniendo una CI50 de 16,59 y 23,26 mg/mL en cada una de las cepas, valores muy parecido a muchos de los aportes hechos por el grupo Malaria.
Plantago major y Gliricidia sepium fueron las plantas que no presentaron actividad antiplasmodial ninguna, aunque Carrillo et al, 2005 [15], informó que P. major posee flavonoides, esteroles, alcaloides, saponinas, mono-terpenoides, además de la actividad antiplasmodial parcial frente a P. berghei en ensayo in vivo en ratones; cabe resaltar que las concentraciones usadas por este autor, fueron altas en un rango de 500 a 1000 mg/kg, disminuyendo el crecimiento de los parásitos en un 46 y 39%; en las observaciones realizadas en el presente estudio P. major no presenta valores significativos de actividad antiplasmodial in vitro, ni actividad citotòxica; aunque se ha demostrado la actividad citotòxica de P. major en línea celular HepG2 con un CI50 de 174,42 a 496,14 mg/mL [46]. G,sepium de igual forma no presento actividad antimalárica y citotòxica, esta planta fue escogida para este estudio, debido a que muchas personas de Tumaco-Nariño la usan como remedio para el tratamiento del dengue, y así mismo lo reporta Ramírez et al, 2010 [17], con los habitantes de Tumaco que usan esta planta como remedio para esta enfermedad, de la cual se puede observar una disminución de los síntomas y del virus después de su uso; el uso de G. sepium en la investigación tenía como propósito observar si esta planta podría tener actividad antiplasmodial; en algunos análisis preliminares realizados por Blair et al, 1990, arrojó resultados positivos para alcaloides, flavonoides, de igual manera, estas pruebas fueron positivas para los extractos de G. sepium utilizados en este trabajo de investigación. Castro et al, 1996 [47], reporta actividad antiplasmodial de G.sepium contra P. berghei, de los extractos polares (acetato de etilo, alcohólicos acuosos), y de igual forma corrobora pruebas positivas para flavonoides y cumarinas. En las observaciones de este estudio se encontró que el extracto de acetato etilo (GS1) y ninguno de los otros extractos de G. sepium, no presentó actividad antiplasmodial in vitro.
CONCLUSIONES
De manera general se puede concluir que se obtuvo una modera actividad antiplasmodial y baja actividad citotòxica para los extractos de las especies evaluadas del genero Piper y Solanum. Dada la concentración inhibitoria 50 y la baja citotoxicidad de estas especies vegetales, se amerita seguir estudios fitoquímicos biodirigidos para la caracterización de sus componentes químicos. Con respecto a la planta P tricuspe, aunque se han realizado reportes de algunos compuestos químicos identificados en esta planta, se considera seguir realizando avances para la búsqueda de nuevas medicamentos antimalaricos. De igual forma, este estudio permitió validar los saberes etnobotánicos de las personas que usan estas plantas para sintomatología de la Malaria, lo cual permite investigar y promover la búsqueda de nuevos antipalúdicos a partir de los productos naturales.
